鳴禽類における聴覚刺激と機能的磁気共鳴画像法（fMRI）

本手順の全体的な目的は、機能的MRIを用いて、ソングバードの脳における聴覚および歌制御領域での音の知覚と処理を正常に可視化するための最適化されたプロトコルを実証することです。これはまず、機能的MRI（fMRI）スキャニング中に鳥に提示するためのオン・オフ・ブロックパラダイムに組み込める、高品質な聴覚刺激を準備することによって達成されます。次のステップでは、まず麻酔を施し、次に適応させた動物用ベッドに配置して、その後MRIスキャナーのボア内に設置することで、スキャニングに向けた鳥の準備を行います。次に、聴覚刺激中のfMRI画像を取得します。

最終ステップは、取得したMRIデータのプリプロセスであり、これにはゼブラフィンチアトラスへの画像正規化が含まれます。最終的に、統計的なボクセルベース解析を用いて、得られた結果を可視化し、聴覚刺激によって誘発された脳活性化部位を特定します。電気生理学、組織学、分子マッピングなどのタイヨウチョ類の研究で一般的に用いられる他の手法に対するこの手法の主な利点は、fMRIが非侵襲的なin vivo手法であることです。これにより、同一の個体を経時的に研究することが可能になり、また、調査対象のプロセスに関与する神経基質の局在に関する事前の仮説を立てることなく、脳全体を一度に解析することができます。

この手法に不慣れな方は、鳥類への機能的MRIの適用がヒトやげっ歯類への適用とは大きく異なり、はるかに困難であるため、苦労するかもしれません。これは、対象となる鳥類の脳が小さいことだけでなく、頭蓋骨に多数の空洞があり、それが磁化率アーチファクトを誘発することに起因します。傾斜磁場シーケンスに比べてこれらのアーチファクトの影響を受けにくいスピンエコーシーケンスを用いることで、ソングバードの全脳機能イメージングを非常に高い空間特異性で実現することが可能です。なお、スキャナーのボアは狭い空間であるため、聴覚刺激が歪む可能性があります。

したがって、本プロトコルの準備を始めるには、ファイバー optic マイクロホンを用いて 7 T MR システムのボア内で再生される音刺激を録音し、使用する MRI システムにおける歪みを確認します。ここでは、スキャナーの外と磁石ボア内の鳥の頭部の位置で録音されたホワイトノイズにより、強調された周波数と抑制された周波数が示されています。この人工的な強調を補正するために、提示された設定に基づき、wave lab ソフトウェアを用いて各刺激にイコライザー機能を適用します。

このプロトコルでは、関数は画面に表示されているパラメータを持つガウスカーネルで構成されています。ここでは、歌の刺激は、特定の鳥のいくつかの個別の歌のモチーフと、そこに挟まれた無音期間で構成される必要があります。すべての刺激において、音と無音の合計時間が同一になるよう、これらの無音期間の長さを調整してください。各刺激の総時間は16秒であり、これは2枚のfMRI画像の収集時間に相当します。

完全な刺激セットに統合する前に、調製用ソフトウェアを使用して、各楽曲の強度を整合された二乗平均平方根（RMS）に基づいて正規化し、400 hertzのハイパスフィルターを適用します。実験は、プレゼンテーション用ソフトウェアを用い、聴覚刺激期間と安静期間を交互に繰り返すオン・オフ・ブロックデザインで設計できます。各ブロックは、2枚の画像の撮像時間に相当する16秒間とし、各刺激タイプを25回ずつ提示することで、刺激および被験者ごとに50枚の画像を撮像します。

条件の提示順序は、被験者内および被験者間でランダム化する必要があります。また、スキャナーからのトリガーを受信できるように実験パラダイムを設定してください。これにより、fMRIシーケンス内の各リピティションでスキャンが行われる際、スキャナーソフトウェアが聴覚提示ソフトウェアにトリガーを送信し、ソフトウェア側でスキャン番号を登録して対応するコマンドを実行することが保証されます。

ここでは、成鳥のキンカチョウに使用して特に適したプロトコルを紹介します。キンカチョウは、12時間の明期と12時間の暗期からなる光周期の下で鳥籠内で飼育し、研究期間中は自由摂取で餌と水を提供してください。1回の実験あたりの最小個体数は15羽です。

この数値は、スピンエコーfMRIの感度および、実験で測定される生物学的現象の個体間における自然な変動を考慮したものです。実験の準備として、まずプラスチックチューブを用いて嘴マスクをガスコントローラー装置に接続し、7 T MRシステムのMRIベッドに設置します。酸素および窒素のガスボトルを両方とも開き、ガスコントローラー装置の電源を入れます。

また、フィードバック制御システムと温風装置の電源を入れます。次に、ゼブラフィンチの嘴をマスクに入れ、鳥が完全に麻酔されるまで頭部を固定し、酸素と窒素の混合ガス中に3% isof fluorine を導入して麻酔をかけます。麻酔の状態は、足先を軽く引くことで確認できます。

鳥が完全に鎮静化すると、足を引き込まなくなります。また、鳥の目は閉じます。実験期間中の体温を測定するために総排泄腔温度プローブを挿入し、呼吸数をモニタリングするために腹部の下に空気圧センサーを配置します。

次に、実験の間、鳥の体を固定するためにジャケットを装着させます。呼吸数を毎分40～100回の範囲内に維持し、体温を40°Cで一定に保ちます。呼吸数が低すぎる、または高すぎる場合は、それに応じて麻酔レベルを調整してください。

問題が解消されない場合は、実験を中止し、動物を装置から取り出してください。回復させるために、ゼブラフィンチの頭部の両側に非磁性ダイナミックスピーカーを配置し、アンプに接続します。スピーカーの配線が温度プローブから離れていることを確認してください。配線が近いと、温度の読み取り値に影響を及ぼす可能性があります。

距離が近すぎる場合は、表面RFコイルをキンカチョウの頭部の上に配置します。次に、キンカチョウをマグネットの中心に設置します。最後に、スキャン前に麻酔レベルを1.5%ISO fluorineまで下げます。

スキャンを開始するために、まず磁石内における脳の位置を決定します。矢状面、水平面、および冠状面において、シングルスライス勾配エコー・スカウト画像を1セット取得し、さらに後の機能的スキャンのポジショニングに使用するマルチスライス・スカウト画像を取得します。次に、ランプ時間を1000 microsecondsに増やすことで、勾配のノイズを低減させます。

次に、Rapid Acquisition Relaxation Enhanced（一般にRARE T2強調fMRIとして知られる）シーケンスを準備します。そして、脳全体をほぼカバーするように、矢状断方向のスライスを15枚設定します。次に、プレゼンテーションソフトウェアで聴覚プロトコルを選択し、聴覚プレゼンテーションソフトウェアがスキャナーからのトリガーを見逃さないようにします。

まず、聴覚プロトコルを開始します。次に、プロトコルの読み込みが完全に完了したら、fMRIシーケンスを開始してください。各fMRI実験では、聴覚刺激を開始する前に、信号を定常状態に到達させるため、10枚のダミー画像を事前に取得する必要があります。

データ収集が完了した後、データを64×64にゼロパディングします。機能ツールを用いて結果を予備的に確認し、データの品質を判定します。

ParaVisionソフトウェアを使用して、すべてのオンブロックとベースラインの間の差分BOLD応答を算出します。一次聴覚野に活性化が見られない場合、技術的な問題や麻酔レベルの影響により、鳥が聴覚刺激を聴取または処理しなかった可能性があります。セットアップを確認し、測定を繰り返してください。

機能的データの取得後、前のfMRIスキャンと同じ方向で解剖学的3D T2強調シーケンスを実行します。その後、このデータを256×256×256にゼロ充填します。

最後に、キンカチョウをMRIベッドから取り出し、ヒートランプの下にあるケージ内で麻酔から回復させます。通常、キンカチョウがイソフルラン麻酔から回復するまでには5分もかかりません。数分後には鳥は立ち上がろうとし、完全に回復すると、ケージの底に座るのではなく枝に止まるようになります。ここでデータ処理を開始します。

まず、MRデータをanalyze形式またはnifty形式に変換します。次に、SPMでデータ処理を開始する前に、ボクセルサイズを10倍にすることで、ソングバードのfMRIデータを適合させる必要があります。fMRI解析ソフトウェアはヒトで取得されたfMRIデータを処理するように開発されているため、MRI Crowソフトウェアを用いて鳥のfMRIデータのボクセルサイズを人工的に大きくすることが、最も簡便な進め方です。

この調整がデータ自体に影響を与えないことに注意してください。再サンプリングやその他のデータ修正は行われません。次に、取得したデータを前処理します。

SPM8を用いて、まずfMRIデータを再アライメントし、解剖学的3DデータセットをfMRIタイムシリーズに共登録します。その後、3Dデータおよび共登録済みfMRIタイムシリーズをキンカチョウ脳MRIアトラスに正規化します。

変換行列をfMRIデータセットに適用し、0.5 mmのガウスカーネルを用いてデータを平滑化します。次に、SPM8を用いて統計的なボクセルベース解析を行い、まず個々の鳥レベルで解析し、続いてグループレベルでの解析を行います。最後に、結果を可視化して機能的活性化部位を特定するため、統計パラメトリックマップを高解像度3Dゼブラフィンチ脳アトラスであるゼブラフィンチアトラス上に投影します。なお、本解析で使用した立体定位座標は、Bioimaging labにおけるMRIアトラスデータセットとして、本実験のために設計されたものです。

脳の境界線および核の境界線は、こちらのウェブサイトから無料で入手可能です。ここでは、左半球の3D表現の側面図が示されており、アトラスから抽出された境界構造が正中矢状面に投影されています。ここでは、安静時と比較して、異なる聴覚刺激によって誘発された一次聴覚野（領域L）および隣接する二次聴覚野におけるfMRIのBOLD反応の例を確認できます。

T値は図に示されたスケールに従って色分けされており、T検定で有意であると判断されたボクセルののみが表示されています。これはキンカチョウを用いたfMRI実験のもう一つの例です。画像は、脳領域のarea XMLDおよびHVCにおける、鳥自身の歌に対する選択的な反応を示しています。

画像の下の数値は、正中線からの座標をミリメートルで示したものです。正の符号は、切片および統計結果が右半球のものであることを示しています。このビデオで説明しているプロトコルは、ムクドリなどの他のソングバードへの応用にも容易に適応させることができます。

これは、このようなfMRI実験の結果の例です。ムクドリにおいて、図は同一個体における季節ごとの、安静時に対する聴覚刺激によって誘発された活性化を示しています。ソングバードにおける機能的MRIの実装と最適化は、ソングバード研究の分野に新たな研究道を切り開きます。

この手法は、これらの動物モデルにおける音声コミュニケーションの根底にある複雑な感覚運動および認知プロセスの実験的解析において、価値のある技術であることがすでに示されています。さらに、非侵襲的であり全脳的なアプローチが可能であるため、fMRIは、より一般的に行われている局所的かつ侵襲的な手法を補完する方法として利用できます。ミツスイ（SUNBIRDS）におけるfMRI実験の増加は、認知研究への問いに対する適用可能性を証明しています。今後の取り組みとしては、MRI実験を聴覚処理（麻酔下でも活性を維持するプロセスである）以外にさらに広げるため、イメージングプロトコルに慣らした覚醒個体を用いることが挙げられます。

これにより、鳥がEMI実験に能動的に参加でき、かつ鳥の注意力を実験的に制御できるという、新たな研究の可能性が開かれるかもしれません。