免疫沈降およびアシル-ビオチン所（阿部）による培養海馬神経細胞におけるタンパク質パルミトイル化の検出

この手順の全体的な目標は、シンプルで適応性の高い生化学的アッセイを使用して、培養ニューロンからポイド関連ニューロンタンパク質を分離および検出することです。これは、エチルまたはNEMの存在下で標的タンパク質を抽出して固定化し、すべての遊離チオール基を確実にブロックすることによって達成されます。第2のステップは、固定化された標的タンパク質をヒドロキシル平均またはハムで処理し、パルメートシステイン残基とパルミチン酸分子との間のチオエステル結合を切断することです。

これにより、Palmated シスチンスタイルのグループが解放され、3 番目のステップでラベル付けに使用できるようになります。固定化された標的タンパク質をビオチンB-M-C-C-Aファイル特異的分子にビオチンでタグ付けしてインキュベートすると、このビオチンは元々パイルであったシーレ基を上昇させ、タグを付けます。最後のステップは、Strp AdenのSDSページとウェスタンブロッティングにより、標的タンパク質のパチオンレベルを検出することです。

最終的に、IP A BEアッセイは、ニューロンの標的タンパク質に可逆的に結合したパルミチン酸脂質のレベルを示すために使用され、標的タンパク質の微妙な変化も検出できます。パテーションレベル。この手法は、タンパク質の検出、形質A掌による代謝標識を使用した手のひら切除などの既存の方法に対する主な利点は、アシルビオチン交換アッセイがより感度が高く、時間が少ないことです。

A BEアッセイは、手のひらの切断のより定量的な推定も可能にし、手のひらの切断のレベルの小さな変化を検出するのに最適です。この方法は、手のひら状タンパク質や培養海馬ニューロンの同定に関する洞察を得ることができますが、他の脳領域の初代神経培養、異種細胞株、さらには初代組織など、他のシステムにも適用できます。培養した初代海馬ニューロンから標的タンパク質の抽出を開始するには、このビデオに添付されている手順書に記載されているように、溶解バッファーとNEM溶液を調製します。

次に、0.5ミリリットルの2モルNEM溶液を新しい50ミリリットルのコニカルチューブに追加して、溶解バッファーとNEM溶液を組み合わせます。20ミリリットルの溶解バッファーを上に加えます。常にNEMエタノール溶液を最初に、溶解緩衝液を次に追加して、摂氏4度の冷蔵室で2つを適切に混合するために、混合物をロッキングプラットフォームにすばやく置き、5分間完全に混合します。

培養した初代ラット海馬ニューロンをインキュベーターから取り出し、培養方法を説明します。ニューロンは、培養したニューロンを氷の上に置いた後、テキストで見つけることができます。細胞培地をそっと取り出します。

ニューロンを冷たいリン酸緩衝生理食塩水で2回優しく洗います。次に、300マイクロリットルの溶解バッファーと50ミリモルNEMを海馬ニューロンの最初のウェルに加え、使い捨てのセルリフターを使用して細胞を掻き取ります。細胞ライセートを回収し、ライセートをそのグループの次のウェルに排出します。

セルリフターを使用して、2番目のウェル内の細胞をこすり落とします。収集し、必要に応じて3番目の井戸を使用して繰り返します。ライセートをさらに濃縮するには、細胞ライセートを予冷した1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに回収します。

100マイクロリットルの溶解バッファーと50ミリモルNEMを最初のウェルに加え、溶接スクレイピングプロセスを繰り返して、残りの細胞溶解物を収集します。全細胞溶解液を26ゲージと1/ハーフゲージのシリンジに5〜6回通し、機械的な溶解を助けます。溶液に泡を吹き込まないように注意してください。

遠心分離後、細胞ライセートを摂氏4度で少なくとも30分間変異させます。透明化した細胞ライセートを、氷上の新しいプレクール1.5ミリリットルチューブに集めます。実証されたハーベストプロトコルを、細胞のすべてのグループについて繰り返します。

BCAアッセイを使用して、すべてのライセートサンプル中のタンパク質濃度を測定します。製造元の指示に従ってください。細胞群から採取したすべてのライセートサンプルの量を正規化し、推奨される最小500 μgのタンパク質を正確に等しくします。

すべてのサンプルに溶解バッファーと50ミリモルNEMを合計500マイクロリットルに補充します。次に、標的タンパク質に対する一次抗体を1〜5μgずつ各ライセートサンプルに添加します。抗体ライセート混合サンプルを摂氏4度で一晩変異させてから、標的タンパク質を沈殿させて固定化します。

プロテインAまたはプロテインGコーティングされたSRO速度の50%スラリーを調製します 書かれたプロトコルに記載されているように。最後のステップとして、各抗体ライセートサンプルに等量の50%スラリーを添加し、摂氏4度で少なくとも1時間変異させます。aelを行うには、すべてのバッファーと試薬の適切なpHと温度、およびそれらの鮮度を交換することが重要です。

実験を成功させるため。ハムの切断は、異なるphsの溶解緩衝液を含む多数のチューブを調製して開始します。これらのステップではpHが非常に重要であり、常に調整する必要があります。

サンプルごとにpHメーターを使用して、2ミリリットルの溶解緩衝液(pH 7.2)と0.5ミリリットルのストリジェントな緩衝液を溶解緩衝液で調製します。また、サンプルあたり0.5ミリリットルの溶解バッファーと10ミリモルNEMを調製します。PMSFおよびプロテアーゼ阻害剤錠剤をすべての溶解バッファーに加えます。

ヒドロキシル平均またはハムは、パルメートシステインとパルミチン酸脂肪酸との間のチオエステル結合を切断するために使用されます。これは、パルメート化システインスタイルのグループを解放し、ビオチンによる標識に利用できるようにするために不可欠です。したがって、ハムの切断を省略することは、有用なネガティブコントロールとして役立つことができます。

抗体を細胞溶解物とインキュベーションした後、各サンプルについて、マイナスハムコントロールとしてラベル付けされた氷上に追加の1.5ミリリットルチューブを調製します。次に、ビーズを使用して、チューブを氷上に置き、すべてのサンプルビーズをGの0.5倍で摂氏4度で1分間静かに遠心分離します。上清を取り除き、ビーズを600マイクロリットルの溶解緩衝液と10ミリモルNEMに懸濁します。

Resusがすべてのサンプルビーズを懸濁した後、すぐに200マイクロリットルのサンプルライセートビーズスラリーを収集し、氷上のそのサンプルのマイナスハムチューブに排出し、各サンプルのライセートビーズスラリーの400マイクロリットルをプラスハムサンプルのチューブに残します。これは、ハム処理によって引き起こされる標的タンパク質の限定的な分解を説明するためです。ビーズの3分の1はマイナスハム処理に、残りの3分の2はプラスハム処理に使われます。

マイナスハムサンプルに、さらに300マイクロリットルの溶解バッファーと10ミリモルNEMを加えます。プラスハムサンプルに追加の100マイクロリットルをピペットで移し、各サンプルに合計500マイクロリットルをピペットで入れます。チューブを氷上で10分間インキュベートし、その後、サンプル洗浄後の書面による手順に従って、すべてのマイナスハムサンプルに対して溶解緩衝液pH 7.2のサンプルあたり0.5ミリリットルでサンプル洗浄を行い、マイナスハムおよびプラスハムサンプルの洗浄に進みます。

ハムバッファーのサンプルあたり0.5ミリリットルをすべてのプラスハムサンプルに追加します。その後、すべてのサンプルを室温で1時間変異させます。ハム処理後1時間を超えないようにしてください。

ビオチンBMCC標識によるアシルビオチン交換は、手順書に記載されているとおりに行ってください。ビオチンBMCCの標識が完了したら、本文に記載されているようにサンプルを優しく洗浄します。最終洗浄の上清を取り除き、ペレット化されたビーズをスラリーに残し、チューブの底にバッファーを残します。

先端が小径のピペットをスラリーを通してチューブの底に浸し、残っているバッファーをすばやく回収します。ビーズを拾わないように注意してください。各サンプルに40〜50マイクロリットルの2つのxサンプルバッファーと5ミリモルDTTを加えます。

必要に応じて。ビーズをボルテックスしてサンプルバッファーと完全に混合し、すぐに高速で遠心分離して、サンプルバッファーに浸したペレット内のすべてのビーズを収集します。サンプルを沸騰させて再度遠心分離した後、各サンプルの上清中の逃亡したタンパク質の全量を、ウェスタンブロッティングに適したポリアクリルアミドゲル内の1レーンに加えます。

SDS ページを使用して、1 つのサンプルのマイナス ハム コントロール エルとプラス ハム エルが互いに隣接して実行されるように、すべてのサンプルを整理します。A-P-V-D-Fまたはニトロセルロースメンブレンに移されたSDSページに続くSDSページで、手順書に記載されている洗浄とブロッキングでウェスタンブロッティングを開始し、TBSTと0.3%BSAの抗体溶液を調製し、蒸留水に1ミリグラム/ミリリットルで再構成したストレプトアビジンHRP抗体を添加します。メンブレンをTBSTで10分間1回洗浄します。

次に、メンブレンをストレプトアビジン抗体溶液中のロッキングプラットフォーム上で、室温で1時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。メンブレンをTBSTで3回、ロッキングプラットフォームで10分間洗浄します。パチオンシグナルを検出するには、化学発光基質キットを使用してHRP発光を露光し、免疫沈殿した目的タンパク質の量にパチオンレベルを正常化します。

ウェスタンブロットストリッピングバッファーを使用して、室温のロッキングプラットフォーム上で5〜10分間メンブレンをストリッピングします。免疫沈降に最初に使用された目的タンパク質に対する一次抗体を使用して、ウェスタンブロッティングステップを繰り返します。画像解析ソフトウェアを使用して目的のタンパク質のパチオンを定量し、免疫沈降タンパク質の量に対してパチオンレベルを正規化します。

I-P-A-B-Eアッセイは、基質タンパク質に沿ったシスチン残基のシルパチオンを特異的に検出し、免疫沈降ニューロンタンパク質のパチオンを検出するために使用できます。ハム切断を伴う免疫沈降ニューロンタンパク質の処理、パルミチン酸とシスティーナタール基との間のチオエステル結合により、新たに利用可能なファイルグループへのビオチンBMCCの特異的な取り込みが可能になり、その後、ウェスタンブロッティングを使用して検出できます。ハムの切断が省略されているため、ビオチンBMCCの取り込みが妨げられ、プラスハムサンプルの特定のポイドビオチンの高揚に対するネガティブコントロールとして機能します。

したがって、マイナスハムコントロールは、SDSページによるウェスタンブロッティング用のプラスハムサンプルに常に隣接して実行する必要があります。最適化された実験では、ニューロンタンパク質デルタカテニンのパチオンシグナルは、HRPと結合したストレプトアビジンを使用して1マイクロモルの濃度でビオチンBMCCをブロッティングすることにより、パラレルマイナスハムサンプルとプラスハムサンプルに対して容易に検出できます。デルタケインの特異的パチオンシグナルは、プラスハンドサンプルでのみ160キロダルトンの予測サイズで現れます。

このシグナルの特異性は、最初に免疫沈降に使用された特異的抗体を用いてデルタカテニンを再調査することで確認され、その結果、両方のハム処理で同じ予測サイズでシグナルが得られました。I-P-A-B-Eアッセイの最適化により、プラスハムサンプルと容易に区別でき、パチオンシグナルが最小限またはまったくないマイナスハムサンプルのウェスタンブロッティングプロファイルが得られます。PALMATED CYSTINESの標識に使用されるビオチンBMCCの濃度は慎重に最適化する必要があり、A BE化学ステップ中にビオチンBMCCの過飽和濃度を使用すると、過剰なバックグラウンドおよび非特異的なシグナルが見られます。

デルタカティーンと手のひらの切断のためのマイナスハムサンプルとプラスハムサンプルの中で得られたストリッピングされたアビッドインウェスタンブロブプロファイルは、異なるサイズの追加のバックグラウンドシグナルを持つ4マイクロモルビオチンBMCCで処理すると類似しているように見えます。ヒドロキシラミンは、標的タンパク質の分解を限定的にもたらす強力な還元剤であるため、マイナスハムサンプルとプラスハムサンプルに使用される免疫沈降タンパク質の量を正常化する必要があります。標準化には、プラスハムサンプルとマイナスハムサンプルの2倍の量の固定化標的タンパク質を使用する必要があり、その結果、デルタカテニンで示されているように、標的タンパク質のウェスタンブロッティングプロファイルが区別できなくなります。

しかし、固定化された標的タンパク質の量がマイナスハムサンプルとプラスハムサンプルの間で標準化されていない場合、デルタカテニンで示されたように、プラスハムサンプルの標的タンパク質のウェスタンブロットシグナルが失われる可能性があります。このビデオを見れば、培養した海馬ニューロンから選択したニューロンタンパク質を抽出する方法についてよく理解できるはずです。BEケミストリーを使用して、それが手のひら切除のための基質であるかどうかを最小限の時間で検出し、このプロトコルを他の細胞株や組織での使用に適合させることができます。