Name: の臨床応用眠れる森の美女と人工抗原提示細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学ぶ、Sleeping Beautyシステムを用いてT細胞を遺伝子改変し、人工抗原提示細胞上でCAR陽性T細胞を選択的に増殖させる方法。B細胞悪性腫瘍治療への応用が期待される。

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著者はSBシステムのヘルプについてAAPCクローン＃4および博士ペリーハケット（ミネソタ大学）を生成し、提供する助け博士カール6月（ペンシルバニア大学）に感謝したいと思います。 助成金：がんセンターコアグラント（CA16672）; RO1（CA124782、CA120956、CA141303）、R33（CA116127）、P01（CA148600）; SPORE（CA136411）、アルバート·J·ウォード財団、バローズ·ウェルカム財団; Gillson Longenbaugh財団、がん予防とテキサスの研究所、CLLのグローバル·リサーチ財団国防総省; Noelan L. Biblerの不動産、ハリー·T Mangurian、ジュニア、白血病の免疫療法のための基金、個人化された癌治療の研究所、白血病とリンパ腫協会、リンパ腫研究財団; MDACCの姉妹機関ネットワーク基金、ミラー財団;氏ハーブシモンズ;夫妻ジョー·H·スケール;氏トーマス·スコット、がん研究のための国立財団、小児がん研究財団、生産Assistancウィリアム·ローレンスとブランシュヒューズ子供財団、セルラーセラピー（PACT）のためのe。

<html> 0日または前 1。 PBとUCBから単核細胞の単離（MNC） <ol><li> PBS-EDTAの4つのボリュームと等量のPBを希釈し、UCB。 </li><li> 40分（ブレーキなし） - 50 ml遠心チューブ（s）および30の場合は400×gで遠心分離でフィコール上にゆっくり層希釈血液（25ミリリットル）（12ミリリットル）。 </li><li>新鮮な50mlの遠心管にピペットを用いて単核細胞分画（インターフェイス）を収集し、転送します。 </li><li> PBS-EDTAで50ミリリットルのボリュームを上げ、10分間450×gで遠心分離します。 </li><li>完全培養メディア（CCM）と、10分間、400×gで遠心50mlの上澄み、そっと再懸濁細胞ペレット（s）を吸引除去する。 </li><li>穏やかに再懸濁させ、プールCCMで細胞ペレットを、トリパンブルー排除法（Cellometer、PBMCプログラム）を使用して細胞数を実行します。 </li><li> MNCは、今やエレクトロポレーション（クレオ）に使用するか、または将来の使用のために凍結保存することができます。 </li></ol>0日目エレクトロのためのT細胞のタイトル &quot;&gt; 2。準備<ol><li>凍結保存したMNCを使用している場合は、速やかに37℃の水浴でフルスケールのエレクトロポレーションのための十分な細胞（2×10 8は、遠心分離して2時間のインキュベーションの間にセル損失を考慮して約20％を加算）解凍します。新たに単離された使用している場合はMNCは2.3に進みます。 </li><li>穏やかに再懸濁すると予め温め完全フェノールを含まないRPMI培養培地（PF-RPMI）と10分（ブレーキなし）、吸引液上清を200×gで遠心分離を含んでいた適切なサイズの遠心管（S）にセルを転送します。 </li><li> PF-RPMI中MNCを再懸濁させ、細胞数（Cellometer）を実行し、10 6細胞/ mlの濃度で適切な大きさの細胞培養容器（S）にセルを転送します。 </li><li> 2時間加湿37℃/ 5％CO 2インキュベーター±30分でインキュベートする。 </li><li>滅菌遠心管（S）、5分（ノーブレーキ）の場合は200×gでスピンにMNCを移し、静かに上清およびrを吸引電子サスペンドおよびPF-RPMI中で細胞ペレット（s）を兼ね備えています。 </li><li>細胞数（Cellometer）を実行し、（2×10 8 MNC）は必須の細胞懸濁液の体積を計算する。 </li><li>滅菌した50ml遠心管と10分（ブレーキなし）の場合は200×gでスピンに計算されたボリュームを転送します。 </li><li>残存メディアが管の側面を軽くたたいて残っていないと穏やかに再懸濁するように上清を吸引します。 </li></ol> 3。 0日MNCのエレクトロポレーション（クレオ）（10キュベットを使用したフルスケールのプロセス） <ol><li>加湿37℃/ 5％CO 2インキュベーター中で暖かいPF-RPMI 4mlを含む10ウェルで無菌の12ウェルプレートを前置します。 </li><li>ヒトT細胞キット（、製造元の指示に従って再構成された準備とプレ暖かいロンザヌクレオソリューション<a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a>バイオセーフティキャビネット（BSC）で周囲温度に）。 </li><li>アドインによるヌクレオソリューション/ DNAのマスターミックスを調製する補足したヌクレオ溶液1gを100μl、トランスポゾン15μgの（CD19RCD28/pSBSOとして指定されたプラスミド超らせんDNA）と反応/キュベット当たりトランスポザーゼの5μg（のpCMV-SB11として指定されたプラスミド超らせんDNA）。 </li><li>優しく遠心管の側面を軽くたたいて細胞ペレットを（ステップ2.8から）分散とヌクレオソリューション/ DNAマスターミックス（最終細胞濃度：2×10 7 cells/100μl）で再懸濁する。 </li><li>慎重に気泡がないように注意しながら、10（10）ロンザクレオキュベットのそれぞれに細胞懸濁液（ステップ3.4）100μlを移す。 </li><li>一度キュベットをタップし、プログラムのU-014（非刺激T細胞の場合）を使用して、エレクトロポ。 </li><li> BSCにキュベットと12ウェルプレート（ステップ3.1）を転送します。 </li><li>セントで準備対応するウェル（12ウェルプレートからあらかじめ温めておいた培地の〜500μlを添加して、Amaxa細かいチップホールピペットを用いて、各キュベットからエレクトロポレーションした細胞を収穫ウェブ3.1）と2時間加湿37℃/ 5％CO 2インキュベーター±30分に板を返す。 </li><li> 2時間インキュベートし、収穫の後、全てのウェルから無菌遠心チューブに細胞を移す。 </li><li> 8分、周囲温度、ブレーキなしで140​​×gで遠心分離により細胞を洗浄し、残存培地は、細胞ペレットをカバーしていないように上清を吸引して廃棄します。 </li><li>優しく遠心管の側面を軽くたたいて細胞ペレットを分散させ、穏やかに、単一細胞懸濁液を達成するために、CCMで再懸濁する。 </li><li>細胞計数を行い、CCMで10 6細胞/ mlになるように細胞濃度を調整します。 </li><li>一晩インキュベーター内で細胞培養フラスコ（s）と場所に細胞懸濁液を移す。 </li><li> EGFP-トランスフェクトされた細胞（5×10 6細胞/キュベット5μgのAmaxa制御EGFPプラスミドスーパーコイルと、pmaxGFP）：プロセスステップ2.1から3.8までは、制御のために繰り返された。 </li></ol>第1回とその後の1日目刺激サイクル 4。 1日目のフローサイトメトリーによるCARの発現解析<ol><li>エレクトロポレーションした細胞を回収し、トリパンブルー排除法（血球計数器）を使用して細胞数を実行します。 </li><li> CD3、CD4、CD8、およびヒトIgGFcγ受容（CAR発現の測定など）が特異的な抗体で染色した細胞（1〜2×10 6）。 </li><li> FACSソウルキャリバー上のセルを取得し、CARの発現を計算するために、FCS Expressソフトウェアを使用してデータを分析します。 <ol><li> CARを計算+計算式によって、培養細胞： （総生存細胞数）×（％カー+細胞）CARのナンバー= +細胞 </li></ol></li></ol> 5。 1日目AAPCの調製（クローン＃4）。 AAPCは、（クローン＃4）を共発現希望のT細胞共刺激分子にK562細胞（アメリカン·タイプ·カルチャー·コレクションより入手親のライン）から派生した<ol><li> 37で凍結100 Gyの照射AAPCのアリコートを解凍°、Cの水浴。 </li><li>細胞は、400×gで遠心分離することにより回洗浄CCMで10分とCellometer（トリパンブルー排除）を用いて計測されています。 </li><li>刺激のために必要な実行可能なAAPC数を計算します。 照射AAPCの（車のナンバー+細胞）×2 =いいえ必要 </li></ol> 6。 CARのAAPC媒介刺激+1 stと後続刺激サイクルの1日目から開始して、T細胞<ol><li> CCMで：エレクトロポレーションした細胞（CARを発現する）と1:2の比率（生AAPC CAR +細胞）で滅菌した容器内のγ線照射AAPC（クローン＃4）を混ぜます。 <ol><li> AAPC比は、フローサイトメトリーエレクトロポレーション後の日に基づいて、CARの発現のために調整されています 。 </li></ol></li><li>細胞懸濁液に、IL-21（30 ng / ml）を追加します。 </li><li> 10 6細胞/ mlの濃度でT-75cm 2フラスコ（s）及び/またはVueの生活文化の袋にアリコートとincubatに戻すまたは。 </li></ol> 3日、5 7。 CARの継続的な文化+ T細胞<ol><li>ハーフメディア変更を行うに、IL-21を補充し、10 6細胞/ mlの濃度でT細胞を維持している。 </li></ol> 7日目 8。まずAAPC媒介刺激サイクルの終わり<ol><li>収穫細胞は、カウントと染色CD3、CD4、CD8、とFcγ（CAR）のために、10.1に進みます。 </li></ol> 9。 CD56 +細胞 （エレクトロポレーション後通常7〜14日）の枯渇<ol><li>常磁性ビーズを用いたCD56枯渇を実行する場合は、CD56 +、CD3 NEGリンパ ≥10％。 </li></ol>刺激サイクル＃2、＃3、＆日数に対応4位→14日15→21＆22日→28 10。臨床的に十分な数値にT細胞を伝播するAAPCの再帰追加<ol><li> stimulatioを繰り返しn個のプロセス（4回）は4.3から8.1の手順で説明したように。 </li><li> ＆その後、各メディアの変更（週三回、月曜日〜水曜日·金曜日のスケジュールで）で7日、14および21日から文化へのIL-2（50U/ml）を追加します。 </li><li>凍結保存（アーカイブ）、必要に応じて過剰なT細胞。 <ol><li> T細胞は、制御された速度の冷凍庫を使用して凍結した。 </li></ol></li></ol> 28日目 11。ハーベストT細胞：最後AAPC媒介刺激サイクルの終わり<ol><li>リリーステストと点滴用のT細胞を凍結保存。 </li></ol>

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特別な利害関係は宣言されません。

そのようなpiggyBac 12,19とSBから18,20-22としてトランスポゾン及びトランスポザーゼシステムは、臨床グレードのCARのウイルス媒介形質+ T細胞に代わるものです遺伝子治療への非ウイルス性のアプローチである。 SBは、ヒトの遺伝子治療1,6,23のためにそのポテンシャルに基づいて遺伝子導入系として選ば ​​れた。我々はSBの転位（CARを導入する）とコンプライアンスにおけるTAA特異的T細胞の製造におけるプラットフォーム技術として機能するγ線照射AAPCの再帰的加算（安定CARを発現する遺伝子改変されたT細胞を取得する）の二重の技術を開発第I / II相試験のためのcGMP（ 図4）。 γ線照射AAPC上の共培養の28日間（4の7日間刺激サイクル）の後、我々は一般的に人間のアプリケーションに適した少なくとも10〜10遺伝的に改変されたT細胞を生成することができます。必要に応じて、追加の刺激サイクルはtを行うことができるO遺伝子改変されたT細胞の大きい番号を生成します。まして車+ T細胞が必要な場合さらに、エレクトロポレーションおよび伝播へのアプローチは、バック少ないキュベットを採用し、それぞれの先頭にフォワードAAPC上の増殖のその後のラウンドのために数値的に展開し、T細胞のちょうど部分集合を運ぶスケーリングすることができます刺激サイクル。の大半は、エレクトロポレーションおよび注入安定CARを表現するために採取したT細胞を伝播します。 CD4 +およびCD8の伸長は、当社の第2世代CARを発現している+ T細胞は、メモリ/ナイーブ表現型を有する細胞が含まれており、リダイレクトされた特異性の3の特徴を示す。まず、遺伝的に改変されたT細胞は、具体的に、第二に、CD19 +標的を溶解するCD19 +刺激細胞に反応してIFN-γを生産し、第三に、CD19に応答して増殖+フィーダー細胞、車に依存した方法13,18のすべてを。 integrのに我々のアプローチSBシステムから非ウイルス性DNAプラスミドの電気伝達によってCARの導入遺伝子を食べたはPBとUCB由来静止一次T細胞で行うことができる。私たちと他の人は遺伝的に効率的に注入24,25のためのT細胞の臨床的に十分な数を伝播するAAPCとして機能するようにK562細胞を変更しました。 AAPCおよび組織培養環境（ 例えば、IL-21の添加）を生成するように変更されましたされている患者及び造血幹細胞移植後の注入のためのCD19特異的T細胞（ 表1）13,18 をドナー由来。我々は、CARを生成することができます+コスト、不快感、およびアフェレーシスによってPBからMNCを取得する不便さを回避し、単に静脈穿刺によって得られたPBからT細胞。 MNCの小さな数字からCAR多数+ T細胞を誘導する能力は、特に同種UCB移植後のT細胞を注入するため魅力的です。新生児のドナーのサイズが小さいと匿名性を排除し、再·アクセス後の時点でこの個体を収穫したMNCの限られた数字は、造血との干渉を回避するために、T細胞の製造のための出発物質として使用可能です。製造工程へのさらなる進歩は現在取り扱いを最小限にするために完全に閉じたWAVEバイオリアクターと相まって、高スループットのエレクトロポレーション装置を含めるようにして進められている。集計では、SBとAAPCは、CD19特異的CAR +のcGMPに準拠した代替細胞表面TAAを認識することができる遺伝子改変されたT細胞の大規模な番号を生成するように適合させることができるT細胞を生成するためのプラットフォームをアピールしている。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> ベンダー </td><td> カタログ番号 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td> DNAプラスミドGFP発現（pmaxGFP） </td><td>ロンザ</td><td> VPA-1002（キット） </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td>シグマ</td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA </td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 70026 </td><td></td></tr><tr><td> HYQ、RPMI-1640 </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td>フェノールフリー、RPMI-1640 </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td>ハイクローンウシ胎児血清</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td>グルタ（100倍） </td><td>ギブコ</td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td>のFicoll-Paque </td><td> GEヘルスケアバイオサイエンス社</td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIL-21 </td><td>ぺプロ</td><td> AF-200から21 </td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIL-2（Proleukin） </td><td>ノバルティス</td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td>ヒトT細胞キット（ヌクレオソリューション） </td><td>ロンザ</td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS CD56試薬</td><td>ミルテニー</td><td> 70206 </td><td></td></tr><tr><td>ヒトCD3に対するマウスモノクローナル抗体の特定のFITC結合</td><td> BD Biosciences社</td><td> 349201 </td><td></td></tr><tr><td>ヒトCD4に対するマウスモノクローナル抗体の特定にAPC標識</td><td> BD Biosciences社</td><td> 340443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5共役ヒトCD8に対するマウスモノクローナル抗体の特定に</td><td> BD Biosciences社</td><td> 341051 </td><td></td></tr><tr><td> PE結合のF（ab &#39;）人間のための具体的なヤギ抗体の2断片へのFcγ </td><td>インビトロジェン</td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 消耗品 </td></tr><tr><td> 12ウェルプレート</td><td>コー​​ニング</td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-75cm 2フラスコ</td><td>コー​​ニング</td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td>培養バッグ</td><td> Vueの生活</td><td> 290C、750C </td><td></td></tr><tr><td> 50ml遠心チューブ</td><td> BD Biosciences社</td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><sチョン·&gt;設備</td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector II </td><td>ロンザ</td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td>バイオサイエンスNexcelom </td><td> Cellometerビジョン</td><td></td></tr><tr><td>ソーバルレジェンドRTの遠心分離機</td><td>ソーバル</td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACSソウルキャリバー</td><td> BD Biosciences社</td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td>制御された速度の冷凍庫</td><td>プレーナー</td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td>照射器</td><td> CISバイオインターナショナル</td><td> IBL-437、C＃09433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 分子の発現（内因性と導入） </td></tr><tr><td> 細胞株 </td> &lt;TD&gt; 共通名 </td><td> 細胞型 </td><td> 分子が発現した </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 </td><td>クローン4 </td><td> K562 </td><td> CD86、CD64、CD137L、CD19、GFP、IL-15に結合した膜との共発現</td></tr></tbody></table> 完全培養メディア（CCM）で （最大30日間まで4℃で保存） HYQ RPMI-1640/Phenol-free、RPMI-1640 10％のFBS 1パーセントグルタ フローサイトメトリーバッファ （最大30日間まで4℃で保存） PBS 2％のFBS 0.1％アジ化ナトリウム</td></tr></tbody></table>

の臨床応用<em&gt;眠れる森の美女</em遺伝的に末梢及び臍帯血由来のt細胞を変更する&gt;と人工抗原提示細胞

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

臨床グレードのT細胞の効力は、腫瘍関連抗原の上司は、（i）認識（のTAA）、（ii）の注入後、永続性、（ⅲ）の可能性と生物学的製品を設計するために免疫療法と遺伝子治療を組み合わせることによって改善することができます腫瘍微小環境内のエフェクター機能をリサイクルする腫瘍部位への移行の可能性、及び（iv）能力。人間のアプリケーションのために設計さT細胞の遺伝子操作のほとんどのアプローチは、CAR 1-3の安定発現用レトロウイルスやレンチウイルスを用いてきた。それは、生産設備の限られた数から臨床グレードの組換えウイルスの製造とリリースに依存しているので、このアプローチは、現在の適正製造基準（GMP）に準拠していますが、高価になることができます。 DNA種がrecombinの約1/10のコストで臨床グレードに製造することができるので、非ウイルスプラスミドの電気伝達は伝達に魅力代替手段です蟻GMPグレードのウイルス。統合の効率を改善するために、我々は人間のアプリケーション4-8 ビューティー （SB）トランスポゾン及びトランスポザーゼスリーピング適応した。私たちのSBシステムは、目的の遺伝子をコードするトランスポゾン（ 例えば第2世代CD19固有のCAR導入遺伝子、CD19RCD28と命名）とTAジヌクレオチドリピートに挿入トランスジーンをトランスポザーゼ（ 例えば SB11）9-11から成る2 DNAプラスミドを使用する。遺伝的に改変されたT細胞の臨床的に十分な数を生成するために、我々は、TAA（ 例えば CD19）ならびにT細胞の共刺激分子CD86、CD137Lを発現するように改変されたK562由来人工抗原提示細胞（AAPC）（クローン＃4）、使用膜結合型インターロイキン（IL）-15（ペプチドが修飾されたIgG4のFc領域に融合）とCD64モノクローナル抗体のロード用（FC-γ受容体1）（mAb）は12のバージョン。本稿では、compliaで行うことができる手順を示しCD19-CAR +ヒト固有のアプリケーションに適したT細胞を生成するためのcGMPとNCE。これは、γ線照射AAPCのあらゆる-7日間の追加（刺激周期）により、安定した組込みの取得後に2つのDNAプラスミド、SBトランスポゾン（CD19RCD28）とSBトランスポザーゼ（SB11）の電気転送同期することによって達成された可溶性組換えヒトIL-2とIL-21の13の存在下で（クローン＃4）。典型的には4サイクル（連続培養の28日間）が安定的にCARを発現するT細胞の臨床的に魅力的な番号を生成するために実施されている。製造臨床グレードのCD19特異的T細胞にこの方法論は、末梢血（PB）や臍帯血（UCB）由来のT細胞に適用することができます。さらに、このアプローチはAAPCのCARによって認識のTAA、、の発現と導入CARの特異性を組み合わせることで多様な種類の腫瘍に対するT細胞を生成するために利用することができます。

我々は、DNAプラスミドおよびγ線照射AAPC上でのT細胞の増殖の電気転送が人間のアプリケーションのためにPBとUCB由来のT細胞の臨床的に魅力的な番号を生成するために使用することができることを報告する。これらの遺伝的に改変されたT細胞は、主要組織適合遺伝子複合体の独立したTAA CD19を認識導入CARを発現している。 SB由来のDNAプラスミドは、CD28およびCD3-εを介して信号14、および（ii）トランスポゼース、SB11 15は 、以前に13を説明してきたが、16,17、（ⅰ）トランスポゾン、第2世代CARを（CD19RCD28）表現する。現在の研究で使用されるプラスミドはWaisman臨床バイオ製造施設（Madison、WI）を​​することによって商業的に生産された。 K562細胞（アメリカン·タイプ·カルチャー·コレクションから得た親株）由来AAPC（クローン＃4）、共発現するT細胞の共刺激分子（AAPCの細胞表面上の3 90％でそれぞれ導入された分子）を必要に応じて、前述の12を説明した 。ここでは、 図1（数値、CARに依存した方法でT細胞を拡大するAAPCを加えて、CARを紹介してSBの転位を用いたPBまたはUCB由来のCD19特異的T細胞は単核細胞（MNC）から生成できることを示す、4）13,18。十キュベット（2×10 7 MNC /キュベット）はトランスポゾン（CAR）をコードするプラスミドDNA15μgの（CD19RCD28/pSBSO）及びトランスポザーゼ（SB11）をコードするプラスミドDNA5μgを（のpCMV-SB11）を使用して、受信者ごとにエレクトロポレートされています。 MNCが制限または研究室での作業のために縮小されている場合キュベットの数を減らすことができる。エレクトロポレーションの日は刺激サイクル＃1の &quot;0日&quot;と定義されます。フローサイトメトリーおよび培養条件の対照として、自己のT細胞はモックエレクトロポレーション（DNAなしプラスミド）と数値的にT細胞を維持するために、クロスリンクにOKT3 CD3で事前にロードされていたγ線照射AAPC（クローン＃4）上で展開される増殖。 WE Routinelyエレクトロポレーション（ 図2B）の翌日T細胞のエレクトロと生存能力の効率を評価する。この初期の時点でコントロールDNAプラスミド（pmaxGFPと称する）と、CARからEGFPの発現は、統合およびエピソームプラスミドからのタンパク質発現を反映している。典型的には、エレクトロポレーション後の日、私たちは40から50パーセントの間でのT細胞の生存と約40％（ 図2A）で約60％と、CARの発現にEGFP発現を測定します。可溶性組換えヒトIL-2とIL-21の存在下でγ線照射AAPCの再帰的な追加が安定し、CAR（CD19RCD28）を発現するT細胞を取り出す。これらのNK細胞の割合が≥10％であり、T細胞上に発現CARの割合が低い場合は特に場合はCD3 NEG CD56 + NK細胞は、CD56特異常磁性ビーズを用いて培養液から枯渇している。この枯渇はproliferatioを維持するためにAAPCの能力を妨害するNK細胞の急速な増殖を防ぎますCARのn + T細胞。機会に、CARからNK細胞の枯渇+ T細胞は、最後の2つの刺激のサイクル中に行われますが、これはいくつかの車の上にCD56の共発現+ T細胞に起因する所望の細胞の損失を導入しています。 T細胞は、14日目を過ぎてVueの生命培養バッグを使用して、機能的に閉鎖系で増殖させた。遺伝的に改変されたと伝播T細胞のサブセットは、通常、将来の分析のためにアーカイブされた物質の供給源として機能することとなるようにAAPC上の共培養の14日目または21日目（刺激サイクルの終わり＃2または＃3）で凍結保存さ予期せぬ問題が続いて、製造工程中に発生した場合は解凍した。 T細胞は、典型的には、（ 図3）や文化の日の約28収穫され、その日常急行&gt; 90％のCARとアール&gt; 80％生存（ 図2C、D）。我々は以前AAPC上の共培養の4週間後のCD3平均倍膨張+ T細胞が19800であることが示されている±CAと11313を<html> R +は発現が90％で±7.5 13。これらのT細胞は、凍結保存とし、製造された製品の安全性と治療の可能性に知らせるリリーステストプロセス内で受ける。リリーステストの前臨床試験レシピエントへの注入に分析証明書を生成するための臨床検査改善修正（CLIA）に準拠して行われる。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> 図1は。CAR + PBとUCBからT細胞をエレクトロポと伝播するプロセスを概説する手順。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するにはここをクリック</a> 。 upload/50070/50070fig2highres.jpgは &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg &quot;/&gt; 図2。 PBから遺伝的に改変されたT細胞のキャラクタリゼーション。（）遺伝子導入の効率を評価するための第1の刺激周期の0日目にEGFPの発現。 CD19固有CD3にフローサイトメトリーによって評価として、CAR（CD19RCD28）+、CD8 +およびCD4 +エレクトロポレーション後（B）は約24時間でT細胞の発現と、（C）28日間共培養後AAPCに。 CARの類似の表現はUCB由来T細胞で観察された。 （D）は、CARの発現の速度論。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> 図3。 PB由来CARの伝播CD3 +およびCAR +組換えヒトIL-2可溶性およびIL-21の存在下でγ線照射AAPCで繰り返さ共培養することにより、PB由来T細胞の数値拡大+ T細胞。レート。上向きの矢印は、各刺激サイクルの始まりをマークすることをγ線照射AAPCの追加を示しています。 UCB由来のCAR + T細胞は、数値の拡張と同様の速度を示す。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> 図4。遺伝的にCARを変更して、伝播する+ PBとUCB由来のT細胞をSBとAAPCシステムを用いた製造プロセスの概略。CD19特異CAR + T細胞は、SB由来の超らせんDNAプラスミドの電気伝達と共培養後続によって生成されたプレゼンスoのK562由来AAPC（クローン＃4）上のF組換えヒト可溶性IL-2とIL-21 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するにはここをクリック</a> 。 <table border="1"><tbody><tr><td width="5"> T細胞ソース </td><td width="9"> トランスポゾン* </td><td width="9"> トランスポザーゼ </td><td width="26"> T細胞注入 </td><td width="1"> IRB＃ </td><td width="1"> NIH-OBA＃ </td><td width="1"> IND＃ </td></tr><tr><td>自家（患者由来）** </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td>自家造血幹細胞移植後の</td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14193 </td></tr><tr><td>同種（ドナー由来） </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td>同種造血幹細胞移植後の</td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><tD&gt; 14577 </td></tr><tr><td>同種（ドナー由来） </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td>同種臍帯血移植後の</td><td> 2010-0835 </td><td> 1001-1022 </td><td> 14739 </td></tr></tbody></table> *表1。 CD19特異CAR + T細胞を注入するMDACCにおけるFDAの後援の下に臨床試験がAAPCに伝播されます 。 T細胞は、そのCD28およびCD3-εを介して信号指定CD19RCD28、第2世代のCARをコードSBトランスポゾンの強制発現により、CD19に特異的にレンダリングされます。 **トライアルは参考文献5に記載されて。

CD19特異的キメラ抗原受容体（CAR）を発現するT細胞は、私たちのファースト·イン·ヒトの遺伝子治療の臨床試験におけるB細胞悪性腫瘍の治験治療として注入される。我々は、使用して、T細胞の遺伝子改変を記述<em&gt;眠れる森の美女</em&gt;（SB）のデザイナー、CD19 +人工抗原提示細胞上のCD19特異的CARと選択的伝播を紹介するシステム。

の臨床応用<em&gt;眠れる森の美女</em遺伝的に末梢及び臍帯血由来のT細胞を変更する&gt;と人工抗原提示細胞

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

このプロトコルは、T細胞を遺伝子組み換えして腫瘍抗原に特異的なキメラ抗原受容体を導入し、その後、デザイナー人工抗原提示細胞上に臨床的に有意な数を増殖させます。眠れる森の美女の電気転写から始めます。末梢または臍帯血から単離された静止性単核細胞にA DNAプラスミドを転置および転位します。次に、フローサイトメトリーを使用してトランスフェクション効率を測定します。次に、トランスフェクトT細胞をK 5 62由来人工抗原提示細胞上で7日間にわたってトランスフェクションし、4週間の刺激で外因性サイトカインを添加した。増殖サイクルは、凍結保存を分析し、エレクトロポレーションおよび増殖したカー陽性T細胞をヒトに適用するために放出するために進行します。眠れる森の美女のトランスポーズシステムは、選択した細胞に遺伝子を安定して導入するためのウイルスベースの遺伝子導入アプローチに代わるものを提供します。眠れる森の美女システムの主な利点の1つは、違法な非相同組換えによって統合するDNAプラスミドと比較して、本当に低コストで遺伝子を統合できることです。したがって、利点は、眠れる森の美女システムを使用して、低コストかつ高効率で遺伝子を発現できることです。一般に、この方法に不慣れな個人は、人工抗原提示細胞上でのカー陽性T細胞の選択的増殖におけるエレクトロT細胞の効率を最初に克服する必要があります。どちらのステップも、共同培養が必要なため、習得するのが困難です。人工抗原提示細胞上の遺伝子改変T細胞。この方法は、養子免疫療法の分野、特に効果的な遺伝子送達および臨床的に有意な数のT細胞の作製において有用です。免疫系のT細胞は腫瘍特異的に修飾できるため、より広範な用途は癌の治療にまで及びます。手順を実演するのは、マーガレット・ドーソンとマシュー・フィオラです。私の研究室の技術者は、まず、末梢血を等量のP-B-S-E-D-T-Aで希釈し、臍帯血を4つの容量のP-B-S-E-D-T-Aで希釈し、希釈した血液25ミリリットルを12ミリリットルのフィアルに50ミリリットルの遠心分離管でゆっくりと重ねます。フィアルグラジエントを400Gで30〜40分間、休憩なしで遠心分離します。次に、単核細胞画分をP-B-S-E-D-T-Aを備えた新しい50ミリリットルの遠心分離管に移します。容量を50ミリリットルに上げ、遠心分離によって細胞を回収します。細胞を50ミリリットルの完全培養液、培地、400Gで10分間遠心分離機に1回穏やかに洗浄します。次に、CCMに細胞ペレットをプールし、細胞カウントを行います。トライアムブルーの除外方法を使用します。単核細胞は、エレクトロポレーションに使用したり、将来の使用のために凍結保存したりできるようになりました。凍結保存されたMNCを使用して、フルスケールのエレクトロポレーションのために8番目の細胞に2回10回急速に解凍する場合は、プレウォームが入った適切なサイズの遠心分離チューブに細胞を静かに移します。完全なフェノールフリーRPMI培養培地と遠心分離により細胞をペレット化し、単核細胞を再懸濁し、P-F-R-P-M-Iで細胞数をカウントし、細胞を1ミリリットルあたり6細胞のうち10個の濃度で適切なサイズの細胞培養容器に移します。加湿インキュベーター内で細胞を2時間平衡化します。遠心分離によってMNCを収穫し、その後、P-F-R-P-M-Iで細胞ペレットを穏やかに再懸濁して結合し、細胞を列挙します 今、8番目のMNCに2回10を滅菌50ミリリットルの遠心分離管に移し、200Gで10分間休憩なしで遠心分離します。細胞ペレットの周囲に残留培地が残らないように、上清を吸引します。4ミリリットルの温かいP-F-R-P-M-Iを含む10ウェルを含む滅菌12ウェルプレートを準備し、5%の二酸化炭素で摂氏37度の加湿インキュベーターでプレートを平衡化します。次に、ヒトT細胞キットのLonzo Nucleoエフェクター溶液を、各反応の製造元の指示に従って再構成します。Q Vetは、NU核エフェクター溶液を添加したDNAマスターミックス100マイクロリットルを調製します。プラスミド上の転置液15マイクログラムと転位プラスミド5マイクログラム。次に、T細胞のペレットを分散させ、NU核愛情溶液DNAマスターミックスを、100マイクロリットルあたり7番目の細胞の10分の2の最終細胞濃度で再懸濁します。気泡を避けるために注意しながら、100マイクロリットルの細胞懸濁液を10個のロンザ核愛情キュベットのそれぞれに慎重に移します。次に、qveを一度タップし、プログラムU 0 1 4を使用して刺激を受けていないT細胞にエレクトロします。キュベットと平衡化12ウェルプレートを、対応するウェルから各獣医に500マイクロリットルの予温培地で細い先端移送ピペットのアモックスを使用して培養フードに移します。エレクトロポレーションした細胞をプレートに移し、細胞を細胞培養インキュベーターで2時間回復させます。次に、すべてのウェルから細胞を滅菌遠心チューブに移し、1回の洗浄後に細胞をペレット化し、細胞ペレットを穏やかに分散させ、CCMで懸濁液を蘇生して単一細胞懸濁液を実現します。細胞数を行った後、CCMで1ミリリットルあたり6個の細胞に傾向があるように細胞濃度を調整します。次に、細胞懸濁液を培養フラスコに移し、インキュベーターに一晩置いてEGFPトランスフェクション細胞を生成します。獣医あたり 6 個の細胞のうち 10 回を 5 マイクログラムの amox コントロール EGFP プラスミドと共に使用して、エレクトロポレーション プロトコルを繰り返します。エレクトロポレーションされた細胞を回収し、トリエンブルー排除法を使用して細胞数をカウントします。次に、6つの細胞のうち1〜2回10を、CD 3、CD 4、CD 8、およびヒトIgG FCガンマに特異的な抗体で染色し、自動車発現の測定値とします。ファックス口径でセルを取得します。FCS expressソフトウェアを使用してデータを分析して、車の表現を決定します。次に、培養中のカー陽性細胞を計算します。このA PCクローン番号4は、K 5 62細胞から共発現した所望のT細胞共刺激分子に由来し、凍結融解剤を凍結して照射し、A A PCを摂氏37度の水浴で加熱する。次に、細胞を洗浄し、CCMはトリップブルー排除によって生存細胞を列挙し、刺激に必要な生存可能なA PCの数を計算します。carを発現するエレクトロポレーション細胞とガンマ線を照射したA a PCを滅菌容器内で1対2の割合で混合します。エレクトロポレーションの翌日のフローサイトメトリーに基づいて、自動車の発現のためのA PC比を調整し、IL 21のミリリットルあたり30ナノグラムを細胞懸濁液に加えます。その後、Eloquaは、T75フラスコでミリリットルあたり6つの細胞を世話したり、生命培養バッグを見て、培養インキュベーターに戻り、DNAプラスミドの電気転写とガンマ線照射上のT細胞の増殖を行いました。A PCは、末梢血や臍帯血に由来する臨床的に魅力的な数のT細胞を作製し、ヒトに応用することができます。この特性評価では、最初の刺激サイクルのゼロ日目におけるEGFPの末梢血発現からの遺伝子組み換えT細胞の特性評価において、エレクトロポレーションの約24時間後に、CD3陽性、CD8陽性、およびCD4陽性T細胞のCD19特異的カーの遺伝子導入発現効率を制御する。そして、Aでの共培養の28日後、機能的に閉鎖したシステムで増殖したT細胞での車内発現のPC速度論。末梢血由来のカー陽性T細胞の経時的な増殖は、カーを安定して発現する臨床的に魅力的な数のT細胞を生成することができます。A PC上での共培養の4週間後、CD 3陽性T細胞の平均倍増は、90%のcar発現で約19,800である。このビデオを見れば、パレードを選出し、目的の車を発現するT細胞を増殖させる方法についてよく理解できるはずです。NK細胞の異常増殖を監視することを忘れないでください。T細胞のエレクトロポレーションと増殖は、通常、7日間の刺激サイクルを4回かけて行われます。養子免疫療法の分野における遺伝子組み換えT細胞のリダイレクト特異性を評価するために、サイトカイン放出および細胞毒性アッセイなどのさらなる調査を行うことができる。この技術は、ヒトに注入されたT細胞の治療可能性を理解するのに役立ちます。

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豊かにし、磁性ナノ粒子でまれな抗原特異的 T 細胞を展開

本論文では、三次元(3D)胸腺培養系により腫瘍抗原特異的誘導多能性幹細胞由来の甲状腺系(iTE)を生成する新しい方法について説明する。iTEは、増殖、記憶形成、腫瘍抑制の能力を有するナイーブT細胞と密接に関連するT細胞の均質なサブセットである。...

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

このプロトコルの目標はヒト以外の霊長類 CD34 を分離、+細胞プライミング骨髄、レンチ ウイルスのベクトルでこれらの細胞の遺伝子変更および自己ホストの注入の製品を準備します。総プロトコルの長さは、約 48...

準備とヒト以外の霊長造血幹・前駆細胞の遺伝子の改変

ここに提示されるのは、幹細胞由来ウイルス抗原(Ag)特異的Tリンパ球の養子細胞転写(ACT)を利用してマウスにおけるB型肝炎ウイルス(HBV)複製の効果的な抑制のためのプロトコルである。この手順は、HBV感染の潜在的なACTベースの免疫療法に適合してもよい。...

幹細胞由来ウイルスAg特異的Tリンパ球はマウスにおけるHBV複製を抑制する

遺伝子治療アプリケーションのための造血幹細胞および前駆細胞のCRISPR/Cas9遺伝子編集

このプロトコールは、ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞(CAR制御性T細胞)を生成および試験するための合理化されたワークフローを提供します。...

ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞の作製

学ぶ、Sleeping Beautyシステムを用いてT細胞を遺伝子改変し、人工抗原提示細胞上でCAR陽性T細胞を選択的に増殖させる方法。B細胞悪性腫瘍治療への応用が期待される。

の臨床応用

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