Name: 線虫における身体サイズ調節に関与する遺伝子をスクリーニングするための戦略を給餌RNA媒介干渉を用いた Cエレガンス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学ぶ給餌RNAiを用いたC. elegansの身体サイズ調節遺伝子スクリーニング法。DBL-1/TGF-βシグナル伝達経路に関与する遺伝子を同定し、発生生物学における大規模遺伝子発現制御の手法を習得できます。

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我々は、様々な発達の時点で動物の姿を提供するためJames Clark氏に感謝します。C.本研究ではエレガンス株は研究資源のためのNIHナショナルセンター（NCRR）によってサポートされ線虫遺伝学センターから入手した。この作品は、ニューヨーク市立大学からJLとCSDにCIRG 1817でサポートされていた、とNIH 1R15GM073678-01およびCSDへ1R15GM097692-01で我々は、原稿上のコメントのための博士ウィリアム·J·ライス博士ナタリアホルツマン、とメリッサSilvestriniに感謝します。この作品は、ニューヨーク市立大学（S.熊）の大学院センターから博士号のための要件の部分的な達成で行った。

1。標的遺伝子配列を運ぶのRNAi給餌プレートの準備<ol><li>市販のRNAiライブラリー（ 例えば、ソースバイオサイエンスライフサイエンスから）使用している場合は、1.4に進みます。代わりに、標準的なクローニングプロトコルによって、ベクトルL4440、8 RNAiのプラスミド、一般的に使用されるワームに標的遺伝子配列のクローンを作成します。 </li><li>細菌株HT115（DE3）を、25μg/ mlのカルベニシリンおよび12.5μg/ mlのテトラサイクリンを含むLB寒天プレート上で培養して組換えプラスミドに変換し、将来の使用のために単一クローンをピックします。 </li><li>一方、実験の対照として使用する細菌株HT115に空のベクターL4440を変換します。 </li><li> 37℃で一晩100μg/ mlのアンピシリンを含む1ミリリットルLBブロス℃の文化換えと空の両方L4440-運ぶ細菌テトラサイクリンは、それがRNAiの効率を低下させるという事実のために追加されません。 </li><li>一晩cultuに100μg/ mlのアンピシリンを持つ別の5mlのLBブロスを追加37で別の4から6時間インキュベート再、℃ </li><li> RNAiのワームプレートにシード0.5ミリリットル換えまたは空L4440-運ぶ細菌培養。クローン名を持つすべてのプレートにラベルを付けます。 </li><li>プレートをマークし、37℃で一晩インキュベート℃の細菌の芝生を育てるために、これらは標的遺伝子配列の有無を問わずRNAiの板である。少なくとも2つのプレートはそれぞれの条件のために準備されるべきです。 </li></ol> 2。 RNAiの給餌プレート上の培養ワーム<ol><li>炎が白金線ワームピックの先端を消毒。 6月10日4令幼虫（L4）は、組換えまたは空L4440を含む各RNAiのプレートに雌雄同体迎えに選ぶワームを使用します。動物は食物源として細菌を使用します。 </li><li>雌雄同体が20℃（C. elegansのための標準的な培養条件）で一晩成長させ、彼らは翌日、若年成人になるでしょう。 </li><li>新たに対応して標識し、準備したRNAiプレートに6月10日、若年成人を転送します。 </li><li>てみましょう大人は4-6時間、卵を産み、その後板からすべての大人を削除し、このステップでは、子孫を同期させることです。母親が削除されたら、時間をカウントし始める。これは時間がゼロになります。 </li><li> 20でプレートをインキュベート℃の動物は特定の発達段階に成長するようにするためには、このプロトコルでは、我々は表現型分析のための若年成人を選択します。通常の速度で開発ノックダウンのために、72時間のインキュベーションは、若年成人になるための動物のために十分である。しかし、様々な遺伝子が異なる動物の発達に影響を与える。 RNAiは、異なる速度で成長すると動物が発生した場合は、若年成人が完了外陰部の開発と子宮の2-6胚（肥沃な場合）とL4は過去24時間以外のものは、それ以下に識別することができます。他の発達段階を識別するために、治験責任医師は、ガイドとして性腺と外陰部の開発を使用する必要があります。 </li></ol> 3。 RNAiに処理されたワームのスコアボディサイズ表現型<ol><li>スライドガラス上に色のついたラベルテープの2つのレイヤーを配置します。のメイク2seのガラススライド。次に、テープを持つ2つのスライドの間に新しいスライドガラスを配置します。水中2％アガロースを溶かし、新しいスライドガラスの中央に一滴を適用し、次にアガロースは前述の9記載されている2％の薄い層を作るために上に第2のスライドガラスを押してください。 </li><li>アガロースが固化した後、上部スライドガラスを取り外すこと。アガロースパッド付きのスライドは、ワームをロードする準備ができています。クローン名とラベルのスライド。 </li><li>アガロースパッドに10μlの25mMのNaN 3を追加して、それを固定するために、NaN 3溶液中に30から40の動物を選択してから、上にカバースリップを入れて、組換えと空の両方がRNAi処理した動物をL4440-運ぶための繰り返し。 </li><li>画像2.5倍の対物レンズを用いて解剖顕微鏡下ワーム、ここで我々は、ソフトウェアQcaptureをサポートするとライカのデジタルカメラを使用しています。 </li><li>キャリブレーションでは、最初の標準マイクロメートル定規のイメージをキャプチャします。 [イメージ-Proソフトウェアで画像を開いて、選択して &quot;測定&quot;をクリックし、 &quot;キャリブレーション&quot;を選択してください&quot;空間キャリブレーションウィザード&quot;。 &quot;アクティブな画像をキャリブレーション&quot;を選択した状態で、 &quot;次へ&quot;をクリックします。入力キャリブレーションの名前と空間参照の単位がメートルに設定されていることを確認してください。そして、 &quot;作成基準校正&quot;ボタンをチェックし、 &quot;次へ&quot;をクリックします。をクリックして &quot;描画基準線。&quot;基準スケールバーが表示されます。マイクロメータの両端に一致するスケールバーの位置を変更し、参照が千単位を示すことを示している。 &quot;OK&quot;ボタン、 &quot;次へ&quot;をクリックし、 &quot;完了&quot;。 </li><li>ソフトウェアが校正されると、ワームの画像を開きます。次に、 &quot;測定&quot;メニューの下に選択して、 &quot;空間を選択&quot;をクリックし、 &quot;キャリブレーション&quot;を選択します。プルダウンメニューでは、マイクロメータ校正用に作成したファイル名を選択します。次に、 &quot;測定&quot;メニューの下に、 &quot;測定&quot;を選択してください。開いたウィンドウで、自由に描画ツールを選択し、コンピュータのマウス（ 図1）と尾部に頭から動物の体の中心を通る線をたどる。長さがウィンドウに報告されます。今標的遺伝子のRNAiと空L4440ベクトルで処置した対照動物と投与動物の体の長さ：あなたはデータの2つのグループがあります。 </li><li> Microsoft Excelファイル、または他の適切な統計ソフトに長さの測定値をエクスポートします。各サンプルの平均値と標準偏差を計算することにより、データを分析します。その後、スチューデントのt検定を用いてサンプルを比較します。 </li></ol>

<ol><li>Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+and+systemic+movement+of+RNA+silencing+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals.</a> Embo J. 30, 3553-3563 (2011).</li>
<li>Wall, N. R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA%3A+can+RNA+interference+be+exploited+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy.</a> Lancet. 362, 1401-1403 (2003).</li>
<li>Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+movement+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA silencing movement in plants.</a> Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).</li>
<li>Shim, M. S., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+targeted+delivery+of+siRNA+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Febs.+J%22%5BJournal%5D)">Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo.</a> Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).</li>
<li>Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+chemically+synthesized+siRNA+and+vector-mediated+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi.</a> FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).</li>
<li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li>
<li>Savage-Dunn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFb+pathway+components%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li>
<li>Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+TGF%CE%B2+signal+transducers+in+the+hypodermis+regulates+body+size+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans.</a> Development. 129, 4989-4998 (2002).</li>
<li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130, 6453-6464 (2003).</li>
<li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling.</a> WormBook. , 1-12 (2005).</li>
<li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li>
<li>De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evo-devo%3A+variations+on+ancestral+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evo-devo: variations on ancestral themes.</a> Cell. 132, 185-195 (2008).</li>
<li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263, 103-112 (2001).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

このプロトコルでは、Cのボディサイズ欠損変異株の同定のための私達の方法を記述RNAiの給餌によってエレガンス 。この方法では、TGF-βシグナル伝達コンポーネントの識別にも適用可能である。このような成分が高度に進化15を介して保存されているので、このような画面は、すべての後生動物ではTGF-βシグナル伝達の分子機構の解明に関連しています。このような画面を設計する際の重要な考慮事項は、出発菌株です。 LIN-15bとRRF-3以前の研究12,13と一致しているコントロール株よりもRNAiの摂食に対してより敏感である、我々は、両方がeri-1があることを実証した。 ERI-リットルにもかかわらずしかし、LIN-15bは最強の表現型を示したが、動物はよく成長し、いくつかの子孫を生産していませんでした。したがって、大規模な画面では、我々はこの株から表現型を記録する十分な動物を持っていないでしょう。結果として、我々はRRF-3...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> RNAiのワームプレート 17.7グラムのWORMメディアミックス 60グラム寒天 3リットルにH 2 Oを追加します。オートクレーブ。 3ミリリットル1M IPTG（滅菌）および3ml 25 mg / mlのカルベニシリンを（滅菌）を追加してから、60ミリメートルペトリ皿に注ぐ。 ワームプレート 17.7グラムのWORMメディアミックス 0.6グラムの硫酸ストレプトマイシン 60グラム寒天 3リットルにH 2 Oを追加します。オートクレーブ。 60ミリメートルペトリ皿に注ぐ。 WORMメディアミックス 55グラムのトリス-Cl 24グラムのトリス-OH 310グラムバクトペプトン 800mgのコレステロール 200グラムのNaCl 徹底的に混ぜるとチャンクを避けるようにしてください、この粉末の混合物を使用する前に何ヶ月も保存することができます。 2％アガロース 0.5グラムアガロース 広告dは25ミリリットルのdH 2 O電子レンジでの加熱溶解するまで。 1Mイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG） 2グラムのIPTG IN10ミリリットルdH 2 Oを溶かす 1MのNaN 3 6.5グラムのNaN 3 100mlにdH 2 Oを追加 25mMのNaN 3を 2.5ミリリットル1MのNaN 3 100mlにdH 2 Oを追加 線虫の遺伝学センターから線虫（Caenorhabditis elegans） プラスミドL4440（アンピシリン耐性遺伝子を運ぶ） 菌株HT115（DE3）（IPTG誘導性T7ポリメラーゼを含んでいます。またテトラサイクリン耐性遺伝子を運ぶRNアーゼIII遺伝子（dsRNAse）を欠損する）16 60ミリメートルペトリ皿 100ミリメートルペトリ皿 14ミリリットルの丸底ファルコン培養管 スライドガラス カバーガラス 1から20μlのピペッター 20から200μlのピペッター 200-1000μLピペッター 1から200μlのピペットチップ 200-1000μlのピペットチップ 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブ 白金線ワームピック</td></tr></tbody></table>

線虫における身体サイズ調節に関与する遺伝子をスクリーニングするための戦略を給餌rna媒介干渉を用いた<em&gt; cエレガンス</em

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

二本鎖RNA媒介干渉（RNAi）は1月3日 、標的遺伝子の発現をノックダウンする効果的な戦略である。それは植物、無脊椎動物と脊椎動物を含む多くのモデルシステムに適用されています。 生体 4,5 でRNAiを達成するためのさまざまな方法があります。一過性かもしれない代わりに特定の標的遺伝子（RNAiのオリゴ）から二本鎖オリゴヌクレオチドを​​合成し、例えば、標的遺伝子がRNAiのベクトルに変換することができ、その後永久に、または一過性に遺伝子ノックダウンの効果を達成するために、細胞株や初代培​​養細胞に形質転換標的遺伝子を沈黙させる細胞株や初代培​​養細胞に形質転換し、または合成さ​​れた二本鎖RNA分子が生体に微量注入することができる。線虫C.以来虫、細菌が標的遺伝子に対する二本鎖RNAを発現する動物の餌、食料源として細菌を使用して実行可能な戦略6を提供しています。ここではRNAiの給餌を提示体の大きさの表現型を獲得するための方法。 Cのボディサイズ虫は主に 、TGF-βによって調節されている-のような配位子DBL-1ので、このアッセイは、TGF-βシグナル伝達成分7の識別に適しています。私たちは、RNAi給餌実験を再現する2 RNAiの過敏株を含む様々な菌株を使用していました。我々の結果は、RRF-3株は私たちに最高の期待されるのRNAi表現型を与えることを示した。方法は、実施が容易で再現性があり、容易に定量化される。さらに、我々のプロトコルでは、特殊な装置の使用を最小限に抑えているので、小さな実験室や主に学部機関の人に適しています。

私たちの研究では、DBL-1/TGF-β経路による体の大きさの規制に重点を置いています。野生型動物7,10,11に比べ短いボディの長さも含めて、小さなボディサイズでDBL-1経路の結果、の機能の喪失。したがって、Cの画面虫の体の大きさの変異体は、TGF-βシグナル伝達成分と修飾子を識別することが可能である。 DBL-1シグナルが細胞表面の受容体と細胞内のSmadシグナルトランスデューサ12を含む保存されたTGF-βのシグナル伝達経路によって媒介される。 dbl-1/ligand; SMA-2、SMA-3、sma-4/Smads;と：ボディサイズ変異体の同定のために供給することにより、RNAiの有効性をテストするために、我々は、DBL-1経路成分を倒すためにこの手法を使用sma-6/receptor。我々の研究では、2つの異なるRNAi過敏Cを使用実験を行うためのエレガンス株：ERI-1; LIN-15bとRRF-3 13,14。一方、我々はまた、N...

我々は、標的遺伝子とスコアボディサイズの表現型をノックダウンするのRNAi送り技法を使用する方法を示し<em&gt; Cエレガンス</em&gt;。このメソッドは、DBL-1/TGF-βシグナリングによるボディサイズ調節に関与するものなど興味のある潜在的な遺伝的要素を識別するために大規模なスクリーンを使用することができる。

線虫における身体サイズ調節に関与する遺伝子をスクリーニングするための戦略を給餌RNA媒介干渉を用いた<em&gt; Cエレガンス</em

二本鎖RNA介在性干渉（RNAi）は、標的遺伝子の発現をノックダウンするための有効な戦略である1-3。これは多くのモデル系に適用されており...

このビデオでは、C. elegansの成長と体サイズを調節する遺伝子を特定するための手順を実演します。RNA干渉（RNAi）を用いて候補遺伝子を不活性化させるため、まず標的となる遺伝子を標的とする二本鎖RNAを発現する細菌を含むプレートを調製します。その後、L4期の雌雄同体幼虫をRNAiプレートに転移させます。若成虫段階に達した後、産卵のために新しいRNAIプレートに移します。数時間後、成虫を取り除くことで、同期させた胚の集団を得ます。目的の発育段階に達したところで、子孫を回収し、スライドガラスに封入します。最後に、線虫の顕微鏡画像を撮影します。画像の解析により、遺伝子の不活性化によって引き起こされる体サイズの変化が示されます。この手法はTGF betaシグナル伝達経路の調節因子の特定に使用できますが、インスリンシグナル伝達経路など、C. elegansの胚発生後の発達を調節する他の経路にも適用可能です。まず、標的遺伝子配列を、線虫RNAiで一般的に使用されるプラスミドであるベクター L 4 4 4 0 A にクローニングし、組換えプラスミドを細菌株 HT one 1 5 DE three に形質転換します。形質転換した細菌を、25 µg/mL のカナマイシンと 12.5 µg/mL のテトラサイクリンを含む LB 寒天培地で培養し、その後、単一のクローンをピックアップして今後の使用に備えます。一方、空ベクター L 4 4 4 0 を細菌株 HT one 15 に形質転換します。実験のコントロールとして使用するため、形質転換した細菌を 100 µg/mL のアンピシリンを含む 1 mL の LB 液体培地で 37 °C で一晩培養します。テトラサイクリンはRNAI効率を低下させるため添加しません。100 µg/mLのアンピシリンを含むLBブロスをさらに5 mL、オーバーナイト培養液に添加し、37 °Cでさらに4〜6時間インキュベートします。培養が完了したら、適切なクローン名でラベル付けしたRNAI用ウォームプレートに、実験群または対照群の細菌を0.5 mLずつ播種します。各条件につき、少なくとも2枚のプレートを準備してください。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。翌日、標的遺伝子配列を含む、または含まないRNAiを発現する細菌のローンを形成しておきます。動物はこれらの細菌を餌として利用します。RNAi給餌プレートの準備が整ったら、白金線の先端を火炎滅菌します。次に、白金線を使い、第4段階幼虫（L4）の C. elegans ヘルマフロダイトを各RNAiプレートに6から10匹ずつ移します。ヘルマフロダイトを20 °Cで一晩培養します。翌日には、個体は若齢成虫になります。それらを、適切にラベル付けされ準備された新しいRNAIプレートに移します。成虫に産卵させるため、プレートを20 °Cで4〜6時間インキュベートします。インキュベーション後、次世代を同期させるために、プレートからすべての成虫を取り除きます。成虫を除去した後、時間を計測し始めます。これを0時とします。プレートを20 °Cでインキュベートし、動物を目的の発達段階まで成長させます。ここでは、表現型解析のために若成体を選択します。通常どおりの速度で成長するノックダウン個体の場合、72時間の培養が必要です。遺伝子によって動物の成長への影響が異なるため、培養時間を調整する必要があることに留意してください。RNAiによって個体の成長速度に差が生じた場合、若成体は、L4期から24時間以内で、VUL（陰門周辺組織）の発達が完了し、子宮内に2〜6個の胚が確認できる個体として識別します（ここに示す通り）。その他の発達段階を識別するには、生殖腺およびVULの発達状況を指標としてください。個体が適切な段階まで成長したら、RNAi処理した線虫の身体サイズの表現型をスコアするための準備を行います。次に、ここに示すように、厚さ1 mmのガラス標本スライドに色付きのラベルテープを2層貼ります。このガラススライドを2枚作成してください。その後、テープを貼った2枚のスライドの間に新しいガラススライドを挟み、水で溶解した2% Agrosを1滴滴下します。新しいガラススライドの中央に、2枚目のガラススライドを上から押し当て、薄いアガロースパッドを作成します。アガロースが凝固したら、上のガラスを取り除きます。これで、アガロースパッド付きのガラススライドに線虫をロードする準備が整いました。スライドにクローンの名前を記入します。arosパッドに25 millimolarのアジ化ナトリウムを10 µL加えます。次に、前述と同様に白金線を用いて、30から40匹の個体をアジ化ナトリウム溶液に移します。個体を固定するため、上からカバーガラスを被せます。この操作を、リコンビナントおよび空のL 4 4 4 0を搭載しRNAi処理を施した個体の両方に行います。次に、対物レンズ2.5xの実体顕微鏡下にマイクロメーターのスライドガラスを設置します。Q Captureまたは同様のソフトウェアを使用して、マイクロメーター定規の画像をキャプチャして保存します。次に、線虫を顕微鏡下に配置し、画像をキャプチャします。まず体長を測定するため、Image Proソフトウェアでマイクロメーター定規の画像を開きます。次に「measure」をクリックし、「calibration」を選択します。続いて、「calibrate the active image」を選択した状態で「spatial Calibration wizard」を選択します。「next」をクリックしてください。キャリブレーションの名前を入力し、空間参照単位がミクロンに設定されていることを確認します。次に、「参照キャリブレーションを作成する」ボタンにチェックを入れ、「次へ」をクリックします。「参照線を引く」をクリックしてください。リファレンススケールバーが表示されます。スケールバーを移動させ、マイクロメーターの両端に合わせます。その後、そのリファレンスが1000ユニットであることを指定します。「OK」をクリックします。次に「次へ」と「完了」をクリックします。ソフトウェアのキャリブレーションが完了したら、線虫の画像を開きます。次に、「measure」メニューから「calibration」を選択し、「select spatial」をクリックします。プルダウンメニューから、マイクロメーター校正用に作成したファイル名を選択してください。その後、「measure」メニューから、開いたウィンドウにある「measurements」を選択します。フリードローツールを選択し、コンピューターマウスを使用して、動物の体の中心に沿って頭から尾まで線を引きます。長さがウィンドウに表示されます。視野内のすべての動物に対してこの操作を繰り返します。長さの測定結果をMicrosoft Excelファイルまたはその他の適切な統計ソフトウェアにエクスポートします。各サンプルの平均値と標準偏差を算出してデータを分析します。その後、Studentのt検定を用いて各群の結果を比較します。TGFβ（トランスフォーミング成長因子β）スーパーファミリータンパク質であるDBL1は、TGFβパスウェイの活性化に必要です。シグナル活性化に反応して、細胞内のSmadシグナル伝達物質が核へ移行し、遺伝子転写を開始します。TGFβパスウェイが阻害されている個体では、野生型動物よりも体長が短くなるなど、体サイズが小さくなることが観察されます。したがって、C. elegansを用いてスクリーニングを行います。体サイズ変異体を用いることで、TGF βシグナル伝達経路の構成要素および修飾因子の特定が可能となり、摂食によるRNAiの有効性を検証して体サイズ変異体を同定できます。RNAiを用いて、C. elegansの4つの異なる系統において、DBL 1経路の構成要素であるSMA 3およびSMA 6をノックダウンしました。テストに使用したC. elegans系統には、RNAi過敏性系統であるLin-15 BおよびRF3の2系統に加え、標準的な野生型系統であるN2と、ここで示すようにRNAi感受性がN2と同等であるLIN-36系統が含まれていました。SMA-3またはSMA-6の発現を阻害したところ、Lin-36におけるSMA-6 RNAiを除き、動物は対照群と比較して体長が有意に短くなりました。RF3の背景における結果です。RNAi処理後の若年成虫の背景体長は、ベクターのみの場合の84〜95%であった。A one Lin 15 B背景におけるRNAi処理後の若年成虫の体長は、対照群の動物の68〜86%であった。しかし、A one lin 15 B系統は産仔数が少ない。このため、これらは大規模スクリーニングには適していません。したがって、これらの手法にはRF three株の使用が推奨されます。このビデオを視聴することで、RNAi干渉法を用いて成長と体サイズを調節する遺伝子を特定する方法について、十分に理解できるはずです。

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生物学

Neurexinsとneuroliginsはシナプス分化と伝達に重要な役割を実行する膜ニューロンの接着タンパク質です。のニューロリギン欠損変異体...

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の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

RNAiは、C.エレガンスの研究者が利用できる強力な遺伝ツールです。この動画では、液状培養条件を利用して、プレートフィーディングよりも多くの線虫をRNAiで処理する方法を紹介しています。...

液体培養におけるRNAiフィーディング:C.エレガンスにおける遺伝子発現をノックダウンするためのハイスループット法

dsRNAは、Cで供給しながら、 エレガンスは、大規模な送り画面の現在のプロトコルは、可変ノックダウン効率をもたらす遺伝子機能を評価するための強力なツールである。我々は、遺伝子発現の非常に有効かつ再現性のノックダウンをもたらす大規模なRNAi送り画面を実行するための改良されたプロトコルを記載している。...

大規模な遺伝子ノックダウン中<em&gt; C.虫</em&gt;堅牢な機能喪失表現型を生成するためのdsRNA摂食ライブラリの使用

線虫は、宿主-病原体相互作用を研究するための新しい遺伝モデルとして登場しました。ここでは、 温度を感染させるためのプロトコルを記述サルモネラ感染に対する防御における宿主遺伝子の役割を調べるために二重鎖のRNAi干渉法と結合ネズミチフス菌とエレガンス 。...

感染するためのプロトコル<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;と<em&gt;ネズミチフス菌</em

新規メトリックは、線虫の胚伸びを特徴づけるために、<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

このプロトコルは、緑色蛍光タンパク質 (GFP) の融合タンパク質マーカーとして、4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) による熱ストレス蛋白質の核移行を追跡する方法を示しますを汚します。プロトコルを汚す DAPI は速く、GFP...

緑色蛍光タンパク質タグと 4', 6-Diamidino-2-phenylindole線虫の染色によるタンパク質細胞内局在を検出

シャペロン-シャペロンとシャペロン基質相互作用を研究するために、我々は、軽度の突然変異またはシャペロンの過剰発現と組み合わせてRNA干渉を使用して カエノハブディティス・エレガンス...

カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする

Caenorhabditis elegansは 、健康寿命、寿命、ストレスに対する回復力を調査するための堅牢で低コストの方法を備えた優れたモデルシステムとして機能します。...

Caenorhabditis elegansの寿命と健康寿命を測定するための低コストの方法の調査

学ぶ給餌RNAiを用いたC. elegansの身体サイズ調節遺伝子スクリーニング法。DBL-1/TGF-βシグナル伝達経路に関与する遺伝子を同定し、発生生物学における大規模遺伝子発現制御の手法を習得できます。

線虫における身体サイズ調節に関与する遺伝子をスクリーニングするための戦略を給餌RNA媒介干渉を用いた

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