の臨床応用

このプロトコルは、T細胞を遺伝子組み換えして腫瘍抗原に特異的なキメラ抗原受容体を導入し、その後、デザイナー人工抗原提示細胞上に臨床的に有意な数を増殖させます。眠れる森の美女の電気転写から始めます。末梢または臍帯血から単離された静止性単核細胞にA DNAプラスミドを転置および転位します。

次に、フローサイトメトリーを使用してトランスフェクション効率を測定します。次に、トランスフェクトT細胞をK 5 62由来人工抗原提示細胞上で7日間にわたってトランスフェクションし、4週間の刺激で外因性サイトカインを添加した。増殖サイクルは、凍結保存を分析し、エレクトロポレーションおよび増殖したカー陽性T細胞をヒトに適用するために放出するために進行します。

眠れる森の美女のトランスポーズシステムは、選択した細胞に遺伝子を安定して導入するためのウイルスベースの遺伝子導入アプローチに代わるものを提供します。眠れる森の美女システムの主な利点の1つは、違法な非相同組換えによって統合するDNAプラスミドと比較して、本当に低コストで遺伝子を統合できることです。したがって、利点は、眠れる森の美女システムを使用して、低コストかつ高効率で遺伝子を発現できることです。

一般に、この方法に不慣れな個人は、人工抗原提示細胞上でのカー陽性T細胞の選択的増殖におけるエレクトロT細胞の効率を最初に克服する必要があります。どちらのステップも、共同培養が必要なため、習得するのが困難です。人工抗原提示細胞上の遺伝子改変T細胞。

この方法は、養子免疫療法の分野、特に効果的な遺伝子送達および臨床的に有意な数のT細胞の作製において有用です。免疫系のT細胞は腫瘍特異的に修飾できるため、より広範な用途は癌の治療にまで及びます。手順を実演するのは、マーガレット・ドーソンとマシュー・フィオラです。

私の研究室の技術者は、まず、末梢血を等量のP-B-S-E-D-T-Aで希釈し、臍帯血を4つの容量のP-B-S-E-D-T-Aで希釈し、希釈した血液25ミリリットルを12ミリリットルのフィアルに50ミリリットルの遠心分離管でゆっくりと重ねます。フィアルグラジエントを400Gで30〜40分間、休憩なしで遠心分離します。次に、単核細胞画分をP-B-S-E-D-T-Aを備えた新しい50ミリリットルの遠心分離管に移します。

容量を50ミリリットルに上げ、遠心分離によって細胞を回収します。細胞を50ミリリットルの完全培養液、培地、400Gで10分間遠心分離機に1回穏やかに洗浄します。次に、CCMに細胞ペレットをプールし、細胞カウントを行います。

トライアムブルーの除外方法を使用します。単核細胞は、エレクトロポレーションに使用したり、将来の使用のために凍結保存したりできるようになりました。凍結保存されたMNCを使用して、フルスケールのエレクトロポレーションのために8番目の細胞に2回10回急速に解凍する場合は、プレウォームが入った適切なサイズの遠心分離チューブに細胞を静かに移します。

完全なフェノールフリーRPMI培養培地と遠心分離により細胞をペレット化し、単核細胞を再懸濁し、P-F-R-P-M-Iで細胞数をカウントし、細胞を1ミリリットルあたり6細胞のうち10個の濃度で適切なサイズの細胞培養容器に移します。加湿インキュベーター内で細胞を2時間平衡化します。遠心分離によってMNCを収穫し、その後、P-F-R-P-M-Iで細胞ペレットを穏やかに再懸濁して結合し、細胞を列挙します 今、8番目のMNCに2回10を滅菌50ミリリットルの遠心分離管に移し、200Gで10分間休憩なしで遠心分離します。

細胞ペレットの周囲に残留培地が残らないように、上清を吸引します。4ミリリットルの温かいP-F-R-P-M-Iを含む10ウェルを含む滅菌12ウェルプレートを準備し、5%の二酸化炭素で摂氏37度の加湿インキュベーターでプレートを平衡化します。次に、ヒトT細胞キットのLonzo Nucleoエフェクター溶液を、各反応の製造元の指示に従って再構成します。

Q Vetは、NU核エフェクター溶液を添加したDNAマスターミックス100マイクロリットルを調製します。プラスミド上の転置液15マイクログラムと転位プラスミド5マイクログラム。次に、T細胞のペレットを分散させ、NU核愛情溶液DNAマスターミックスを、100マイクロリットルあたり7番目の細胞の10分の2の最終細胞濃度で再懸濁します。

気泡を避けるために注意しながら、100マイクロリットルの細胞懸濁液を10個のロンザ核愛情キュベットのそれぞれに慎重に移します。次に、qveを一度タップし、プログラムU 0 1 4を使用して刺激を受けていないT細胞にエレクトロします。キュベットと平衡化12ウェルプレートを、対応するウェルから各獣医に500マイクロリットルの予温培地で細い先端移送ピペットのアモックスを使用して培養フードに移します。

エレクトロポレーションした細胞をプレートに移し、細胞を細胞培養インキュベーターで2時間回復させます。次に、すべてのウェルから細胞を滅菌遠心チューブに移し、1回の洗浄後に細胞をペレット化し、細胞ペレットを穏やかに分散させ、CCMで懸濁液を蘇生して単一細胞懸濁液を実現します。細胞数を行った後、CCMで1ミリリットルあたり6個の細胞に傾向があるように細胞濃度を調整します。

次に、細胞懸濁液を培養フラスコに移し、インキュベーターに一晩置いてEGFPトランスフェクション細胞を生成します。獣医あたり 6 個の細胞のうち 10 回を 5 マイクログラムの amox コントロール EGFP プラスミドと共に使用して、エレクトロポレーション プロトコルを繰り返します。エレクトロポレーションされた細胞を回収し、トリエンブルー排除法を使用して細胞数をカウントします。

次に、6つの細胞のうち1〜2回10を、CD 3、CD 4、CD 8、およびヒトIgG FCガンマに特異的な抗体で染色し、自動車発現の測定値とします。ファックス口径でセルを取得します。FCS expressソフトウェアを使用してデータを分析して、車の表現を決定します。

次に、培養中のカー陽性細胞を計算します。このA PCクローン番号4は、K 5 62細胞から共発現した所望のT細胞共刺激分子に由来し、凍結融解剤を凍結して照射し、A A PCを摂氏37度の水浴で加熱する。次に、細胞を洗浄し、CCMはトリップブルー排除によって生存細胞を列挙し、刺激に必要な生存可能なA PCの数を計算します。

carを発現するエレクトロポレーション細胞とガンマ線を照射したA a PCを滅菌容器内で1対2の割合で混合します。エレクトロポレーションの翌日のフローサイトメトリーに基づいて、自動車の発現のためのA PC比を調整し、IL 21のミリリットルあたり30ナノグラムを細胞懸濁液に加えます。その後、Eloquaは、T75フラスコでミリリットルあたり6つの細胞を世話したり、生命培養バッグを見て、培養インキュベーターに戻り、DNAプラスミドの電気転写とガンマ線照射上のT細胞の増殖を行いました。

A PCは、末梢血や臍帯血に由来する臨床的に魅力的な数のT細胞を作製し、ヒトに応用することができます。この特性評価では、最初の刺激サイクルのゼロ日目におけるEGFPの末梢血発現からの遺伝子組み換えT細胞の特性評価において、エレクトロポレーションの約24時間後に、CD3陽性、CD8陽性、およびCD4陽性T細胞のCD19特異的カーの遺伝子導入発現効率を制御する。そして、Aでの共培養の28日後、機能的に閉鎖したシステムで増殖したT細胞での車内発現のPC速度論。

末梢血由来のカー陽性T細胞の経時的な増殖は、カーを安定して発現する臨床的に魅力的な数のT細胞を生成することができます。A PC上での共培養の4週間後、CD 3陽性T細胞の平均倍増は、90%のcar発現で約19,800である。このビデオを見れば、パレードを選出し、目的の車を発現するT細胞を増殖させる方法についてよく理解できるはずです。

NK細胞の異常増殖を監視することを忘れないでください。T細胞のエレクトロポレーションと増殖は、通常、7日間の刺激サイクルを4回かけて行われます。養子免疫療法の分野における遺伝子組み換えT細胞のリダイレクト特異性を評価するために、サイトカイン放出および細胞毒性アッセイなどのさらなる調査を行うことができる。

この技術は、ヒトに注入されたT細胞の治療可能性を理解するのに役立ちます。