Name: ヒト胎児脳から由来オリゴデンドロサイト前駆細胞培養システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: 学ぶヒト胎児脳由来神経前駆細胞からオリゴデンドロサイトへの分化プロトコル。支持細胞を必要とせず高純度のオリゴデンドロサイトを大量培養し、脱髄疾患やウイルス感染の研究モデルとして活用できます。

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この研究は、米国立衛生研究所（NIH）、NINDSにおける学内研究プログラムによってサポートされていました。著者は、編集を手伝って顕微鏡とパメラCのふるいで助けるために分子医学と神経科学、リック·ドレイファスの研​​究室のすべてのメンバーに感謝したいと思います。

注：神経前駆細胞とoligodendrocytic系統細胞の培養ルーチンについては、インキュベーションを37℃で加湿した5％CO 2雰囲気で行った。 2日毎に、培地は、培養40〜70％コンフルエントであれば、新鮮な培地の50〜100％を使用して置き換えられます。近くコンフルエントの時点では、培養は通常、毎週のスケジュール上で2-2.5e6/T75フラスコで継代されています。 1。コー​​ティングされたフラスコを準備<ol><li>コー​​トフラスコを準備するには、暗所で室温でPDLの50μg/ mlの（RT）でコートT75フラスコをその後、100mlの脱イオン水（脱イオン水）にポリ-D-リジン5mgの（PDL）を希釈してください。 1つの½時間後、PD​​Lを吸引し、DI水で一度フラスコをすすいでください。セル（ 表1）播種前に、乾いたフラスコましょう。 </li></ol> 2。前駆細胞由来のオリゴデンドロサイトへの神経前駆細胞の分化の開始（PDO） のプロトコルです以前の刊行物に記載されている人間の中枢神経系前駆細胞をオレート、それがこのプロトコル1の一部ではありません。人間の中枢神経系前駆細胞はNIHガイドラインに従って得られた8週間の妊娠胎児の脳の終脳から単離された。 <ol><li> 25 ng / mlのbFGFの、20 ng / mlの上皮増殖因子（EGF）（ 図1A）を補ったNeurobasal培地におけるPDL ​​コートフラスコ上の神経前駆細胞の多能集団を栽培しています。通路11（P11）よりも高い場合は、それらを使用しないでください。 </li><li>文化は約70％コンフルエントのとき神経前駆細胞を区別するために開始します。 </li><li>ウシ血清アルブミン、L-グルタミン、ゲンタマイシン、N2のコンポーネントは、T3に、Shh、NT-3は、bFGF、およびPDGF-AAを（ 表1）を補充した無血清DMEM / HAMS F12を1:1の培地を使用して完全な分化オリゴデンドロサイト培地を作る。この培地は、増殖因子（オリゴ培地+ GF）とオリゴ媒体として定義されます。 </li><li> PROGENを削除フラスコからデンサメディアは、で一度細胞をリンスリン酸緩衝食塩水（PBS）は、その後オリゴmediumを追加+ GFオリゴデンドロサイト分化を開始する（2.3で説明されるように詳細）。 oligodendrocytic系統にコミットした細胞のみが（ 図1B）成長していきます。 3週間この培地で細胞を培養。 </li><li>毎週、細胞が90〜95％のコンフルエンス、通路、それらをトリプシン（0.05％）-EDTA（0.1％）（T75フラスコのための4ミリリットル）を使用してであるとき。 50 mlコニカルチューブに継代される細胞から、媒体全体を転送し、この馴化培地はトリプシンをクエンチするために使用されます。細胞を乾燥しないようにしてください。その後トリプシンを追加します。 </li><li>優しく細胞の剥離を助けるためにフラスコを数回タップする、室温で5分間トリプシンで細胞をインキュベートします。 </li><li>デタッチされた細胞を用いたフラスコに馴化培地の4-5 mlを加えてトリプシンをいやす。 </li><li>培地と同じ50 mlコニカルチューブに細胞を移します。 1,200 rpmで（〜に培地と細胞を遠心室温で5分間、300×g）で。 </li><li>上清を吸引し、穏やかにチューブを転倒し、細胞ペレットを再懸濁し、その後新鮮なオリゴ培地+ GFを追加します。優しく均一な細胞懸濁液を作るには、上下の培地および細胞をピペット。 </li><li>セルをカウントし、各新しいPDLでコーティングされたT75フラスコに2.5e6を転送します。 </li></ol> 3。オリゴデンドロサイトの分化における最終ステップ<ol><li>オリゴ培地+ GF、細胞が70〜80％コンフルエントにある文化の3週間後、分化の最終工程（ 図1C）を起動します 。 </li><li> Shhは、NT-3、bFGFおよびPDGF-AA：オリゴ培地+ GFとしてではなく、4 GFを追加することなく、同じようにメディアを準備します。 GF - 4 GFなしでこの媒体はオリゴ媒体として定義されます。 </li><li>フラスコからオリゴ培地+ GFを吸引除去し、PBSで一回すすぎ、その後培地16ミリリットルの全容量を追加して、オリゴ媒体である¾（12ミリリットル）の - GFと¼（4ml）をPDN馴化培地である、のために6-10日）。 PDNからの馴化培地の使用は、分化過程に、または、細胞の生存に重要ではない。我々は実際には共培養実験のPDN細胞とPDOの唯一の直接接触はPDO生存の長さに影響を与えたことを観察した。オリゴ培地で生存期間 - PDOの細胞は、PDN細胞と共培養している場合はGFは2または3週間に延長することができます。 PDNにヒト神経前駆細胞を区別するためのプロトコルは、以前の刊行物に記載されており、このプロトコル1の一部ではありません。複数のプロセス（ 図1D）を持つ細胞の徐々に分化した培養における培地の結果から成長因子撤退。 </li></ol> 4。フローサイトメトリーアッセイフローサイトメトリーアッセイは、彼らの親の人口のものとの関係では、分化過程の間にオリゴデンドロサイトマーカーの取得を比較します。 <ol><li>神経Proを使用コントロールとしてgenitors。オリゴ培地+ GFのポリ-D-リジンで被覆した2 T75フラスコ中に2.5×10 6個の細胞でシードPDOの細胞。 </li><li> GF - 他のフラスコは、オリゴ媒体を持っていた一週間後、細胞の生存のための対照培養フラスコのように新鮮なオリゴ培地+ GFで培地を交換してください。 </li><li>両方のメディアにPDO細胞を解離させるためには20 U / mlのパパインおよびトリプシンを使用していない。パパインは、細胞の形態を維持解離中の細胞上の穏やかな効果を持っているためです。 </li><li>パパインバイアルにアールの平衡塩類溶液（EBSS）5mlを加える。 10分間またはパパインが完全に溶解し、溶液が透明に表示されるまで37℃でバイアルを置きます。これは、細胞を解離させるために使用されるパパインソリューションです。 </li><li>リボヌクレアーゼI（DNase処理）バイアル（ 表1）にEBSSの0.5 mlを加える。静かに混和します。溶解パパインのバイアルにこの溶液0.25mlを加える。この製剤は、約20 U / mlのパパインと0の最終濃度が含まれています0.005パーセントのDNase。 </li><li> 15〜30分間37℃でインキュベートした細胞の上に置いパパイン溶液（上記のように）;顕微鏡を用いて細胞の剥離を監視します。 7分間1200 rpmでGFと遠心の有無にかかわらず培地5mlで反応を停止します。 </li><li>二つの異なる5 mlのポリプロピレンチューブに両方のフラスコから細胞ペレットを転送し、通常の生理的媒体（NPM：145 mMのNaCl、5mMのKCl、1.8 mMのCaCl 2、10mMのHEPESおよび10mMグルコース）でそれらを洗って1 mg / mlのを補足したウシ血清アルブミン（NPM + BSA）。 </li><li>表面は4で免疫染色実行°GalC（ 表2）、A2B5、O4のために具体的かつ適切に滴定した一次抗体を用いて20分間インキュベートする。 </li><li> 5分間、4℃で、NPM + BSAで細胞を洗浄し、20分（ 表2）4℃で特異的な二次抗体を用いて、それらをインキュベートする。 </li><li>ネスチン、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）、クラスIIIとなるなど、細胞内抗原を染色するTA;-チューブリン、およびミエリン塩基性タンパク質（MBP）（ 表2）は 、室温で20分間、2％パラホルムアルデヒド（PFA）で細胞を固定し、-20℃で15分間冷70％エタノールで透過処理</li><li> 1×PBSで細胞を洗浄し、特定の二次抗体（ 表2）でインキュベートする。 </li><li>フローサイトメトリー分析の際に無傷の細胞および細胞内残骸を区別するために、4,6 - ジアミジノ-2 - phenyllindole、二塩酸塩（DAPI）（ライフ·テクノロジーズ、Grand Island、NY）を用いて細胞を染色します。 </li><li>上記のプロトコルを最適化する際に、我々はそれぞれの免疫試薬の特異性を確認するためにすべての適切な制御実験を行った。簡単に言えば、直接標識抗体について、適切な陰性対照は、一次抗体（ すなわち 、アイソタイプコントロール）と同じ免疫グロブリンアイソタイプクラス（またはサブクラス）と蛍光色素複合体の直接抱合抗体であった。一次抗体の間接免疫染色、適切なネガティブコントロールwの具体的に一次抗体が生成されたホストの免疫グロブリンクラス（またはそのサブクラス）を標的とし、目的の蛍光色素に共役二次抗体として。複数のホストから一次抗体（マウス、ウサギ、ニワトリ）が、我々は、各ホストの一次抗体を標的とする二次抗体を使用した、一緒に使用され、使用されるそれぞれの二次抗体は、一般的に最小化するために、他のホストからの免疫グロブリンに対するクロス吸着させたときにクロス宿主の免疫反応。ポジティブコントロールは、これらの抗原に特異的な一次抗体との直接的または間接的な免疫反応のいずれかを使用して、目的の抗原を発現することが知られている細胞調製物の直接的または間接的な免疫染色​​が含まれていた。上記の最適化の方法は、実験を免疫染色の種類ごとに一回行った。コントロール免疫反応は、一次抗体および二次抗体の間に有意クロスエピトープ免疫反応性がないことを明らかにした。フローサイトメトリーを用いて、均一について行ったFACVantage SEセルソーター（BD Biosciences社、サンノゼ、CA）を使用して、一時停止され、蛍光標識された細胞は、488nm、647 nm、および広範な紫外線（351から364 nm）を（ 図2）に同調励起波長を提供する3つのレーザーを装備。 </li></ol> 5。免疫蛍光検査法 注： - PDLでコーティングされた6ウェルプレートで2.5e5でGFの免疫蛍光実験では、PDOはオリゴ培地+ GFまたはオリゴ培地にプレーティングする。細胞は、成長因子の撤退後の様々な時点で2％PFAで固定されています。抗体染色は、プラスチック製6ウェルプレートの代わりにガラスカバースリップ上で実行されます。 <ol><li>メディアを取り出し、2％PFAを追加します。室温で10分間インキュベートする。 PFAを捨てる。 PBSで各5分間の時間で細胞を3回洗浄する。細胞を乾燥しないように注意してください。 </li><li>室温で10分間、PBS中の0.25％トリトン溶液を用いて、細胞内マーカーのために、細胞を透過。 </li><li>非特異的結合をブロック細胞を防止するために、FまたはHHG（1 mMのHEPES緩衝液、2％ウマ血清、ハンクス平衡塩溶液中で10％ヤギ血清）で10分。 HHGで予め決められた濃度になるように具体的な一次抗体を（ 表2）で希釈します。細胞に希釈した抗体を置きます。シェーカー上または4℃で一晩、室温で1時間インキュベートします。 </li><li> 5分毎に時間のために、PBSで細胞を3回洗浄します。 HHGで予め決められた濃度に蛍光色素と結合し、適切な二次抗体を（ 表2）で希釈します。細胞に希釈した二次抗体の混合物を置きます。暗闇の中でシェーカー上で室温で1時間インキュベートします。 </li><li> 5分毎に時間のために、PBSで細胞を3回洗浄します。 </li><li>退色を避けるために細胞にDAPIで金を延長し、それらの上にカバーガラスを配置し、10μlを添加する。 AXIOVERT 200M蛍光顕微鏡（ツァイス、ソーンウッド、ニューヨーク州）（ 図3）を用いて標識した細胞を可視化します。 </li></ol>

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特別な利害関係は宣言されません。

このプロトコルは、初代ヒト神経前駆細胞から胎児オリゴデンドロサイトを導出し、フローサイトメトリーと免疫蛍光染色の両方を使用して、その表現型を特徴付ける方法について説明します。胎児の中枢神経系から神経前駆細胞の拡大と成長は非常によく、1から4に記載されている。しかし、in vitro の実験で 、人間のために十分なオリゴデンドロサイトを得ることは、それが成人のヒト白質5月13日からのグリア前駆細胞を同定および単離することが可能であるにもかかわらず、依然として困難である。オリゴデンドロサイトを14から21を産生するミエリンに胎児の神経前駆細胞の分化を誘導するために様々な培養条件の開発で異なった試みがなされてきた。このプロトコルは、トン、選択成長因子（PDGF-AAは、bFGFに、Shh、およびNT-3）を補充した無血清培地で3週間生育させたときに-04マーカー（ 図2）を発現するネスチン陽性神経前駆細胞をさらに詳...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> DME / HAMS F12の1時01分</td><td>オメガ·サイエンティスト</td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td>ウシアルブミン</td><td>シグマ</td><td> A9418 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>質バイオ</td><td> 120-098-031 </td><td> 50μg/ mlの</td></tr><tr><td> L-グルタミン</td><td>質バイオ</td><td> 118-084-061 </td><td> 2mMの</td></tr><tr><td> T3 </td><td>シグマ</td><td> T2877 </td><td> 3nMの</td></tr><tr><td> N2のコンポーネント</td><td> Gibco BRL社</td><td> 17502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td>ぺプロテック株式会社</td><td> 450から03 </td><td> 2 ng / mlの</td></tr><tr><td>しゃべるな</td><td> R＆Dのシステム</td><td> 1314-SH/CF </td><td> 2 ng / mlの</td></tr><tr><td> bFGFの</td><td>ぺプロテック株式会社</td><td> 100-18B </td><td> 20 ng / mlの</td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td>ぺプロテック株式会社</td><td> 100-13A </td><td> 10 ng / mlの</td></tr><tr><td> PDL </td><td>シグマ</td><td> P6407 </td><td> 50μgの/ mの</td></tr><tr><td> PFA </td><td>電子顕微鏡学</td><td> 15712 </td><td>二パーセント</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>質バイオ</td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td>パパイン</td><td>ワージントン</td><td> LK003178 </td><td> 20 U / mlの</td></tr><tr><td> DNaseをバイアル</td><td>ワージントン</td><td> LK003172 </td><td> 0.005パーセント</td></tr><tr><td> EBSS </td><td>ワージントン</td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td>ゴールドを長引かせる ととも​​にDAPI </td><td>インビトロジェン</td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1試薬。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> プライマリABS（全1μg/ mlの時） </td><td></td><td> 種のアイソタイプ </td><td> ソース </td><td> 二次腹筋 </td></tr><tr><td colspan="5"> フローサイトメトリー </td></tr><tr><td> A2B5-ビオチン</td><td>マウス</td><td> IgM抗体</td><td>ギフトJ.ニールソン</td><td>ストレプトアビジンPETR、Invitrogen社、カリフォルニア州</td></tr><tr><td> O4FITC </td><td>マウス</td><td> IgM抗体</td><td> J.ニールソンからの贈り物</td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td>マウス</td><td> IgM抗体</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαmのIgM-FITC、Invitrogen社、カリフォルニア州</td></tr><tr><td> O4 </td><td>マウス</td><td> IgM抗体</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαmのIgM-FITC、Invitrogen社、カリフォルニア州</td></tr><tr><td> GalC </td><td>マウス</td><td> IgGの3 </td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαmIgGの3-PE、サザンバイオテック、アラバマ</td></tr><tr><td> MBP </td><td>チキン</td><td> IgYの</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> dαckIgYの-AMCA、ジャクソンIMMU。、ペンシルバニア</td></tr><tr><td>ネスチン</td><td>マウス</td><td> IgG 1の </td><td> Messam ら 2000 28 </td><td> gαmのIgG 1-PECy5、Invitrogen社、カリフォルニア州</td></tr><tr><td> GFAP </td><td>ウサギ</td><td> IgG抗体</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαrbたIgG-PEジャクソンIMMU、ペンシルバニア</td></tr><tr><td> βIIIチューブリン</td><td>マウス</td><td> IgGの2 </td><td> Covance、カリフォルニア州</td><td> gαmIgGの2のa-PETR、Invitrogen社、カリフォルニア州</td></tr><tr><td colspan="6"> 免疫細胞化学 </td></tr><tr><td> βIIIチューブリン （1:1,500） </td><td>マウス</td><td>のIgG 2A </td><td> Covance、カリフォルニア州</td><td> gαmのIgG 2A-FITC、Invitrogen社、カリフォルニア州 （1:1,000） </td></tr><tr><td> GFAP （1:1,000） </td><td>ウサギ</td><td> IgG抗体</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαrbのIgG-FITC、ジャクソンIMMU、ペンシルバニア （1:500） </td></tr><tr><td> MBP （1:50） </td><td>チキン</td><td> IgYの</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> dαckIgYの-FITC、ジャクソンIMMU、ペンシルバニア （1:100） </td></tr><tr><td> O4 （1:100） </td><td>マウス</td><td> IgM抗体</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαmのIgM-AF546、Invitrogen社、カリフォルニア州 （1：100） </td></tr><tr><td> GalC （1:10） </td><td>ウサギ</td><td> IgG抗体</td><td>ミリポア、マサチューセッツ州</td><td> gαmのIgM-AF750、Invitrogen社、カリフォルニア州 （1:100） </td></tr></tbody></table> 。フローサイトメトリーおよび免疫アッセイのために使用される表2抗体（腹筋） のconjugate抗体：PE、フィコエリトリン、PETR、フィコエリトリンテキサスレッド、AMCA、アミノメチルクマリン-アセテート; Cyは、シアニン、FITC、フルオレセインイソチオシアネートのIg：免疫グロブリン。 。AF：のAlexa Fluor;gαm：ヤギ抗マウス;gαrb：ヤギ抗ウサギ;dαck：ロバ抗ニワトリ。 </td></tr></tbody></table>

ヒト胎児脳から由来オリゴデンドロサイト前駆細胞培養システム

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

神経細胞とグリア細胞型へのヒト神経前駆細胞の分化は、神経細胞系譜開発の分子調節を研究し、比較するためのモデルを提供しています胎児の中枢神経系組織からの神経前駆細胞の in vitro での展開では 、十分に特徴付けされています。種々の培養条件の成人ヒト皮質下白質と開発からオリゴデンドロサイトを産生するミエリンに胎児の神経前駆細胞の分化に直接グリア前駆細胞の同定および単離にもかかわらず、in vitroの実験で 、人間のために十分なオリゴデンドロサイトを獲得することは依然として困難である。ガラクトセレブロシドの分化+（GalC）及びO4 +神経前駆細胞からのオリゴデンドロサイト前駆体または前駆細胞（OPC）の妊娠中期胎児の脳を使用して報告されている。しかしながら、これらの細胞はアストロサイトとニューロンを含む支持細胞の非存在下で増殖しないし、文化の中で時間をかけて迅速に失われる。必要性は 、in vitro の実験で適したオリゴデンドロサイト系譜の細胞を産生する培養システムのために残してあります。 初代ヒトオリゴデンドロサイトの培養は、例えば、 生体内でそれらの細胞に感染し、ヒトポリオーマウイルス、JCVのような神経親和性感染因子の病因を研究するための有用なモデルである可能性があります。これらの培養細胞は、中枢神経系（CNS）の他の脱髄疾患のモデルを提供することができます。神経細胞（前駆細胞由来のニューロンは、PDN）とアストロサイトに分化する能力を維持しながら、プライマリ、ヒト胎児脳由来、多能性神経前駆細胞をin vitro で増殖（前駆細胞由来アストロサイト、PDA）、本研究では、神経前駆細胞を誘導できることを示していますoligodendrocytic系統の発展段階（前駆由来オリゴデンドロサイトは、PDO）の多くを介して区別することができます。 DMEM-F12無血清培地中で私たちの文化の神経前駆細胞はsup塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、血小板由来増殖因子（PDGF-AA）、ソニックヘッジホッグ（Shh）、神経栄養因子（NT-3）、N-2とトリヨードサイロニン（T3）とで可能です。培養細胞は、およそ7日ごとに75センチメートルフラスコあたり2.5e6細胞で継代されています。これらの条件を用いて、培養中の細胞の大多数は少数のプロセスとそのようなA2B5およびO-4などの事前オリゴデンドロサイト細胞の急行マーカーによって特徴形態を維持。我々は4つの成長因子（GF）（bFGFは、PDGF-AA、Shhを、NT-3）を削除し、PDNからの馴化培地を追加すると、細胞は、GalCおよびミエリンなどのオリゴデンドロサイト分化の特定の複数のプロセスおよびエクスプレスマーカーを取得するために開始塩基性タンパク質（MBP）。我々は、オリゴデンドロサイトのユニークなマーカーを同定するために多色フローサイトメトリーを用いて表現型の特性評価を行った。

それは70％-80％コンフルエント神経前駆細胞培養（ 図1A）から分化プロセスを開始することが非常に重要です。多くの細胞は、それが特定の成長因子が含まれているため、前駆細胞からオリゴ培地に培地を変更した後に消えてしまうでしょう。これはoligodendrocytic表現型にコミットされていない神経前駆細胞の増殖は新しい媒体（ 図1B）によってサポートされないことを示します。一週間オリゴ培地+ GFのインキュベーションは、狭い、バイポーラの形態を（ 図1B）を示す中間の文化をもたらした。細胞はオリゴ培地+ 3-4週間（ 図1C）のGFに保存されています。培養培地から増殖因子の撤退は、複数のプロセス（ 図1D）で細胞の分化した徐々に文化をもたらした。フローサイトメトリーは、データの定量的な表現のために使用されます。 図2A、2唯一の小さな亜集団は、アストロサイトマーカーGFAP（ <...

プライマリ、ヒト胎児脳由来、多能性前駆細胞は増殖<em&gt; in vitroで</em&gt;ニューロンおよびアストロサイトに分化する能力を維持しています。この作品は、神経前駆細胞がselect増殖因子とコンディショニングによってoligodendrocytic系統の段階を経て分化誘導することができることを示しています。

ヒト神経前駆細胞をニューロンおよびグリア細胞へと分化させることは、神経細胞系譜の発達における分子調節を研究し、比較するためのモデルとなります。胎児の中枢神経系（CNS）組織からの神経前駆細胞のin vitroにおける増殖については、十分に特性解析が行われています。成人のヒト皮質下白質からグリア前駆細胞が同定・単離され、また胎児神経前駆細胞を髄鞘形成オリゴデンドロサイトへと分化誘導するための様々な培養条件が開発されてきましたが、in vitroでの実験に十分な量のヒトオリゴデンドロサイトを得ることは依然として困難です。妊娠第2三半期の胎児脳を用いて、神経前駆細胞からガラクトセレブロシド陽性（GalC+）およびO4陽性のオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）を分化させることが報告されています。しかし、これらの細胞はアストロサイトやニューロンを含む支持細胞が存在しない環境では増殖せず、培養中に急速に消失します。そのため、in vitro実験に適したオリゴデンドロサイト系譜の細胞を産生できる培養システムが依然として求められています。例えば、ヒト原代オリゴデンドロサイトの培養は、in vivoでこれらの細胞に感染するヒトポリオーマウイルス（JCV）のような向神経性感染因子の病原性を研究するための有用なモデルとなり得ます。また、これらの培養細胞は、中枢神経系（CNS）における他の脱髄疾患のモデルとしても活用できる可能性があります。ヒト胎児脳由来の原代多能性神経前駆細胞は、in vitroで増殖しながら、ニューロン（前駆細胞由来ニューロン、PDN）およびアストロサイト（前駆細胞由来アストロサイト、PDA）へと分化する能力を維持します。本研究では、神経前駆細胞がオリゴデンドロサイト系譜の発達の多くの段階を経て分化誘導され得ること（前駆細胞由来オリゴデンドロサイト、PDO）を示します。我々は、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、血小板由来増殖因子（PDGF-AA）、Sonic hedgehog（Shh）、神経栄養因子3（NT-3）、N-2、およびトリヨードチロニン（T3）を添加したDMEM-F12無血清培地で神経前駆細胞を培養します。培養細胞は約7日ごとに、75cm²フラスコあたり2.5×10⁶個で継代します。これらの条件下では、培養細胞の大部分が突起の少ない形態を維持し、A2B5やO-4などの前オリゴデンドロサイト細胞のマーカーを発現します。4つの増殖因子（GF）（bFGF、PDGF-AA、Shh、NT-3）を除去し、PDNの条件化培地を添加すると、細胞はより多くの突起を持ち始め、GalCや髄鞘塩基性タンパク質（MBP）などのオリゴデンドロサイト分化に特異的なマーカーを発現します。我々は、多色フローサイトメトリーを用いて表現型解析を行い、オリゴデンドロサイトの固有のマーカーを同定しました。

このビデオでは、ヒト胎児由来の一次神経前駆細胞をオリゴデンドロサイトへ分化させる手法を実演します。まず、神経前駆細胞を前駆細胞用培地でほぼコンフルエントになるまで培養します。次に、分化プロセスを促進する成長因子を添加したオリゴデンドロサイト用培地へと交換します。その後、細胞を3週間培養し、拡大させます。次に、成長因子を添加したオリゴデンドロサイト培地を、成長因子の含まないオリゴデンドロサイト培地に交換し、顕微鏡で表現型の変化が観察されるまで、さらに6〜10日間培養します。その後、オリゴデンドロサイト系特異的な抗体を用いた免疫蛍光顕微鏡観察およびフローサイトメトリーによって、分化を確認します。最終的に、正常に分化したオリゴデンドロサイトは、オリゴデンドロサイトの生物学的な研究や、ヒトポリオーマウイルス（JCV）などの感染剤との相互作用に関するin vitro研究に使用できます。既刊の文献にある手法と比較して、当研究室で確立した手法の真の利点の一つは、アストロサイトやニューロンなどの支持細胞を必要とせずに、オリゴデンドロサイトを培養および分化させることができる点にあります。また、本プロトコルのもう一つの利点は、O4などのマーカーを発現する前駆オリゴデンドロサイトを大量に培養することが可能であると考えています。これらの細胞は、表現型を維持したまま、数週間にわたって大量の細胞集団として培養することが可能です。分化の結果、ほぼ純粋なオリゴデンドロサイトの集団を得ることができます。私たちは、ラットおよびマウス細胞におけるオリゴデンドロサイトのin vitro分化に関する広範な文献を読んだ際に、この手法の着想を得ました。また、異なる研究者が細胞の分化を完結させるために、限定的な培養系から成長因子を除去していました。本プロトコルを用いたこの手順の実演は、ここN-I-N-D-Sの当研究室の学部生であるAlexa Bandonが行います。分化の準備として、BFGFおよびEGFを添加した神経基底培地を用い、ポリリジンコートしたフラスコ中で多能性神経前駆細胞群を培養し、不要な細胞は廃棄します。培養が約70～80%コンフルエントになった時点で、分化を開始させます。そのためには、フラスコから前駆細胞用培地を吸引して除去します。細胞をPBSで1回洗浄し、成長因子を含むoligo mediumを12 milliliters添加します。加湿された5%carbon dioxideインキュベーター内で、37 degrees Celsiusで細胞を培養します。1週間後、生存している細胞は細長い双極性の形態を示すようになります。分化した細胞が少なくとも70%コンフルエントになったら、培地を除去し、新しい50 milliliterコニカルチューブに移します。回収した条件付き培地は、後で使用するために保管しておきます。次に、0.05%trypsin, 0.1%EDTAを4 milliliters迅速に細胞に加え、室温で5分間インキュベートします。フラスコを数回軽く叩き、細胞の剥離を促進させます。インキュベーション後、保存しておいたコンディショニング培地を4～5 mLフラスコに加えて、トリプシンを失活させます。次に、培地と細胞を50 mLコニカルチューブに戻します。次に、培地と細胞を室温で310 RCFで7分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、上清を吸引して取り除きます。チューブを軽く叩いて細胞ペレットを再懸濁し、成長因子を含む新鮮なoligo mediumを添加します。培地と細胞をピペットで穏やかに混ぜ合わせ、均一な細胞懸濁液を作成します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。次に、250万個の細胞を新しいポリリジンコートT 75フラスコに移し、インキュベーター内で培養します。3週間後、細胞が80〜85%コンフルエントに達した時点で、増殖因子を含むオリゴ培地をフラスコから吸引除去します。PBSで1回洗浄し、成長因子を含まないoligo mediumを12 millilitersと、progenitor derived neuron unconditioned mediumを4 milliliters加えます。この培地を用いて、1日おきに6～10日間細胞を維持します。位相差顕微鏡で細胞を観察し、分化状態とコンフルエンシーを確認し、成長因子を除去した後、培地の少なくとも50%を交換してください。細胞に次第に複数の突起が形成されれば、progenitor derived oligodendrocytesへの分化が成功したことを示しています。この時点で、前駆細胞由来のオリゴデンドロサイトを、本ビデオの以降のセクションで説明するフローサイトメトリーまたは免疫蛍光実験に使用できます。フローサイトメトリーアッセイでは、分化過程におけるオリゴデンドロサイトマーカーの獲得を、親細胞集団のものと比較します。コントロールとしてヒト神経前駆細胞を使用します。ポリリシンでコーティングした2本のT 75フラスコに、成長因子を含むoligo培地を用いて、前駆細胞由来オリゴデンドロサイト細胞を各2.5 million個ずつ播種し、37 °Cのインキュベーターで培養します。1週間後、細胞生存率のコントロールとして、一方のフラスコの培地を成長因子を含む新鮮なoligo培地に交換します。2つ目のフラスコの培地を、成長因子を含まない新鮮なオリゴデンドロサイト用培地に交換します。これらの細胞を最大10日間培養します。成長因子を除去してから3〜9日後になると、細胞はオリゴデンドロサイトの表現型に特有の突起をより多く形成し始めます。前駆細胞由来のオリゴデンドロサイト細胞を分散させるため、培地を吸引し、各フラスコに5.25 millilitersのperian溶液を加えます。解離時の細胞への影響がより緩やかなため、トリプシンの代わりにPerianを使用します。細胞の形態を維持するため、37 °Cで15～30分間インキュベートします。顕微鏡を用いて、細胞が剥離しているか定期的に確認してください。細胞を剥離させた後、反応を停止させるために、成長因子を含むか、あるいは含まない培地を5 mL加えます。次に、各フラスコの内容物を15 mLのコニカルチューブに移します。室温で310 RCF、7分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、1 mg/mLの牛血清アルブミンを添加した通常の生理的培地（NPM + BSA）4 mLで細胞ペレットを再懸濁します。その後、前述と同様に細胞数をカウントし、各免疫染色の条件につき1 million cellsを5 mLのポリプロピレンチューブに分注します。各免疫試薬の特異性を確認するために、適切なコントロールをすべて含めるようにしてください。次に、免疫染色を行うため、まず細胞を表面タンパク質であるA2B5、O4、およびGal Cに対する抗体とともにインキュベートします。その後、細胞を洗浄して未結合の一次抗体を除去し、適切な蛍光色素標識二次抗体とともにインキュベートします。次に、二次抗体を洗浄するために細胞を再度洗浄します。2%パラアルデヒドで固定し、冷えた70%エタノールで透過処理を行った後、細胞内タンパク質を染色するため、細胞を洗浄し、nestin、glial fibrillary acidic protein、class three beta tubulin、およびmyelin basic proteinに対する抗体とともにインキュベートします。その後、結合していない一次抗体を洗浄して除きます。細胞を適切な蛍光色素標識二次抗体とともにインキュベートします。最後に、フローサイトメトリー解析において生存細胞と細胞内デブリを区別するため、細胞を4-6 DIA medino、2 phenol Lind dihydrochlorideまたはDAPIで染色し、488 nm、647 nmおよび広帯域UVの励起波長を備えた3波長レーザー搭載の装置を用いてフローサイトメトリーを行います。免疫蛍光顕微鏡観察の準備として、ポリ-D-リシンコートしたスライドガラスを用意します。1ウェルあたり250,000個の前駆細胞由来オリゴデンドロサイトを播種した6ウェルプレートを用意する。各タイムポイントにつき2枚のプレートが必要である。細胞が70～80%コンフルエントに達した時点で、1枚は成長因子を加えて培養し、もう1枚は成長因子なしで培養する。プレートから成長因子を含む培地を吸引して除去します。PBSで1回洗浄し、成長因子を含まない培地を12 mL添加します。成長因子の除去から5日後および9日後に、以下の手順で免疫染色を行います。まず、2% PFAを用いて室温で10分間、細胞を固定します。次に、PFAを除去し、PBSで細胞を3回、各5分間洗浄します。続いて、0.25% Tritonで細胞を処理し、非特異的結合を防ぐために2%馬血清および10%ヤギ血清で細胞をブロッキングします。ブロッキング後、beta three tubulin、G-F-A-P-M-V-P oh four、およびgal Cに対する抗体で細胞をインキュベートします。その後、結合していない抗体を細胞から洗浄し、適切な蛍光標識二次抗体で細胞をインキュベートします。細胞から未結合の二次抗体を洗浄し、その後、光退色と脱色を防ぎます。核を封入します。10 µLのProlong Gold（DAPI含有）を用いてカバーガラスを固定します。適切なフィルターセットを備えた蛍光顕微鏡を用いて標識細胞を可視化し、ヒト初代神経前駆細胞がオリゴデンドロサイトに分化するかどうかを判定します。多能性神経前駆細胞は、本ビデオで説明した方法で培養しました。その後、表現型の変化をフローサイトメトリーおよび免疫蛍光顕微鏡によりモニタリングしました。ここで見られるように、神経前駆細胞の大部分は神経上皮幹細胞マーカーであるnestinを発現していますが、GFAPなどのアストロサイトマーカー、class three beta tubulinなどのニューロンマーカー、またはoligo 4などのオリゴデンドロサイトマーカーといった系統制限的なマーカーを発現しているのは、ごく一部のサブポピュレーションのみです。培地を成長因子添加oligo mediumに交換して1週間培養したところ、2週間後にはnestinの発現が減少し、A2B5の発現が増加することが観察されました。ネスチンの発現はさらに減少し、神経膠前駆細胞マーカーであるA2B5の発現が増加しました。成長因子の除去から2日後には、別のオリゴデンドロサイトマーカーであるO4の発現も増加しました。成長因子の除去から6日後には、O4およびオリゴデンドロサイト後期マーカーであるGAL Cの発現が増加しました。O4とGAL Cの共発現が増加し、GAL CとMBPの共発現と同程度になりました。多エピトープ免疫染色の結果、培養細胞の72%がMBPを発現していることが明らかになりました。前駆細胞由来のオリゴデンドロサイト分化のさらなる証拠は、免疫蛍光アッセイを用いて特性評価されました。成長因子を除去して2日後、緑色で示されるMVPの発現が検出されました。これは5日目に増加し、9日目にはさらに増加しました。分化したオリゴデンドロサイトにおけるMVPの局在が明確に認められます。以上の結果から、記載した方法を用いて培養したヒト胎児神経前駆細胞は、オリゴデンドロサイト系統の各段階に分化する能力を維持したまま、in vitroで増殖可能であることが示されました。本プロトコルの開発により、発生生物学、神経科学、ウイルス学の分野の研究者が、ヒトの脳の生物学的特性およびヒトの脳に影響を及ぼす疾患、特に白質疾患を引き起こす疾患について調査することが可能になります。

progenitor-derived-oligodendrocyte-culture-system-from-human-fetal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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E13マウスからグリア制限前駆体の導出

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共同培養実験のためのオリゴデンドロサイト及びオリゴデンドロサイト条件培地の生成

提示されたプロトコルは、低分子化合物の神経突起成長アッセイおよび神経毒性評価のための方法を記述する。...

神経前駆細胞由来ニューロンを用いた神経突起増殖アッセイと神経毒性評価

神経変性におけるニューロンとグリアの相互作用は、ツールや方法が不十分なため、よく理解されていません。ここでは、ヒト多能性幹細胞から誘導されたニューロン、希突起膠細胞前駆細胞、および希突起膠細胞を取得するための最適化されたプロトコルについて説明し、アルツハイマー病における細胞種特異的な寄与を理解する上でのこれらの方法の価値の例を提供します。...

多能性幹細胞からのヒト神経細胞および希突起膠細胞の作製によるニューロン-希突起膠細胞相互作用のモデル化

成熟したオリゴデンドロサイトに分化する胎児または成体の神経幹細胞に由来するアストロサイトとオリゴデンドロサイト前駆細胞の混合培養の生成と、有害刺激のインビトロモデリングについて述べています。細胞ベースの高含有スクリーニング技術との結合は信頼でき、強い薬物スクリーニングシステムを造る。...

胎児および成人神経幹細胞由来オリゴデンドロビテ前駆細胞培養の高含有スクリーニング分化と成熟解析

私たちは、人工多能性幹細胞(iPSC)由来の造血前駆細胞(HPC)をオルガノイド開発に組み込むことにより、常在性ミクログリアを持つヒト脳オルガノイドを生成するプロトコルを提示します。...

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学ぶヒト胎児脳由来神経前駆細胞からオリゴデンドロサイトへの分化プロトコル。支持細胞を必要とせず高純度のオリゴデンドロサイトを大量培養し、脱髄疾患やウイルス感染の研究モデルとして活用できます。

ヒト胎児脳から由来オリゴデンドロサイト前駆細胞培養システム

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