Name: イメージング初代培養マウス神経細胞における形質膜に受容体の挿入をpHluorinタグ付き (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: 学ぶ pHluorinタグ付きドーパミンD2受容体を用いて、初代培養マウス海馬神経細胞における形質膜への受容体挿入を可視化する方法。この技術は神経細胞シグナル伝達と受容体動態の理解に貢献します。

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本研究は、ザ・ジャクソン研究所からのスタートアップ資金による支援を受けています。

1。神経培養エアコン用マウスグリア文化の準備<ol><li> T75フラスコは、コラーゲン溶液（蒸留H 2 O中Purecolの1:3希釈）でコーティングされています。フラスコを立設し、組織培養フード中で一晩乾燥させています。 </li><li>解離バッファ（ACSF：119 mMのNaCl、カルシウムなし5mMのKCl、1mMのMgCl 2、30mMのデキストロース、25mMのHEPES、pH7.4で）やグリア培地（DMEM、10％FBS、10単位/ mlペニシリン、10 μg/ mlストレプトマイシン、およびグルタマックスは）℃使用直前まで準備し、4℃で保存されています。 </li><li>グリア文化の日に、グリアメディアがマウスの脳の解剖の前に37℃の水浴中で少なくとも30分間加温する。胚または新生仔マウスは、急速な断頭により安楽死させる。脳皮質を解剖顕微鏡下で解剖されています。 </li><li>解剖した脳組織を37℃パパイン溶液（100mlパパインおよび2 ml郭清を緩衝液中の20μlの1パーセントのDNase I）°CのFOで消化されるR 20分。 </li><li>パパイン消化後、脳組織を10mlの予め温めグリアメディアでリンスしています。新鮮グリアメディア（2 ml）を消化した脳組織に追加され、組織はファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを用いて摩砕しています。 </li><li>新鮮グリアメディア（8ml）を解離組織に追加されます。 70μmのセルストレーナーは、解離組織懸濁液をフィルタリングするために使用されます。次いで、細胞を、T75フラスコ（通常2-3胚ができるシード1 T75フラスコ）に接種し、37℃のインキュベーターに入れられる。 </li><li>翌日、T75フラスコから培地を吸引しています。フラスコを10mlのPBSで洗浄する。新鮮グリアメディア（10-15 ml）を各フラスコに添加されています。 </li><li> 10から12日以内に、T75フラスコのグリアがコンフルエントになる必要があります。グリア細胞は、PBSで洗浄し、0.05％トリプシン5mlをそれぞれT75フラスコに追加されます。 </li><li> 5分間37℃トリプシンのインキュベーション後、グリア細胞はそれぞれT75フラスコから解離およびグリア細胞を2つに分割され異なるコラーゲンコートT75フラスコ。 </li><li>培養インサート（ミリポアPICM03050）を6 - ウェルプレート、コラーゲンでコーティングして、一晩空気乾燥にそれらを置くことによって調製される。グリアメディア（各2ml）を各培養インサートの下に配置されています。 </li><li>コンフルエントT75フラスコからグリアをトリプシン処理し、（6ウェルプレートあたり1 T75フラスコ、各2ml挿入）培養インサート上に播種されています。これらのグリア細胞培養インサートは、条件ニューロン培養するのに使用されます。 </li></ol> 2。ニューロンの文化<ol><li>神経細胞培養用のカバーガラスは、70％で少なくとも一晩HNO 3を浸漬することによって清掃されています。カバーガラスは、その後ddH 2 Oを少なくとも3回洗浄し、（&gt; 200℃）で一晩Isotempオーブンで乾燥させます。 </li><li>洗浄カバーガラスを6ウェルプレート1ウェルあたり1カバースリップに配置されます。カバースリップを37℃のインキュベーターで一晩、ポリ-L-リジン溶液（2ml、100mMホウ酸、pH = 8.5で0.1％）でコーティングされています。 </li><li>ザポリ-L-リジン溶液は、カバーガラスとカバーガラスから取り外されオートクレーブ滅菌蒸留H 2 Oで3回洗浄するカバーガラスは、その後37でインキュベートされる（Neurobasalが5％熱不活化ウマ血清、10単位/ mlペニシリン、10μg/ mlのストレプトマイシン、グルタマックスを補ったプレート培地で一晩℃のインキュベーター、メッキ用培地に添加されている2パーセントB27サプリメント当日）が使用されます。 </li><li>翌日、プレート培地を除去し、B-27に、新鮮なプレート培地2mlのガラスカバースリップを持って各ウェルに添加する。 </li><li>妊娠マウス（E15-18）は、CO 2で安楽死され、マウス胎児は断頭により安楽死させる。海馬や線条体は、それぞれ脳組織​​から解剖し、海馬ニューロンまたは線条体中型有棘神経細胞の培養のために、氷冷解剖緩衝液を用いて15 mlコニカルチューブに入れられます。 </li><li>ステップ1.4）、1.5）で説明したように解剖した脳組織は、パパインによる解離する。 </li><li> F解離ollowing、各ニューロンの懸濁液中の細胞数は血球計算板でカウントされます。神経細胞は、その後、6ウェルプレートのウェル当たり0.4×10 6細胞の密度で各カバースリップ上に播種し、37℃のインキュベーターで一晩培養する（ニューロンがDIV 0アール）。 </li><li>コンディショニングのグリア培養インサートニューロン培養を準備するには、グリアメディアは、グリア培養インサートから削除され、新鮮なメッキ媒体（インサート内の2ml及びインサートの下に2ミリリットル）を添加する。 </li><li>翌日（DIV 1）は、ニューロンとグリアカバースリップを培養インサート、各ウェル中の1カバースリップの下に配置されます。 </li><li>彼らは、トランスフェクションおよびイメージング実験の準備が整うまで、ニューロンは新鮮予め温めておいた餌メディア（B-27）3〜4日ごとに半分の容積が供給される。 </li></ol> 3。トランスフェクション<ol><li>神経細胞のトランスフェクションは、リポフェクタミン2000を使用して実行されます。各ニューロンの培養用（カバースリップあたり一つの文化）、2μlのリポフェクタミン2000と1μgのDNAを使用しています。ノーサプリメントで新鮮Neurobasal培地はリポフェクタミンとDNAを希釈するために使用されます。 </li><li> DNAとリポフェクタミンを混合した後、室温で20分間インキュベートする。 </li><li>各グリア培養インサート下からのメディアの1ミリリットルを保存し、各インサートの内側から1ミリリットル、円錐管にメディアを転送する。 37℃で保存した培地でインキュベート℃にメディア送りの同じボリューム+ B27を追加この培地は、トランスフェクション後の神経細胞培養のために使用されます。 </li><li> 20分リポフェクタミン/ DNAのインキュベーションの後、グリア培養インサートを6ウェルプレートから瞬間的に削除されます。 200μlのリポフェクタミン/ DNA混合物をニューロンと各カバースリップに追加されます。グリア細胞培養インサートはその後ニューロン上に、各ウェルに返されます。培養インサートの膜の下の気泡の発生は避けるべきである。ニューロンは2〜4時間、37℃でリポフェクタミン/ DNA混合物と共にインキュベートする。 </li><li>目の後E 2〜4時間のインキュベーション期間、グリア挿入が再び削除されます。リポフェクタミン/ DNA混合物と培養培地を各ウェルから除去されます。ステップ3.3）に保存されたメディアは、ニューロン（ウェル当たり2ミリリットル）に追加されます。グリア細胞培養インサート）を各ウェルに返され、各インサートからグリアメディアが削除され、ステップ3.3からのメディアの2ミリリットル各インサートに追加されます。 </li><li>ニューロンは、全反射イメージングは​​、これらのニューロン上で実行される前に、トランスフェクトされたcDNAの発現を可能にするために、追加の24から72時間培養する。 </li></ol> 4。 TIRFイメージング<ol><li>人工脳脊髄液（ACSF：119 mMのNaCl、2.5mMのKCl、30mMのグルコース、2mMのCaCl 2、1mMのMgCl 2、25mMのHEPES緩衝液、pH = 7.4）をライブイメージング実験のために使用されます。当社の全反射イメージングシステムは、検出器のための100 mWのシアン励起用レーザー、電子増倍電荷結合素子（EMCCD）カメラでセットアップカスタムです。 </li><li>イメージング実験に先立ち、ACSFは37＆dで警告される例えば、少なくとも30分間℃の水浴。ライブイメージング用加熱インサートは、顕微鏡ステージ上に配置され、加熱挿入、レーザー、カメラはイメージング実験の開始前に少なくとも30分間温めています。 </li><li>トランスフェクトされたニューロンとカバースリップをライブイメージング室に組み立てられる。チャンバーを組み立てた後あらかじめ温めておいたACSFはチャンバ内に配置され、このステップはできるだけ迅速に完了する必要があります。 </li><li>チャンバーは顕微鏡ステージ上で加熱インサート上に置かれると、トランスフェクトされたニューロンは、エピ蛍光イメージングモードで視覚的に識別されます。 </li><li>健康なトランスフェクトされたニューロンは（ 図1及び図2参照）を同定した後、原形質膜上のpHluorin-受容体は非常に高い蛍光レベル時を持っているように、我々は一般的に、細胞膜上の既存pHluorin蛍光を排除するために、光漂白剤の1分を実行TIRF画像が最初に開始され、これは、個々のプラグインの可視化を妨げるertionイベント。 </li><li>光退色後、EMCCDカメラで電子増倍管のゲイン設定が最大に設定されており、記録は、10 Hzで1分間実行されます。 </li><li>各記録は600の画像が含まれています。個々の挿入イベントがImageJを用いた記録バックを再生することにより識別されます。個々の挿入イベントは手動でImageJを用いて分析する。 </li></ol> 5。代表的な結果一貫性のあるニューロンの培養は成功したライブイメージング実験の鍵となります。 図1に 18をdivに、DIV 11から我々のプロトコルを使用して培養したマウス海馬神経細胞を示しています。これは、神経細胞が広範囲プロセスを開発していることと、樹状突起は樹状突起棘、これらのニューロンは、文化の中で健康であることの表示で密に覆われている画像から明らかである。私たちの文化プロトコルはまた、脳内の神経細胞の他のタイプを使用することができる。例えば、我々は最近、文化に、このプロトコルを使用培養マウス線条体中型有棘ニューロン9にドーパミンD2受容体（DRD2）の挿入を検討する研究では線条体中型有棘ニューロン図2は、DIV 8時に我々のプロトコルを使用して培養したマウス線条体中型有棘ニューロンを示しています。我々はまた、正常ニューロンのこのタイプのsuperecliptic pHluorinタグ付きDRD2sの全反射イメージングを行った。 図3はpH DRD2このニューロンにおける挿入の中型有棘ニューロンと可視化でpHluorinタグ付きDRD2（PH-DRD2）の発現を示す。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig1.jpg" /> インタフェース培養法を用いて図1。マウス海馬培養。 DIV：in vitroでの日、文化の日は、DIV 0とみなされます。画像から、それは明らかであるDIVとDIV 11〜15の間の文化のこのタイプの成熟した海馬ニューロン。 DIVの11と13で、ニューロンの樹状突起はfilipodiaと未熟な棘で覆われている。 DIVの15時と18は、ニューロンの樹状突起は、大きな棘は、より成熟した神経細胞の指標で覆われている。左パネル：異なる年齢のマウス海馬ニューロンの低倍率像。右のパネル：高倍率画像（左パネルのニューロンの樹状突起上でズーム）は、異なる年齢での樹状突起と神経細胞樹状突起の。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig2.jpg" /> インターフェイス培養法を用いて図2マウス線条体中型有棘ニューロン文化。画像内のニューロンは、DIV 8時です。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig3.jpg" /> 図3：スーパー黄道pHluorinタグ付きドーパミンD2受容体（PH-DRD2）を用いてトランスフェクトマウス線条体中型有棘ニューロン。左の画像は、タイムラプス記録の最大値投影（600画像、画像あたり100ミリ秒）です。白い矢印は、pH-Dの個々の小胞の挿入を示すRD2。この画像は、xyディメンションの挿入情報を保持しますが、時間情報が失われます。右の画像はXYTスタックがy軸の周りに90度回転させ、各x軸線上の最大ピクセルは、単一のy軸の画素に投影された、YT最大値投影を示しています。この画像はYT軸に沿って挿入情報を保持するが、x軸の情報が失われます。

<ol><li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation+by+DHHC5%2F8+targets+GRIP1+to+dendritic+endosomes+to+regulate+AMPA-R+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li>
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<li>Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AMPA+receptor+function+by+the+human+memory-associated+gene+KIBRA%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA.</a> Neuron. 71, 1022-1029 (2011).</li>
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<li>Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+trafficking+by+palmitoylation+of+two+distinct+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites.</a> Neuron. 47, 709-723 (2005).</li>
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<li>Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GluR1+links+structural+and+functional+plasticity+at+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses.</a> J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).</li>
<li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP%3A+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64, 381-390 (2009).</li>
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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

理由は不明ですが、マウスニューロンは常にラットニューロンよりも培養が困難です。私たちの経験では、マウス一次培養ニューロンにはニューロンとグリアの混合培養が有効です。しかし、このような混合培養はTIRFイメージング実験には適していません。なぜなら、このタイプの培養ではニューロンとその突起がグリア細胞の上に成長する傾向があり、ニューロンの細胞体や樹状突起がTIRF顕微鏡の届かない範囲に位置してしまうためです。したがって、TIRFイメージングには、カバーガラス上にグリアが少なく、ニューロンの密度が低い培養が理想的です。私たちはまずBanker法19;20を試しました。この方法では、培養皿の底にグリアを播種し、カバーガラスにニューロンを播種して、それを培養皿の中に逆さまに配置します。カバーガラスとグリア層は、カバーガラス上に置いた3つの小さなワックスの滴によって隔てられています。この方法は、小型のカバーガラス（15 mmまたは18 mmなど）ではうまく機能しますが、25 mmのカバーガラスを使用してテストしたところ、カバーガラスの中心付近のニューロンは、端付近のニューロンほど健康的ではありませんでした。
 <p c...

<table><tbody><tr><td>精製ウシコラーゲン溶液 (Purecol)</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液 (HBSS)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14185-045</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (Pen Strep)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10313-021</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>パパイン</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>ウシ膵臓由来デオキシリボヌクレアーゼ I (DNase I)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccoリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.05% トリプシン</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リシン臭化水素酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636-1G</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 168-500</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 無血清サプリメント</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>不活化馬血清</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668 019</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>培養用インサート</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr></tbody></table>

イメージング初代培養マウス神経細胞における形質膜に受容体の挿入をphluorinタグ付き

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

原形質膜（PM）と細胞内コンパートメント間の受容体の輸送を支配するメカニズムの理解は、優れた空間的および時間的な解像度で実験的なアプローチを必要とします。さらに、そのようなアプローチは、細胞内区画のものからPMに局在受容体を区別する能力を持っている必要があります。各小胞が受容体の数が少ないを運ぶので、最も重要なのは、単胞の受容体を検出することは、卓越した検出感度を必要とします。と細胞の化学固定を必要とするため、十分な時間分解能1-6を欠いている免疫標識表面受容体の蛍光顕微鏡検査、、受容体の輸送を調べるための標準的なアプローチは両方必要な空間および時間解像度を欠いている生化学的検出、続いて表面ビオチン化が含まれています。これらの制限を克服するために、私たちと他の人が開発され、新しいストラを採用してきた7月17日優れた空間的および時間的な解像度でPMに受容体の動的挿入の可視化を可能にtegy。アプローチでは、受容体のN末端 ​​細胞外ドメインにpH感受性GFP、superecliptic pHluorin 18のタグが含まれています。 Superecliptic pHluorinは、酸性pHで中性pH及び非蛍光液（pH &lt;6.0）での蛍光性のユニークな特性を持っています。したがって、細胞内輸送小胞またはエンドソーム区画の酸性ルーメン内タグ付けされた受容体は、非蛍光性であり、PMの外表面に、細胞外pH中性の環境にさらされた場合にのみ、それらは容易に可視になります。当社の戦略は、結果的に私たちは細胞内輸送小胞の中でそれらからPM表面受容体を区別することができます。十分な空間的および時間的な解像度だけでなく、受容体の動的輸送を研究するために必要な感度を達成するために、我々は採用反映内部合計私たちは光イメージング（〜170 nm）の最適な空間分解能を達成することができイオン蛍光顕微鏡（TIRFM）は、ビデオレート顕微鏡（30フレーム/秒）、感度の時間分解能は、単一GFPの蛍光を検出する分子。 TIRFM下イメージングpHluorinタグ付きの受容体によって、我々は直接培養神経細胞におけるPMに個々の受容体挿入イベントを可視化することができました。このイメージングアプローチは、潜在的にsuperecliptic pHluorinで標識することができる細胞外ドメインを持つ任意の膜タンパク質に適用することができ、異なる膜タンパク質（受容体、イオンチャネル、トランスポーター、など）の挿入をするために、管理キー詳細なメカニズムの解剖を許可します午後。

膜受容体の細胞外ドメインにsuperecliptic pHluorinをタグ付けし、培養マウスニューロンにおいてこれらの融合受容体をイメージングすることで、受容体の形質膜への個々の小胞挿入イベントを直接可視化することができます。本手法は、受容体の形質膜への挿入を制御する分子メカニズムを解明する上で極めて有用です。

イメージング初代培養マウス神経細胞における形質膜に受容体の挿入をpHluorinタグ付き

細胞膜（PM）と細胞内コンパートメントの間の受容体トラフィッキングを制御するメカニズムをより深く理解するためには、...

本実験の全体的な目的は、培養したマウス一次ニューロンにおいて、神経受容体が細胞膜に挿入される様子を可視化することである。このため、胚または新生仔マウスの大脳皮質からグリア細胞（GL）を採取し、半透過性のコラーゲンコート培養インサート上で育成する。このグリア細胞培養物を、カバーガラス上の一次胚海馬ニューロンの上に懸垂させる。その後7日間のコンディショニングを経て、ニューロンにsuper ecliptic fluorine標識ドパミンD2受容体をトランスフェクションします。標識された受容体は細胞内小胞に局在しますが、小胞内の酸性環境下では非蛍光状態のままとなります。しかし、小胞が細胞膜と融合すると、フルオリンが細胞外環境の中性pHにさらされ、強く蛍光を発するため、全内部反射蛍光顕微鏡（TIRFM）による検出が可能になります。この手法は、膜タンパク質の輸送分野における重要な疑問を解決するのに役立ち、グルタミン酸受容体やGタンパク質共役受容体など、フッ素で標識可能なあらゆる膜タンパク質の輸送を可視化することを可能にします。本日、私とともにこの手順を実演するのは、breeding dryと、研究グループの他のメンバー2名です。解剖の手順を行う前日に、コラーゲン溶液を入れたT 75フラスコを直立させて配置し、一晩乾燥させます。グリア細胞培養の日、グリア培地を37 °Cの恒温槽で少なくとも30分間温めます。安楽死させた後、解剖顕微鏡下で胚または新生マウスの大脳皮質を解剖します。摘出した皮質を、氷冷した人工脳脊髄液（A CSF）を満たした15 mLコニカルチューブに入れます。次に、A CSFを2 mLまで取り除き、100 µLのpepane溶液と20 µLの1% DNase Iを加えます。チューブを37 °Cの水槽に入れ、組織を20分間消化させます。消化後、プロパン溶液を慎重に除去し、予め温めておいたglial mediumを10 milliliters加えて、脳組織を丁寧に洗浄します。その後、組織を乱さないように注意しながら、glial mediumをできる限り除去します。2 mLの新鮮なグリア培地を加え、火炎滅菌したガラスパステライザーを用いて、組織が見えなくなるまでトリチュレーションを行います。組織が完全に分散した後、気泡が形成されないように注意してください。さらに8 mLの新鮮なグリア培地を加え、懸濁液を70 µmのセルストレーナーでろ過します。フロースルーを50 mLのコニカルチューブに回収します。2〜3個の胚から解離させた細胞をコラーゲンコートしたT 75フラスコに移し、組織培養インキュベーター内で37 °Cで一晩培養します。翌日、培地を吸引除去します。細胞を10 mLのPBSで1回洗浄します。次に、各フラスコに新鮮なグリア細胞用培地を10～15 mL加えます。培地を3～4日ごとに交換しながら、10～12日間培養します。コンフルエントになったら、グリア細胞をPBSで洗浄します。次に、0.05%トリプシンを5 mLフラスコに加え、37 °Cで5分間細胞を剥離させます。短時間のインキュベーション後、グリア培地を加え、ピペッティングしてフラスコ底面からGLを剥離させます。細胞を2本の新しいコラーゲンコートT 75フラスコに分注します。これらの細胞がコンフルエントに達したら、前述の方法でトリプシン処理し、各フラスコの内容物をコラーゲンコートした培養インサートを含む6ウェルプレートに播種します。2 mLのグリア培地の上に配置し、細胞を1〜7日間培養します。これらのグリア培養インサートは、神経細胞培養をコンディショニングするために使用されます。洗浄済みのポリリジンコートカバースリップが入った6ウェルプレートの各ウェルに、播種用培地を4 mL加え、37 °Cのインキュベーター内で一晩置きます。この手順は、翌日に残留ポリリジンを除去することで、神経細胞の生存率を高めるためと考えられます。播種用培地を除去し、2 mLの新しい播種用培地と交換します。海馬ニューロンの培養用に、2%のSupplement B 27を含む培地を調製します。解剖顕微鏡下で、胎生15〜18日のマウス4匹の脳組織から海馬を切り出します。切り出した海馬を、氷冷した解剖バッファーが入った15 mLコニカルチューブに移します。次に、E 15から18の胚マウス3匹の脳組織から線条体を摘出し、氷冷した解剖用バッファーを入れた別の15 mLコニカルチューブに移します。前述と同様に、ペプシンを用いて組織を消化します。その後、血球計数器を用いて測定します。各ニューロン懸濁液中の細胞数を測定し、播種する。各カバースリップに 0.4 × 10⁶ 個の細胞を播種し、37 °C のインキュベーターで一晩培養する。ニューロン培養のコンディショニング用グリア培養インサートを準備するため、グリア培養インサートおよびプレートから培地を吸引し、それぞれ 2 mL の新鮮な播種用培地と交換する。翌日、ニューロンを載せたカバースリップを、グリア培養インサートの下にあるディッシュの各ウェルに配置します。37 °Cでインキュベートを継続し、3〜4日ごとに、培地半分をB 27を含む温めた新鮮な維持培地に交換します。これを、トランスフェクションおよびイメージング実験の準備が整うまで繰り返します。ニューロンは培養7日目にトランスフェクションを行い、8日目にイメージングします。一貫したニューロン培養は、ライブイメージング実験を成功させるための鍵となります。この図は、本プロトコルを用いて培養したマウス海馬ニューロンのin vitro 11日目から18日目までの様子を示しています。画像から、ニューロンが広範な突起を発達させ、樹状突起が樹状突起棘で密に覆われていることが分かります。これは、それぞれのニューロン培養において、これらのニューロンが培養下で健全であることを示しています。2 $\mu$Lのlipectomyを2001 $\mu$gのDNAと混合し、super ecliptic Florinでタグ付けされたドーパミンD2受容体をコードしました。混合し、室温で20分間インキュベートします。インキュベーション中に、各グリア培養インサートの下側から1 mL、および内部から1 mLの培地を採取し、同じコニカルチューブに移します。次に、保存した培地に同量のB 27含有フィーディング培地を加え、37 °Cでインキュベートします。この培地は、20分間のリポフェクションDNAインキュベーション後、ニューロン培養の導入に使用されます。6ウェルプレートからグリア培養インサートを取り除きます。ニューロンが載っている各カバースリップに、200 µLのリポフェクションDNA混合液を添加します。培養膜の下に気泡ができないように注意してください。グリア細胞培養用インサートを戻し、37 °Cで2〜4時間インキュベートします。インキュベーション後、再度グリア細胞用インサートを取り出し、各ウェルからトランスフェクション溶液を吸引除去し、あらかじめ保存しておいた2 mLの培地をニューロンに添加して、グリア細胞培養用インサートを戻します。最後に、各インサートからグリア培地を除去し、保存しておいた培地を2 mLずつ各培養系に加えます。トランスフェクトしたCD NAの発現を促すため、さらに24～72時間培養します。このビデオで使用しているTIRFイメージングシステムは、励起用の100 mW シアンレーザーと、検出器としての電子増倍電荷結合素子（EMCCD）カメラを備えたカスタムセットアップです。イメージング開始の30分前に、人工脳脊髄液（aCSF）をウォーターバスで37 °Cに温めておきます。また、レーザー、カメラ、および加熱インサートの電源を入れ、加熱インサートを顕微鏡ステージに設置します。形質導入したニューロンが載ったカバーガラスをライブイメージングチャンバーに入れ、あらかじめ加温しておいたA CSFを迅速に加えます。チャンバーを顕微鏡ステージ上の加熱インサートに設置し、エピ蛍光イメージングモードで形質導入されたニューロンを特定します。その後、TIRFイメージングモードにて、細胞膜上の既存の蛍光を消去するため、ニューロンを1分間フォトブリーチします。次に、E-M-C-C-Dカメラの電子増倍器のゲイン設定を最大にし、10 Hzで1分間イメージングを開始します。すべての撮像が完了すると、各レコーディングに600枚の画像が含まれます。Image Jを用いてデータを解析し、ドパミンD2受容体の膜挿入を決定します。マウス線条体の中型有棘ニューロンに、super ecliptic fluorineタグ付きドーパミンD2受容体（DRD2）をトランスフェクションしました。次に生細胞TIRFイメージングを行い、100ミリ秒につき1枚の割合で600枚の画像を撮影しました。この画像はタイムラプス記録の最大強度投影を示しており、白い矢印はpH更新型DRD2を含む個々の小胞が細胞膜と融合した箇所を示しています。この画像はYT最大強度投影を示しており、ここではXYTスタックをY軸を中心に90度回転させ、各X軸ライン上の最大ピクセルを単一のy軸ピクセル上に投影しています。挿入のタイムラインに関する情報を提供するため、これらのデータは、この手法が開発後、培養マウスニューロンにおける受容体の細胞膜挿入の調節を調べるために有効に利用できることを実証しています。この技術は、ニューロン受容体のトラフィッキング分野の研究者が、他のニューロン細胞膜受容体、チャネル、およびトランスポーターの調節を探索するための道を開きました。

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、エレクトロポレーションと文化のマウス海馬および皮質のニューロンを経由してトランスフェクション、解剖するために必要な手順を説明します。長期培養がシナプスと樹状突起棘の解析の研究に使用することができますが、短期的な文化は、軸索伸長やガイダンスの研究に使用されることがあります。...

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

このレポートでは、ニューロンの細胞膜に発現する外因性、pH感受性GFPタグ融合タンパク質の表面発現、輸送経路や人身売買の速度を決定するための生細胞イメージングと光退色技術の使用について説明します。...

培養神経細胞における膜タンパク質の側方拡散とエキソサイトーシスは、蛍光回復と蛍光損失光退色を用いて評価

出典:Schönherr, S., et.al. は、マウス扁桃体におけるグルタミン酸受容体の入力特異的配置を調べるために、光遺伝学的免疫標識と凍結骨折レプリカ免疫標識を組み合わせました。J. Vis.

マウス脳組織の凍結破砕標本における神経膜タンパク質の免疫標識

出典: Lacin, E., et al.in vivoでの神経伝達物質の光学検出のための細胞ベースの神経伝達物質蛍光工学レポーター(CNiFER)の構築J. Vis. 経験。(2016年)このビデオは、マウス皮質に事前に注入された特殊なレポーター細胞である細胞ベースの神経伝達物質蛍光工学レポーター(CNiFER)を使用して、in...

細胞ベースの神経伝達物質蛍光工学レポーターを使用した神経伝達物質放出のイメージング

ここでは、光反応性の非天然アミノ酸を遺伝子的にコード化することにより、短い光パルスでニューロンタンパク質を選択的に活性化する手順を、培養中または生体内でニューロンで発現するニューロンに提示します。...

ニューロンに遺伝的にコードされた非天然アミノ酸を用いた神経タンパク質の光制御

pH感受性蛍光体で膜タンパク質の細胞外ドメインをラベリング、superecliptic pHluorin（SEP）は、細胞内局在、発現、および人身売買を決定することができます。全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の撮像SEP-標識されたタンパク質は、末梢ERおよび原形質膜中のタンパク質レベルの定量化を可能にします。...

細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

ここで、脳にアミロイド β (a β) の初期の影響を調査するためのプロトコルが表示されます。 これは、a β がクラスリン依存性エンドサイトーシスと軸索成長円錐の崩壊を誘発することを示しています。プロトコルは有用性軸索成長円錐の a β...

軸索の成長円錐の破壊とマウスの培養神経細胞の初期のアミロイド β 効果の可視化

本報告では、EGFPと目的のタンパク質との共トランスフェクトにより、胚ラット皮質ニューロンにおける神経伝達の増殖を研究するための簡単なプロトコルについて述べる。...

原発性ニューロンにおける神経質の増殖を研究するための強化された緑色蛍光タンパク質ベースのアッセイ

ここでは、中脳ニューロンのin vitro Ca2+ フラックスを測定するプロトコルと、プライマリマウス中脳培養を用いたカスパーゼ-3に対するその下流の影響を提示する。このモデルは、中脳ニューロンにおける異常なCa2+...

主マウス中脳ニューロンにおける自発的Ca2+ フラックスとその下流効果の定量化

ここでは、覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動を同時にイメージングするためのアデノ随伴ウイルス注入と頭蓋窓移植を組み合わせたプロトコルについて説明します。...

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

学ぶ pHluorinタグ付きドーパミンD2受容体を用いて、初代培養マウス海馬神経細胞における形質膜への受容体挿入を可視化する方法。この技術は神経細胞シグナル伝達と受容体動態の理解に貢献します。

イメージング初代培養マウス神経細胞における形質膜に受容体の挿入をpHluorinタグ付き

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