骨転移モデル

この手順の最終目的は、骨内で腫瘍細胞を増殖させ、それに続く骨破壊を誘導するように腫瘍細胞を注入することである。まず、腫瘍細胞を冷PBSで再懸濁し、氷上に置くことでこれを達成する。次に、適切な数の細胞を、麻酔下にあるマウスの左心室または脛骨に注入する。

その後、複数のイメージング技術を用いて、骨腫瘍の増殖および骨パラメータを縦断的にモニタリングします。最後に、腫瘍および骨パラメータのエンドポイント定量化を行います。最終的に、in vivoおよびex vivoの蛍光またはルミネッセンス、2D放射線撮影、3Dイメージングを組み合わせて評価します。

腫瘍の増大および骨微小環境における細胞レベルおよび成長構造レベルの変化を明らかにするために、マイクロCTと組織学が用いられます。これらの手法は、乳がんや前立腺がんの転移性コロニー形成を可能にする骨の要因は何かなど、がん転移分野における重要な疑問への回答に寄与します。細胞調製の実演は、私の研究室のリサーチアシスタントであるAlisa Merkelが行い、1週間未満で維持された細胞を使用します。

GFPタグ付きM-D-A-M-B 2 3 1クローンを、10% FBSおよび0.1 mg/mLのペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEMを用い、37 °C、5〜8% CO₂条件下で培養します。細胞が80〜90%コンフルエンスに達した時点で継代し、1:10に希釈して播種します。接種用の細胞を調製するため、80〜90%コンフルエンスに達した細胞を10 mLの0.15%トリプシン-EDTAでトリプシン処理します。

10% FBSを含む氷冷DMEMを用いて、直ちに細胞を50 mLコニカルチューブに移し、5分間遠心分離します。ペレットを50 mLコニカルチューブ内で、カルシウムおよびマグネシウムを含まない25 mLの氷冷PBSに再懸濁し、細胞数をカウントします。心内接種用に10⁶ cells/mL、および脛骨内注射用に250,000 cells/mLの濃度となるよう、氷冷PBSで細胞を再懸濁します。

これらの実験では、投与の5～10日前にTela 29 20 x飼料を投与した、4～6週齢の免疫不全雌マウスを使用します。チャンバー内で2.5% isof fluorineを用いてマウスを麻酔した後、換気フード内でノーズコーンに移行させ、マウスを仰向けに配置します。10% ポビドンヨード溶液で胸部を洗浄し、続いて70% Ethanolで洗浄します。

胸骨切痕と剣状突起上端の中間で、胸骨からわずかに左側に、マウスの胸部の注射部位をマークします。次に、300 µLの28ゲージ・1/2インチインスリン注射器を使用します。プランジャーと液面との間に隙間を作るため、少量の空気を吸引し、もう一方の手でマウスの皮膚を張った状態で、100 µLの細胞液を吸引します。

針を垂直に保ちながら挿入します。左心室に正しく挿入されると、シリンジ内に鮮やかな赤色の血液が脈動して現れます。この深さで、心臓を突き刺したり胸腔内に細胞を漏らしたりしないよう、針を大きく動かさないように注意しながら、シリンジのプランジャーを慎重に押し下げます。胸腔内への細胞の滴下を減らすため、プランジャーをわずかに引き上げ、少量の陰圧を作成してください。

次に、針を抜く際に傾けないよう注意しながら、胸部から垂直に引き抜きます。針を傾けると心膜を損傷し、出血の原因となる可能性があります。出血を抑えるため、注入部位を約1分間、軽く圧迫してください。ノーズコーンを外しながら、マウスが完全に覚醒するまでヒーティングパッドの上に移動させます。

脛骨内処置の直前に、マウスにブプレノルフィンを投与します。マウスを麻酔し、ノーズコーンに固定した後、両脚を10%ポビドンヨードで洗浄し、続いてエタノールを用いて指4本と親指で清拭します。

外果、内果、および脛骨の下半分をそっと掴みます。次に、膝が見え、アプローチしやすいように脚を曲げます。70% ethanolを用いて皮膚を湿らせ、下層にある膝蓋靭帯の視認性を高めます。足首をしっかりと掴んだ状態で、膝蓋靭帯がはっきりとした太い白い線として確認できるはずです。

28ゲージの1/2インチ針を、膝蓋骨靭帯の中央を通って膝蓋骨の下から、脛骨上端の内側顆間領域に挿入します。安定した強い圧力をかけ、わずかに回転させながら、成長板を慎重に貫通するように針を導きます。脛骨成長板を貫通すると、針への抵抗が著しく減少します。

針を緩やかに左右に動かし、針先が脛骨内にあり、かつ成長板を貫通していることを確認します。針が脛骨内の適切な位置にあれば、可動範囲が制限されます。プランジャーをゆっくりと押し下げ、10 µLの細胞懸濁液を注入します。

この時点で、抵抗はほとんど、あるいは全く感じられないはずです。その後、ゆっくりと針を抜きます。マウスを麻酔状態から脱し、回復するまでヒーティングパッドの上に置いてください。

週に2〜3回、マウスを観察します。麻酔をかけたマウスに対し、ルシフェラーゼ、GFP蛍光、X線などのさまざまなイメージング技術を用いて解析を行います。蛍光により腫瘍の部位が示されます。

病変部位を特定するためにエストロン（estron）スキャンを用います。これらの病変は、蛍光画像と相関します。イメージング技術に関する詳細は、本プロトコルの記述部分で確認してください。

注入後21日から35日後に、IACUC承認の方法でマウスを安楽死させ、骨を4%Formalinに保存します。単離した骨を用いて、micro CTおよびヘマトキシリンとDSN染色による組織形態学的解析（ex vivo解析）を行います。詳細は、「心腔内または脛骨内への腫瘍細胞接種」の後にある書面プロトコルをご参照ください。

マウスを、放射線撮影および蛍光または発光によって毎週モニタリングします。通常、X線では2週目から3週目の間に病変が明らかになります。ここに示すモデルによっては、早ければ2週目から蛍光および発光で確認できる場合もありますが、病変は骨内の暗い穴として可視化され、時間の経過とともにより顕著になります。病変は、放射線写真と蛍光画像のMetamorph解析を用いて定量化されました。

Maestroイメージング取得・解析ソフトウェアを用いて定量化しました。この図では、マイクロCT解析により骨量減少を定量化しています。マイクロCT測定による骨構造およびミネラルデータは、正常な骨と腫瘍を伴う骨の3D画像として表現されており、骨破壊領域が空隙として示されています。

その後、サンプルに対して組織形態計測を行い、腫瘍量および骨体積対組織体積（BV/TV）を決定しました。これらの手順を行う際は、忍耐強く取り組み、各マウスを慎重に配置し、個体を密接に観察することが重要です。もしマウスが死に始めた場合、それは細胞の凝集による可能性が高いため、直ちに新しい細胞を調製してください。

最も避けるべきことは、手順を急いだり、もどかしさを感じたりすることです。練習を重ね、時間をかけることで、次第に習熟し、効率的に行えるようになることを忘れないでください。これらの手法の開発により、がん研究者がin vivoで骨転移を研究するための道が開かれました。