イメージング初代培養マウス神経細胞における形質膜に受容体の挿入をpHluorinタグ付き

次の実験の全体的な目標は、培養初代マウスニューロンの原形質膜に挿入されるニューロン受容体を視覚化することです。これを行うために、マウスGLは、胚または新生児マウスの大脳皮質から得られ、半透過性のコラーゲン被覆培養インサートで増殖されます。グリア培養物は、カバースリップ上の初代胚性海馬ニューロン上に浮遊しています。

次に、7日間のコンディショニングの後、ニューロンに超黄道フッ素タグ付きドーパミンD2受容体をトランスフェクションします。タグ付き受容体は細胞内小胞に局在しますが、小胞の酸性環境内では非蛍光のままです。しかし、小胞が原形質膜と融合すると、フローリンは細胞外環境の中性pHにさらされ、明るく蛍光を発するため、全反射蛍光顕微鏡による検出が可能になります。

この方法は、膜タンパク質輸送分野における重要な疑問に答えるのに役立ち、グルタミン酸受容体やgpro共役受容体など、フッ素で標識できるあらゆる膜タンパク質の輸送を可視化することができます。今日、私と一緒に手順を実演するのは、乾燥した繁殖であり、私たち1人、私たちの研究グループの他の2人のメンバーは、解剖手順の前日、コラーゲン溶液を含むT75フラスコを直立させ、フラスコを直立させて一晩乾燥させます。グリア培養の日には、安楽死後、グリア培地を摂氏37度の水浴で少なくとも30分間温め、胚マウスまたは新生児マウスの大脳皮質を解剖顕微鏡で解剖します。

除去した皮質を、氷、冷たく、人工脳脊髄液、またはCSFで満たされた15ミリリットルの円錐管に入れます。次に、A CSFを2ミリリットルを除くすべて取り除き、100マイクロリットルのペパン溶液と20マイクロリットルの1%DNAを追加します。チューブを摂氏37度の水浴に入れ、ティッシュを20分間消化させます。

消化後、プロパン溶液を慎重に取り除き、10ミリリットルの温熱グリア培地を追加して、脳組織を慎重に洗浄します。次に、組織を乱さないように注意してください。グリア培地をできるだけ取り除きます。

2ミリリットルの新鮮なグリア培地を加え、ティッシュが見えなくなるまでピペットトライレートを過ぎて火で磨いたガラスを使用します。組織が完全に解離した後は、気泡の形成を避けてください。さらに8ミリリットルの新鮮なグリア培地を追加し、70ミクロンのセルストレーナーで懸濁液をピペットで濾液します。

50ミリリットルの円錐形チューブに流れを集めます。解離した細胞を2〜3個の胚からコラーゲン被覆T75フラスコに移し、翌日、組織培養インキュベーターで摂氏37度で一晩培地を吸引します。細胞を10ミリリットルのPBSで一度すすいでください。

次に、各フラスコに10〜15ミリリットルの新鮮なグリア培地を追加します。培養物を10〜12日間インキュベートし、3〜4日ごとに培地を交換します。コンフルエントになったら、グリア細胞をPBSですすいでください。

次に、フラスコに5ミリメートルの0.05%tripsを加え、細胞を摂氏37度で5分間分離させます。短いインキュベーションの後、グリア培地とピペットを加えて、GLをフラスコの底から取り外します。細胞を2つの新しいコラーゲンコーティングT75フラスコに分割します。

これらが合流点に達すると、トライプは以前と同様にアニズし、各フラスコの内容物をコラーゲンコーティングされた培養インサートを含む6つのウェルプレートに播種します。グリア培地培養物の2ミリリットル以上を置き、細胞を1〜7日間。これらのグリア培養インサートは、ニューロン培養のコンディショニングに使用されます。

洗浄されたポリリジンコーティングされたカバースリップを含む6ウェルプレートの各ウェルに4ミリリットルのめっき培地を加え、プレートを摂氏37度のインキュベーターに一晩置きます。このステップにより、ニューロンの生存の可能性が高まり、おそらく翌日に残留ポリリジンが除去されます。めっき媒体を取り外し、2ミリリットルの新しいめっきと交換します。

培地の2%を含む培地。海馬ニューロンの培養のためのサプリメントB 27 解剖顕微鏡下で、4つのE 15〜18胚マウスの脳組織からカバカンピを解剖します。カバカンピを氷冷解剖バッファー付きの15ミリリットルの円錐形チューブに入れます。

次に、3匹のE 15〜18胚マウスの脳組織から線条体を解剖し、氷冷解剖緩衝液を備えた別の15ミリリットルの円錐管に入れます。前回と同様にペパンで組織を消化します。次に、ヘモサイトメーターを使用します。

各ニューロン懸濁液とシードの細胞数を決定します。各カバーは0.4倍10〜6番目の細胞で滑り、摂氏37度のインキュベーターで一晩培養します。ニューロン培養物を調整するためのグリア培養インサートを調製するには、グリア培養インサートとプレートから培地を吸引し、それぞれを2ミリリットルの新鮮なメッキと交換します。

ミディアム 翌日、グリア培養インサートの下の皿の各ウェルにニューロンが入るカバーを滑り込ませます。3〜4日ごとに摂氏37度でインキュベートを続けます。培地の半分を、トランスフェクションおよびイメージング実験の準備ができるまで、B 27を含む新鮮な温めた給餌液と交換します。

ニューロンは培養の7日目にトランスフェクションされ、培養8日目に画像化されます。一貫したニューロン培養は、ライブイメージング実験を成功させるための鍵です。この図は、このプロトコルを使用してin vitroで11日からin vitroで18日間培養したマウス海馬ニューロンを示しています。

画像から、ニューロンが広範なプロセスを発達させ、樹状突起が樹状突起棘で密に覆われていることは明らかです。これらのニューロンが各ニューロン培養の培養において健康であることを示しています。2001マイクログラムのDNAで2マイクロリットルの脂肪切除術を組み合わせ、スーパー黄道フローリンでタグ付けされたドーパミンDの2つの受容体をコード

混合し、室温で20分間インキュベートします。インキュベーション中に、培地の下から1ミリリットルを取り出し、各グリア培養インサートの内側から1ミリリットルを同じ円錐管に移します。次に、保存した培地にB 27を含む同量の給餌培地を加え、摂氏37度でインキュベートします。

この培地は、トランスフェクション後のニューロン培養に使用されます 20分間のリップエフェクトは、DNAを一時的にインキュベーションすることを意味します。6つのウェルプレートからグリア培養インサートを取り出します。200マイクロリットルの脂肪切除DNA混合物をニューロンで各カバースリップに加えます。

培養物の膜の下に気泡を発生させないようにしてください。グリア培養インサートを交換し、摂氏37度で2〜4時間インキュベートします。インキュベーション後、グリアインサートを再度取り外し、各ウェルからトランスフェクション溶液を吸引し、以前にニューロンに保存した2ミリリットルの培地を追加し、グリア培養インサートを交換します。

最後に、各インサートからグリア培地を取り出し、保存した培地を各培養物に2ミリリットル加えます。トランスフェクションされたCD NAの発現を可能にするために、細胞をさらに24〜72時間放置する。このビデオで使用されているTIRFイメージングシステムは、励起用の100ミリワットシアンレーザーと検出器用の電子増倍電荷結合デバイスカメラを使用してカスタムセットアップされ、イメージング開始の30分前に、水浴でCSFを摂氏37度まで温めます。また、レーザーとカメラ、加熱インサートの電源を入れ、加熱インサートを顕微鏡ステージに置きます。

トランスフェクションされたニューロンをライブイメージングチャンバーにカバースリップを置き、予め温めたA CSFを迅速に追加します。チャンバーを顕微鏡ステージの加熱インサートに置き、エピ蛍光イメージングモードで、トランスフェクションされたニューロンを同定します。次に、TIRFイメージングモードで、ニューロンを1分間光退色して、原形質膜上の既存のフッ素蛍光を排除します。

次に、E-M-C-C-Dカメラの電子増倍管のゲイン設定をMAXにし、10ヘルツで1分間の撮影を開始します。すべてのイメージングが完了すると、各録画には600枚の画像が含まれます。画像Jを使用してデータを解析し、ドーパミンD2受容体の膜挿入を決定します。

マウスsal中棘ニューロンに超黄道トランスフェクションを行った。次に、フローリンタグ付きドーパミンD、2受容体PDR、D、2ライブTIRFイメージングを行い、100ミリ秒ごとに1枚の画像の割合で600枚の画像を撮影しました。この画像は、タイムラプス記録の最大強度投影を示しています 白い矢印は、pH DD 2 を含む個々の小胞が原形質膜と融合した場所を示しています。

この画像は、XYT スタックが Y 軸を中心に 90 度回転し、各 X 軸線の最大ピクセルが 1 つの y 軸ピクセルに投影される YT 最大強度投影を示しています。挿入のタイムラインに関する情報を提供するために、これらのデータは、この方法が、その発生後に培養マウスニューロンにおける受容体の原形質膜挿入の調節を調べるために成功裏に採用され得ることを示している。この技術は、ニューロン受容体輸送の分野の研究者が、他のニューロン細胞膜受容体、チャネル、およびトランスポーターの制御を探求する道を開きました。