Name: 電気化学センサを用いた細菌検出＆識別 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶ電気化学センサを用いた細菌検出法。リボソームRNAを標的としたハイブリダイゼーションにより、約45分で細菌を迅速に検出・同定できます。従来の培養法に比べ時間を大幅に短縮し、感染症管理の改善に貢献します。

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本研究では、アレルギーと国立感染症研究所からと小児泌尿器科研究の卓越性のためのウェンディとケンルビー基金協力協定賞AI075565（DAHに）によってサポートされていました。 BMCは、小児泌尿器科でジュディスとロバート·ウィンストンの椅子です。

1。電気化学センサーの機能化<ol><li> 300μMの1,6 - ヘキサン（HDT）、10mMのトリス-HCl、pH8.0、0.3 MのNaCl、1mMのEDTA、10分間、室温で暗所でインキュベートにおいて0.05​​μMの濃度でチオール化捕捉プローブを準備。 HDTを有するチオール化捕獲プローブのインキュベーションは、より一貫性のある結果をもたらし、捕捉プローブのチオール基が低減されることを保証する。 </li><li>水分および/または粒子を除去するために5秒間裸金16センサアレイチップ（複数可）に窒素気流を適用する。 </li><li> HDT-チオール捕捉プローブの6μlのセンサアレイのすべての16のセンサーの作用電極に混合し、4℃で一晩カバーペトリ皿にセンサーチップ（s）を保存し適用します。チオール捕捉プローブは、裸の金電極に直接結合し、HDTは、捕捉プローブの過剰充填防止し、それらの目標とのハイブリダイゼーションを促進し、拡張コンフォメーションを保つように作用する。 </li><li>ザ翌日、5秒間、窒素気流下で2〜3秒で乾燥し、脱イオンH 2 Oとセンサチップを洗う。 </li><li> 10mMのトリス-HCl、pH8.0、0.3 MのNaCl、1mMのEDTA、1mMの全てのセンサ16と50分間インキュベート作用電極に6 - メルカプト-1 - ヘキサノール（MCH）6μlのを適用する。これ以降のすべてのセンサチップインキュベーションを室温で覆われたペトリ皿で​​行われる。 MCHは、チオール捕捉プローブまたはHDTは、電極表面上に存在しない任意のギャップを埋める、ブロッキング剤として機能します。 </li></ol> 2。試料調製<ol><li> 5分間16,000 xgで遠心チューブと遠心分離機に成長の対数期（≈0.1 OD 600）で細菌培養液1mlを転送します。培養上清を取り除きます。細菌ペレットを直ちに処理または-80°C、後で使用するために保存することができる。 </li><li>徹底的にボットにピペットチップを適用することにより、1MのNaOH10μlに細菌ペレットを再懸濁マイクロチューブのトムと数回ピペッティング。 5分間室温で懸濁液をインキュベートする。 </li><li>ウシ血清アルブミン（BSA）およびフルオレセイン変性検出プローブの0.25mMの2.5％を含有し、pHが7.2、1 Mリン酸緩衝液50μlを添加して細菌溶解物を中和する。室温で10分間中和された溶解物をインキュベートする。フルオレセイン変性検出プローブは、細菌リボソームRNA標的分子とハイブリダイズする。 </li></ol> 3。電気化学センサーアッセイ<ol><li> 5秒のために、窒素気流下2-3秒、乾燥のために脱イオンH 2 OとのセンサーチップからMCHを洗ってください。 </li><li> 14センサーのそれぞれの作用電極に中和細菌溶解4μlのを適用し、15分間インキュベートする。標的検出プローブ複合体は、固定されたチオール化捕獲プローブにハイブリダイズする。 </li><li> 2.5％BSAおよび0.25＆を含む1Mのリン酸緩衝液中でオリゴヌクレオチドを​​ブリッジ1nmの4μlを、pHが7.2を適用μ、Mフルオレセイン変性検出プローブ2陽性対照センサ（信号正規に使用される）と15分間インキュベートする。 </li><li> 5秒のために、窒素気流下2-3秒、乾燥のために脱イオンH 2 Oとセンサチップを洗ってください。 </li><li> 15分間のすべての16のセンサーとインキュベートの作用電極に0.5％カゼインを含む1 Mリン酸緩衝液で0.5 U / mlの抗フルオレセイン-HRP4μlの、pHが7.2を適用します。抗フルオレセイン-HRPは、固定化されたフルオレセイン修飾された検出プローブに結合する。 </li><li> 5秒のために、窒素気流下2-3秒、乾燥のために脱イオンH 2 Oとセンサチップを洗ってください。 </li><li>センサーチップマウントにセンサチップと負荷の表面によくフィルムステッカーを適用します。全16センサーへのTMB基質のピペットを50μlとセンサチップマウントを閉じます。 </li><li>ヘリオスチップリーダーを使用しているすべての16センサー用アンペロメトリーとサイクリックボルタンメトリー測定値を得る。電流測定電流は、TMB、rの速度に比例しているセンサー表面に析出（ 図1参照）。 </li></ol>

<ol><li>Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ternary+Surface+Monolayers+for+Ultrasensitive+%28Zeptomole%29+Amperometric+Detection+of+Nucleic+Acid+Hybridization+without+Signal+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification.</a> Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).</li>
<li>Halford, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Antimicrobial+Susceptibility+Testing+by+Sensitive+Detection+of+Precursor+Ribosomal+RNA+Using+a+Novel+Electrochemical+Biosensing+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).</li>
<li>Campuzano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ternary+monolayers+as+DNA+recognition+interfaces+for+direct+and+sensitive+electrochemical+detection+in+untreated+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples.</a> Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).</li>
<li>Gau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+molecular+analysis+without+nucleic+acid+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification.</a> Methods. 37, 73-83 (2005).</li>
<li>Patel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+Specific+Capture+Enhances+Sensitivity+of+Electrochemical+Detection+of+Bacterial+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).</li>
<li>Mastali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+probe+length+and+target+location+for+electrochemical+detection+of+selected+uropathogens+at+ambient+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature.</a> J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).</li>
<li>Liao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electrochemical+DNA+biosensors+for+rapid+molecular+identification+of+uropathogens+in+clinical+urine+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).</li>
<li>Liao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+advanced+electrochemical+DNA+biosensor+for+bacterial+pathogen+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection.</a> J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).</li>
<li>Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroanalytical+sensors+and+devices+for+multiplexed+detection+of+foodborne+pathogen+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms.</a> Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).</li>
<li>Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+disposable+nucleic+acid+biosensors+for+direct+bioelectronic+detection+in+raw+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples.</a> Talanta. 85, 1330-1337 (2011).</li>
<li>Ecker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibis+T5000%3A+a+universal+biosensor+approach+for+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).</li>
<li>Casalta, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+LightCycler+SeptiFast+test+in+the+rapid+etiologic+diagnostic+of+infectious+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).</li>
</ol>

すべての著者は説明した方法に関連する特許に関する発明である。これらの特許の一つはQvella株式会社にライセンス供与されています。 BMCとDAHはQvella株式会社の持分を持っている。 VGは、電気化学センサアレイチップのメーカーですGeneFluidicsの社長、チップマウント、そして本稿で述べたチップリーダーです。

ここで説明する電気化学センサアッセイは、核酸標的の迅速な検出を可能にする。感度および特異性は、順番に長さ及び捕捉および検出プローブのGC含有量に依存するターゲットプローブハイブリダイゼーションの自由エネルギーに部分的に依存する。我々は一般的に、周囲温度（〜20℃）5、6でのハイブリダイゼーションの手順を実行します。チップを含有する被覆チャンバ内に配置されれば、ハイブリダイゼーション工程（3.2および3.3）もまた、ハイブリダイゼーションオーブンでより高い温度で行うことができる蒸発7,8を防止するためにろ紙を湿らせた。最適な信号は、ハイブリダイゼーション部位8の間に隙間なく核酸標的上の隣接部位にハイブリダイズキャプチャ検出プローブ対が得られる。このシグナル増強がスタッキング塩基対によってと &quot;ヘルパープローブ&quot;の効果として知られている隣接する領域のハイブリダイゼーションのアクセシビリティを、増加させることにより動作するように考えられている。キャプチャ検出確率隣接したサイトへの電子ハイブリダイゼーションのrRNAターゲット5の断片の中...

細菌の検出および同定のための標的分子としてのrRNAを使用すると、多くの利点を有する。細菌細胞内のrRNAの存在量が標的増幅1を必要とせずにミリリットルあたり250バクテリアの低感度限界のために用意されています。細菌のリボソームRNAは、DNAプローブとのハイブリダイゼーションにアクセス可能なユニークな種特異的な配列を含む。これにより、電気化学センサのアレイは、各センサが異なる種特異的捕捉プローブで官能化されている未知の細菌を同定するために用いることができる。ポジティブコントロールセンサーは、 &quot;ブリッジ&quot;捕捉および検出プローブが内部校正信号を作成するために合成オリゴヌクレオチド標的のために含まれるべきである。 電気化学センサーは、基本的な研究および翻訳の幅広い用途を有する。例えば、ここに記載されたアッセイを正確E.の効果を測定するために使用されているRRN上の大腸菌増殖期細菌の生理学2に興味を持って研究者に大きな関心であると事前rRNAのコピー数、。電気化学センサアッセイの感度は、信号対雑音比によって決定される。信号増幅及びノイズ低減の様々な方法が検討されている。私たちは、センサー表面の化学的性質を改善することは検出プローブおよび/またはHRP酵素の非特異的結合を減少させるための鍵であることがわかります。特に、アルカンジチオール及びメルカプトヘキサノールとの混合単分子膜は、標的ハイブリダイゼーション3に対して捕捉プローブのアクセス可能性を保持しながらより完全に電極表面を被覆することによってバックグラウンドを低減することが見出された。これらの表面化学処理は、複雑な生物学的サンプルを伴うアッセイのために特に重要である。

<table><tbody><tr><td>6-メルカプト-1-ヘキサノール (MCH)</td><td>Sigma</td><td>451088</td><td>室温で保存</td></tr><tr><td>1,6-ヘキサンジチオール (HDT)</td><td>Sigma</td><td>H-12005</td><td>室温で保存</td></tr><tr><td>チオール化キャプチャプローブ</td><td>Operon</td><td>N/A</td><td>0.1x TE中で 100 &amp;mu;M として -20 &amp;deg;C で保存</td></tr><tr><td>フルオレセイン修飾検出プローブ</td><td>Operon</td><td>N/A</td><td>0.1x TE中で 100 &amp;mu;M として -20 &amp;deg;C で保存</td></tr><tr><td>ブリッジングオリゴヌクレオチド</td><td>Operon</td><td>N/A</td><td>0.1x TE中で 100 &amp;mu;M として -20 &amp;deg;C で保存</td></tr><tr><td>抗フルオレセイン-HRP, Fabフラグメント</td><td>Roche</td><td>11 426 346 910</td><td>4 &amp;deg;C で保存</td></tr><tr><td>Heliosチップリーダー</td><td>GeneFluidics</td><td>GFR-2009</td><td></td></tr><tr><td>センサーチップマウント</td><td>GeneFluidics</td><td>GFR-003</td><td></td></tr><tr><td>フィルムウェルステッカー</td><td>GeneFluidics</td><td></td><td>センサーチップに同梱</td></tr><tr><td>ベアゴールド16センサーアレイチップ</td><td>GeneFluidics</td><td>SC1000-16X-B</td><td>100% N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;中で室温保存</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>4 &amp;deg;C で保存</td></tr><tr><td>1M リン酸緩衝液, pH 7.2</td><td></td><td></td><td>0.35M NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.65M K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7.2に調整</td></tr><tr><td>PBS中ブロッキング用カゼイン</td><td>Pierce</td><td>37528</td><td>等量の1M リン酸緩衝液 (pH 7.2) で希釈し、4 &amp;deg;C で保存</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表1. 試薬および機器&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

電気化学センサを用いた細菌検出＆識別

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

電気化学センサが広く血糖の迅速かつ正確な測定のために使用され、検体の多種多様な検出のために適合させることができる。電気化学センサは、有用な電気信号に生体認識イベントに形質導入​​することによって動作する。シグナル伝達は、電流測定電極に酸化還元酵素の活性を結合することによって起こる。センサの特異性は、酵素の固有の特性、グルコースセンサの場合、グルコースオキシダーゼ、又は酵素及び抗体又はプローブ間のリンケージの積である。 ここでは、直接細菌を検出し、識別するための電気化学センサの測定方法を説明する。いずれの場合も、ここで説明するプローブは、DNAオリゴヌクレオチドである。この方法は、標的リボソームRNA（rRNAの）とキャプチャーと検出プローブのサンドイッチハイブリダイゼーションに基づいています。検出プローブがhに連結されている間に捕捉プローブは、センサー表面に固定されているorseradishペルオキシダーゼ（HRP）。例えば、3,3 &#39;、5,5&#39; - テトラメチルベンジジン（TMB）などの基板は、その表面に結合した捕捉対象検出器複合体を有する電極に追加されると、基板は、HRPにより酸化され、作用電極によって低減される。電極で電流の流れを作り出す、電極からHRPに基板による電子の往復でこの酸化還元サイクル結果。

私たちは、サンドイッチELISAと同様に構成されている電気化学的測定法について説明します。 図1に示すように、捕捉および検出プローブと標的リボソームRNA（rRNAの）ハイブリダイゼーションを検出プローブ上の3 &#39;フルオレセイン結合に結合する抗フルオレセイン抗体フラグメントに結合したHRPにより触媒される酸化還元反応によって開発されている。分析感度の重要な構成要素は、金電極の表面の化学的性質である。我々は、チオール化捕捉プローブ、メルカプトヘキサノール、及びヘキサンからなる三元系単分子層が著しくレポータータンパク3の結合非特異的バックグラウンドを減少させることによって信号対雑音比を改善することを見出した。アッセイは、 図2に示すGeneFluidics 16センサアレイチップを採用してここで説明する。アレイ内の各センサは、3つの電極、仕事、基準、及びチップ4の縁に接触点を有する補助を含んでいる。チップの読み取り小胞体は、接触点のそれぞれと接続するポゴピンを有する。チップリーダーはコンピュータアルゴリズムによって制御ポテ...

我々は、迅速な菌の検出および同定のための電気化学センサの測定方法を説明する。アッセイは、リボソームRNA（rRNAの）種特異的配列のためのDNAオリゴヌクレオチド捕捉プローブで官能化されたセンサアレイを含む。捕捉プローブと西洋ワサビペルオキシダーゼ連動DNAオリゴヌクレオチドの検出プローブでターゲットのrRNAのサンドイッチハイブリダイゼーションは、測定電流測定電流を生成する。

電気化学センサは、血糖値の迅速かつ正確な測定に広く利用されており、また多種多様な物質の検出にも応用可能です。

本実験の全体的な目的は、電気化学センサーを用いて細菌を検出および同定することである。まず、細菌からリボソームRNAを遊離させてフッ素化検出プローブとのハイブリダイゼーションを可能にし、次に、検出プローブが結合したリボソームRNAを作動電極に添加することで、センサー表面の捕捉プローブとのハイブリダイゼーションを行わせる。その後、抗フルオレセイン horseradish peroxidase 複合体を、フッ素化検出プローブに結合させる。最終的に、センサー表面上のキャプチャープローブ・リボソームRNA検出プローブ複合体の数に相関する干渉電流の強度を得ることができます。培養法に対するこの手法の主な利点は、細菌を約45分で検出および同定でき、EDGARプレート上で細菌が目に見えるコロニーを形成するまでの一晩の待機時間を回避できることです。この手法の応用は、感染症の管理を改善させるでしょう。細菌性病原体の早期検出は、標的を絞った抗菌薬治療および臨床転帰の改善にとって不可欠です。この手法は感染症の診断に有用であるだけでなく、免疫診断などの他の診断上の課題にも適用可能です。まず、キャプチャープローブのチオール基が確実に還元され、結果の再現性が高まるように、希釈したキャプチャープローブをヘキサンジチオールとともに室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、窒素気流を金センサアレイチップに5秒間当て、水分や微粒子を除去します。センサアレイの作用電極には、少量の液体を慎重に滴下する必要があります。この手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。ピペッティング、洗浄、および乾燥の手技を適切に行うことで、チップ間のばらつきを大幅に低減できます。次に、HDT希釈キャプチャープローブ混合液 6 µLを、センサーアレイの全16個のセンサーの作用電極に滴下し、センサーチップをカバー付きペトリ皿に入れ、4 °Cで一晩保存します。翌日、センサーチップを脱イオン水で2～3秒間洗浄し、その後、窒素気流下で5秒間乾燥させます。続いて、attri hydrochloride sodium chloride, EDTA MERCAPTOETHANOL溶液 6 µLを全16個のセンサーの作用電極に滴下し、ペトリ皿を用いて室温で50分間インキュベートします。電気化学センサーアッセイ用の試料を調製します。対数増殖期の細菌培養液 1 mL をマイクロ遠心チューブに移し、16,000 ×g で 5 分間遠心分離します。なお、病原性細菌はバイオセーフティフード内で取り扱ってください。スナップキャップを取り外した後、1 M 水酸化ナトリウム 10 µL を含むピペットチップをマイクロ遠心チューブの底部に当て、数回ピペッティングしてペレットを完全に再懸濁させます。懸濁液を室温で5分間インキュベートし

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Research

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