用ピギーバックMultibarrel電極の製造と使用薬理マニピュレーション

本手順の目的は、神経活動を同時に記録しながら、脳内のマイクロ回路に薬理学的薬剤をイオン透過的に投与することです。まず、単一細胞記録用のシングルバレルガラス電極を作製し、先端を曲げます。また、マルチバレルガラス電極を作製し、先端を目的の直径まで破断させます。

2つの電極の組み立てに進みます。最終的に、作製された電極は細胞外in vivo記録に使用され、必要に応じて薬理学的薬剤を投与することで神経マイクロ回路を操作することが可能です。こんにちは、私はDr. Achim Kluです。本日は私たちの研究室が、ピギーバック・マルチバレル電極の作製方法をご紹介します。

これらの電極を用いて、ニューロンの微小環境にニューロンアゴニスト（作動薬）やアンタゴニスト（拮抗薬）をイオノフォアさせ、それによって生体内のニューロン回路を操作することができます。こんにちは、An Zillow博士です。私はAh him Crow博士の研究室のポストドクターで、本日はその手順を実演します。シングルバレル電極の場合、フィラメント入りのシングルバレルガラスキャピラリーを使用し、先端の直径を約1～2 µm、シャフト長を10～12 mmになるまでプルしてください。

抽出した電極を3 Mの塩化ナトリウム溶液で満たし、0.9%生理食塩水中で標準的なΩメーターを用いてテストすることで、電極の抵抗値を随時確認します。電極を塩溶液で満たすと、溶液がすぐに乾燥して電極が使用不能になるため、このテストのみを行ってください。

ピギーバック作製に使用しない電極をいくつか準備します。完全なマルチバレル電極を作成するには、ガラス管を引いて、先端の全径が約10 µm以下になるようにピペットチップ状に成形してください。適切に引かれたチップを持つ電極が、成功の鍵となります。

チップは細長いだけでなく、適切な直径に容易に折断できるよう、適度な剛性を保持している必要があります。チップの正確な直径への調整は次のステップで行うため、プーリング工程においては、正確なチップサイズよりも、電極チップが細長く、相対的に細いという全体的な形状の方が重要になります。

次に、シングルバレル電極を約45度の角度で保持し、先端を下に向けた状態で、炎の中を比較的速く動かします。電極先端から約10 mm離れた遷移領域のガラスを炎で溶かし、約20度曲がるように調整してください。マルチバレル電極をガラススライド上の模型用粘土の上に配置し、顕微鏡ステージに挿入します。

スライドホルダー 顕微鏡ステージのXYマニピュレーターを使用して、電極の先端をプレキシガラス片にそっと押し当てます。顕微鏡の接眼レンズを通して、チップが破断するのを確認します。電極アセンブリのセットアップをここに示します。

マルチバレル電極を、顕微鏡ステージ上のガラススライドで固定します。一方、シングルバレル電極は手動マルチ軸マニピュレーターで保持し、これによりユーザーはシングルバレルピペットを非常に高い精度でマルチバレルピペット上に降ろすことができます。シングルバレル電極を、5本のバレル配置によって形成されたマルチバレル電極の溝に直接降ろし、その先端がマルチバレルチップの先端から約 5 to 10 µm 突出するように調整します。

シアノアクリレートを用いて、2本の電極のシャフトを接着します。チップから最も遠い位置から開始し、接着剤をつけた爪楊枝を電極シャフトに沿ってチップ方向へゆっくりと動かします。電極チップに近すぎる位置に接着剤を塗布すると、チップが詰まり、電極が部分的または完全に機能しなくなるため注意してください。

少量の歯科用セメントを混合します。約15分間乾燥させます。その後、完成したピギーバック電極を慎重に取り出します。

まずマイクロマニピュレーターホルダーから取り外し、次にガラススライドから取り外します。電極を使用する直前に、各バレルをそれぞれの薬剤でバックフィルする準備をします。5バレルの構成のうち、外側の4つのバレルを任意の4種類の薬剤で満たし、中心のバレルをバランスバレルとして3 Mの塩化ナトリウムで満たします。

次に、シングルバレル記録電極に3 Mの塩化ナトリウムを満たします。ここで、イオン導入ポンプモジュールをオンにし、すべてのバレルをテストします。各ポンプモジュールの電極テスト機能により、電極バレルが深部脳記録に使用可能であるかを確認できます。

シングルバレル記録電極と共に組み立てられた完成後の5バレル電極は、約7 mmの長いシャフトを有しています。イオン導入法では、グリシン受容体拮抗薬などの薬剤を用いてグリシン抑制を遮断するために、いくつかのシナプス作動薬および拮抗薬が一般的に使用されます。Trick nine hydrochlorideは、通常、ニューロンの発火頻度を増加させます。

このサンプルデータは、聴覚ニューロンの放電率対強度関数を測定したものであり、動物の耳に提示された強度の増大する正弦波音刺激に対する反応を示しています。厳格なナインを適用する前は、音が大きくなるにつれてスパイク率が高くなりました。ニューロンの率-強度関数は、低いスパイク率を示しています。

15 nano ampsの初期イオン導入電流を印加すると、放出電流がわずかに増加します。放出電流を段階的に高くすると、ニューロンのグリシン受容体が段階的に多く遮断され、その結果、発火頻度が段階的に上昇します。45 nano ampsの電流では、そのニューロンのすべてのグリシン受容体がstrychnine hydrochlorideによって遮断されたと考えられます。

吐出電流をさらに増加させ、より厳格な条件で放出しても、さらなる変化は見られませんでした。イオン導入終了後のニューロンの発火率レベル関数において、神経応答がベースラインまで完全に回復するには約25分かかります。この回復プロセスは、吐出された薬物の種類と量に依存します。

薬剤は記録部位の周辺に拡散し、隣接するニューロンの受容体も遮断する可能性があることに留意することが重要です。このビデオを視聴することで、記録電極とマルチバレル薬剤投与電極を組み合わせ、低ノイズの深部脳記録を行う方法と、最大4種類の薬理学的薬剤を時間制御して投与する方法について、十分に理解できるはずです。