電気化学センサを用いた細菌検出＆識別

次の実験の全体的な目標は、電気化学センサーを使用して細菌を検出し、識別することです。これは、まず細菌からリボソームRNAを放出してフッ素化検出器プローブとのハイブリダイゼーションを可能にすることによって達成され、第2のステップとして、検出器プローブに結合したリボソームRNAが作用電極に追加され、センサー表面上のキャプチャプローブとのハイブリダイゼーションが可能になります。次に、抗フルオレセインホースダイコンワサビペルオキシダーゼコンジュゲートをフッ素化検出器プローブに結合させます。

最後に、その強度が捕捉プローブリボソームの数と相関する干渉電流では、センサー表面上のRNA検出器プローブ複合体を得ることができる。この技術が培養ベースの方法と比較した場合の主な利点は、細菌を約45分で検出および同定できるため、夜間の重量を回避できることです。細菌がEDGARプレート上に目に見えるコロニーを形成するために この技術を適用すると、感染症の管理が改善されます。

細菌性病原体の早期発見は、標的抗菌薬治療と臨床転帰の改善に不可欠です。この方法は感染症の診断に役立ちますが、免疫診断などの他の診断問題にも適用できます。まず、拡張したキャプチャープローブをヘキサンジチオールと室温で10分間インキュベートして、キャプチャープローブ上のチオール基が減少し、より一貫した結果が得られることを確認します。

インキュベーション後、窒素の流れを印加して金を産む。16個のセンサーアレイチップを5秒間使用して水分や微粒子を除去し、少量の液体をセンサーアレイの作用電極に慎重に塗布する必要があります。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。

ピペッティング、洗浄、乾燥技術を適切に実行することで、チップ間のばらつきが大幅に減少します。次に、センサーアレイの16個のセンサーすべての作用電極に6マイクロリットルのHDT拡張キャプチャプローブミックスを塗布し、センサーチップを摂氏4度の蓋付きシャーレに翌日一晩保存し、センサーチップを脱イオン水で2〜3秒間洗浄し、次に窒素の流れの下でチップを5秒間乾燥させます。次に、6マイクロリットルの塩酸ナトリウムナトリウム、EDTA MERCAPTOETHANOL溶液を16個のセンサーすべての作用電極に適用し、室温のペトリ皿で50分間センサーをインキュベー

電気化学センサーアッセイ用のサンプルを調製します。成長の対数期にある1ミリリットルの細菌培養物をマイクロ遠心チューブに移し、次いで細胞を16, 000 gで5分間遠心分離する。病原菌はバイオセーフティフードで取り扱ってください。

スナットを取り除いた後、10マイクロリットルの1モル水酸化ナトリウムが入ったピペットチップをマイクロ遠心チューブの底に当て、数回上下にピペットしてペレットを完全に再懸濁します。懸濁液を室温で5分間インキュベートした後、ウシ血清アルブミンまたはBSAを含む50マイクロリットルのPBSとフルオレセイン修飾検出器プローブを加えて、細菌溶解物を中和します。次に、中和したライセートを室温で10分間インキュベートします。

このステップは、調製したセンサーチップの1つからメルカプトエタノール溶液を脱イオン水で2〜3秒間洗浄することから始めます。先ほど示したようにチップを乾燥させた後、中和したバクテリアライセートを4マイクロリットルの作用電極に塗布します。センサーの14。

次に、PBSとBSAとフルオレセイン修飾検出器プローブの4マイクロリットルの架橋オリゴヌクレオチドを2つのポジティブコントロールセンサーに適用します。次に、ライセートとポジティブコントロールセンサーを15分間インキュベートした後、前回と同様にセンサーチップ全体を洗浄してから乾燥させます。次に、カゼインを含むPBS中の抗フルオレセインホースラディスプレーペルオキシダーゼまたはHRPを4マイクロリットルのセンサーすべての16個の作用電極に適用します。

15分間のインキュベーション後、センサーチップを洗浄して乾燥させます。次に、センサーチップの表面にフィルムウェルステッカーを貼り、チップをセンサーチップマウントピペットに50マイクロリットルのTMB基板を16個のセンサーすべてにロードし、センサーチップマウントを閉じます。最後に、Heliosチップリーダーを使用して、16個のセンサーすべてのパイロメトリーとサイクリックテレメトリー測定を取得します。

今述べた電気化学アッセイは、サンドイッチと同様に構成され、Elizaは、この図に示すように、ターゲットリボソーム、キャプチャおよび検出器プローブとのRNAハイブリダイゼーションは、検出器プローブ上の3本の松フルオレセイン結合に結合する抗フルオレセイン抗体フラグメントに結合したHRPによって触媒される酸化還元反応によって開発される。アッセイ感度の重要な要素は、金電極の表面化学です。金電極はメルカプトエタノールとハインオールでコーティングされており、拡張したキャプチャプローブを添加することで官能基化されています。

標的リボソームRNAを捕捉プローブおよびフルオレセイン標識検出器プローブとサンドイッチハイブリダイゼーションすると、抗フルオレセイン、ワサビ、ペルオキシダーゼコンジュゲート、およびTMB基質を添加して検出される複合体が得られます。Mパラメトリック電流は、西洋ワサビペルオキシダーゼによるTMBの酸化と電極からの電子によるTMBの還元から生じる酸化還元サイクルによって生成されます。ここで示すアッセイは、遺伝子流体16センサーアレイチップを採用しています。

アレイ内の各センサーには、ワーキングリファレンスと補助の3つの電極が含まれており、チップの端に接点があります。チップリーダーには、各接点に接続するポゴピンがあります。チップリーダーは、コンピューターアルゴリズムによって制御されるポテンショメータを備えたセンサーアレイのインターフェースとして機能します。

ここでは、電気化学センサの電流流の一例を示す。センサー内の電流の流れは、パラメトリック測定が開始されてから最初の数秒間、センサー内で人為的に高くなります。TMBをセンサー表面に塗布してからリーダーアルゴリズムを開始するまでの時間の間に酸化した基板が蓄積するため、電流の流れはすぐに定常状態に達し、正確なセンサーの読み取り値を60秒以内に確実に得ることができます。

センサー間の変動性は比較的一定であるため、遺伝子流体上で16の異なるセンサーアッセイを並行して実行することが可能であり、16センサーアレイチップのポジティブコントロールとネガティブコントロールはポジティブコントロールとして不可欠です。このように、キャプチャープローブと検出器プローブの両方にハイブリダイズし、既知の濃度の合成ターゲットとして機能する合成架橋DNAオリゴヌクレオチドが使用されます。この結果は、チップ間のばらつきを最小限に抑えるための内部キャリブレーション制御としてブリッジングオリゴヌクレオチド機能を使用して得られました。

電極の負電流が大きいほど、信号は高くなります。キャプチャープローブと検出器プローブをテストする場合。検出限界は、この図に示すように、既知の濃度のサンプルの段階希釈によって決定されるべきであり、サンプル濃度とアッセイのダイナミックレンジにわたる信号出力との間には線形の対数対数相関があります。

これらの棒グラフでは、尿路感染症患者の尿中に多く見られる大腸菌やクレブシールを含むサンプルとアンモニアを含むサンプルの代表結果が示されており、ほとんどのセンサーの信号は低く類似しており、KEプローブペアによるバックグラウンドシグナル反応性がキヤノンと大腸菌を区別するため、これらの陰性結果をプールできます。架橋オリゴヌクレオチドは、ポジティブコントロールおよび内部キャリブレーション標準として機能します。この技術は、抗生物質に対する細菌の表現型反応を測定することにより、臨床検体中の抗生物質耐性菌の検出に適用することができます。

この手法は、個々の患者に最適な治療法を決定するために利用できます。このビデオを見た後、チップ内のさまざまな種固有のセンサーの心電電流を比較することにより、細菌を検出および識別する方法を十分に理解できるはずです。