Name: 生体高分子薬の細胞質ゾルデリバリーのためのpH応答性エンドソーム溶解剤の評価のためにex vivoで赤血球溶血アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 学ぶ赤血球溶血アッセイによる薬物送達ベクターの膜破壊能評価法。pH応答性エンドソーム溶解剤の細胞質ゾルデリバリー効率を定量的に測定し、生体高分子薬の細胞内導入を最適化する。

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著者らは、国防総省を通じて議会監督医学研究プログラム（＃W81XWH-10-1から0445）、国立衛生研究所（NIH R21をHL110056）、および米国心臓協会（＃11SDG4890030）を資金認める。

1。バッファおよびテストエージェントの調製と滅菌<ol><li> 150mMのNaCl緩衝液：ナノ純水500ml中に4.383グラムNaCl結晶を溶かす。 </li><li> pH緩衝液：一塩基と二塩基性リン酸ナトリウムの適切な量を混合することにより、pHが5.6、6.2、6.8、および7.4のリン酸緩衝液を準備します。サンプルは低いpH値（ すなわち pHが&lt;5.6）などのクエン酸緩衝液として、より適切な緩衝液、でテストする場合は、使用すべきである。バッファのレシピは、容易に入手可能であり、例えば参照がここで提供されています12 </li><li>ボトルトップ吸引ろ過装置と再確認バッファーのpHを介して上記のようにすべてのバッファーを滅菌する。 </li><li> 20パーセントのTriton X-100（陽性対照）：ミックス20ミリリットル純粋トリトンX-100ナノ純水80mlインチ激しくボルテックスし、溶解するために超音波処理する。使用前に室温で一晩にしておきます。 </li></ol> 2。赤血球の調製<ol><li>血液frの25ミリリットルを得る凝固を防ぐために、K 2-EDTA-コーティングさバキュテイナー管に直接描かれたOMは、匿名の人間のドナー、。 </li></ol> 注：すべての手順は、適切な治験審査委員会（IRB）による事前承認を受けなければならず、静脈穿刺および採血がドナーへのリスクを最小限にするために訓練された瀉血専門医が行う必要があります。標準的な瀉血の手続きは、他の場所で公開されている13 <ol start="2"><li> 5分間、チューブ上のヘマトクリット値（赤、下層）と血漿（黄色がかった、上層）のマーク·レベルについては、500×gで血液を遠心分離します。 </li><li>マイクロピペッターを介して緩やかにプラズマを吸引除去し、漂白剤に追加して、バイオハザード廃棄物に捨ててください。 </li><li> 150mMのNaCl溶液でマークされた行（プラズマの元のレベル）にヘマトクリット管を埋める。キャップ、穏やかに混合するために数回転倒。 5分間、500×gで遠心分離します。 </li><li>再び血液細胞を洗浄するステップ2.3から2.4を繰り返します。その後supernatを吸引アリとpH7.4のPBSで置き換える。混在させる反転。 </li><li>テストされる各pHに対応する4つのチューブ内に均等に血を分割します。 （5.6、6.2、6.8、7.4）でテストする各pHに応じてチューブにラベルする。 </li><li> 5分間、500×gで採血管を遠心する。チューブ上のレベルにマークを付け、その後、上清を吸引除去する。 </li><li>適切なpH（2.6に示されるように）のバッファでマークされた行に各管を埋める。 </li><li>ラベル4 50 mlコニカルチューブ（試験へのpH当たり1）、および各コニカルチューブに適切なpHのPBSのピペット49ミリリットル。 </li><li> 1:50希釈のための対応するチューブに赤血球の1ミリリットル（同じpH）を追加します。視覚的に混濁されるべきであり、邪魔されずに放置しておくと落ち着きます希釈血液を検査。ペレットの形していない場合は、細胞を溶解した。 </li></ol> 3。溶解アッセイ96ウェルプレートのセットアップと定量<ol><li>テストする20X所望の最終濃度で、すべての実験薬物送達剤のストック溶液を準備します（アッセイ薬物送達剤+ 190μlの希釈赤血球、最終テスト混合物の中に、元の薬物送達剤の1/20希釈につながる）の10μlがかかります。 20、100、800μg/ mlの株式がそれぞれ1,5、および40μg/ mlのの最終試験濃度で、その結果、提案されている。 </li><li> V底96ウェルプレートに各ストック溶液の10μlのピペット。最適な結果を得るために、三重または四重に各サンプルをロードします。 </li></ol> 注：簡単にするために、それは独立した96ウェルプレートは、n = 3-4あたりのプレートにロードされた各サンプル（各濃度における）で、テストする各pHのために準備することをお勧めします。 <ol start="3"><li>正の対照ウェルは、10μlの20％Triton X-100を追加します。 </li><li>陰性対照ウェルは、リン酸緩衝液10μlを加える。テストする同じpHでバッファを使用します。 </li><li>希釈された赤血球のピペットで190μL（2.10参照）を各ウェルに、残っていることを確認細胞原液を作る転送中に均質。ヒント：このタスクを簡素化するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。 </li><li> 1時間（：オービタルシェーカーやロッカーを使用して、オプション）を37℃でプレートをインキュベートする。 </li><li> 500はペレット無傷赤血球にxgで5分間プレートを遠心します。注：遠心分離機からプレートを外して、次のステップにそれを輸送する際、取り扱いに注意し、細胞ペレットを妨害しないように注意する。 </li><li>マルチチャンネルピペットを使用し、クリア、平底96ウェルプレートに各ウェルから100μlの上清を移す。注：細胞ペレットを誤って任意のサンプル（s）の妨害された場合は、1つは、再遠心することができますプレート後、上澄みの転送を続行します。 </li><li>プレートリーダーを用いて上清の吸光度を測定します。波長の範囲は（ - 541 nmの400）を使用することができることに注意してください。 </li></ol> 注：異なるプレートリーダーが異なる飽和点と感度を持っている可能性がありますので、私のために波長の選択asurementsは、界面活性剤処理により誘導されるような実験サンプルから溶血データが確実に最大溶血に対して正規化することができるかどうかによって異なります。これは、ポジティブコントロールサンプルの吸光度の値を正確に測定する必要があります。 <ol start="10"><li> Microsoft Excelまたは類似のデータ解析ソフトウェアを使用して、各pH（ステップ3.4）用に設定され陰性対照試料からのバックグラウンド吸光度の測定値の平均を求める。そのpHで測定した他のすべての試料から、このバックグラウンドの吸光度の値を減算します。 </li><li>バックグラウンドを差し引いた後、陽性コントロールの平均吸光度洗剤で処理したサンプル（ステップ3.3）を見つける。次いで100％溶血を表すべきであるこの平均吸光度値にすべての実験データ点を正規化します。最後に、洗剤コントロールに対する相対的なだけでなく、個々に発生した％溶血を計算するために100％で各ウェルの値を乗算します。 </li></ol>

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</ol>

IRBの承認：ヒトを対象とする手順は、バンダービルト大学治験審査委員会（;プロトコル＃111251 IRB）により承認されている。特別な利害関係は宣言されません。

-初期エンドソームのpH 6.2 -後期エンドソームのpH 5.6 - pHは6.8、エンドソーム溶解機能のために設計されたpH応答性ポリマーまたは他の薬剤を迅速かつ効果的にエンドソーム（ 図1に遭遇したpH値で赤血球の溶解に基づいてスクリーニングすることができるリソソーム）14から17、pH依存性溶血は、生体高分子の治療法（ 例えば、ペプチドは、siRNA、ODNは、タンパク質）のエンドソーム放出を仲介する事業者の能力をスクリーニングするために使用されており、このアッセイの結果は、細胞内のように性能を予測することができます薬物送達ビヒクル。3,4,8,18,19はこのように、このアッセイは、それらのpH依存性膜破壊に基づく細胞内薬物送達を媒介する高分子薬物担体の能力を測るための効果的な画面を表します。 手順で説明したように、溶血は実験で処理赤血球の上清の吸光光度測定により検出されたエージェント。したがって、ヘモグロビンに加えて、それは、タンパク質と炭水化物を含む他の赤血球由来の細胞質...

細胞内の多くの潜在的な影響力の大きい治療標的がありますが、薬剤の細胞内送達は、重要な課題となっています。頻繁に、薬剤、特に生物学的製剤は、エキソサイトーシスを介して細胞によって内在化および小胞に人身売買どちらのendo-リソソーム経路を介して、それらの内容の劣化につながること、またはセルの裏に運ばれますされています。後者の過程で1、内部のpHが小胞の酵素の活性の至適pHである、約5から6に酸性化されているリゾチームなど、この区画内の関数は、図2 最近では、材料の数は、特にの酸性化は、その貨物の細胞質送達を容易にするエンドソームを活用するように操作されている。このアプローチの一つの例では、コア生理学的pH（ すなわち 7.4）で両性イオンと電荷的に中性である合成、高分子ミセルのナノ粒子を使用しています。しかし、pH6.0で- 6.5、ポリマーがプロトン化になるとミセルのコアを不安定正味の正電荷を取得し、露出したポリマーセグメントと相互作用し、エンドソーム膜を破壊する。この活動は、彼らの細胞質ゾルのターゲットにアクセスできるように、ペプチドおよび核酸ベースの治療薬のエンドソーム脱出を促進することが示されている。膜障壁を崩壊エンドソーム脱出を媒介するために開発された方法の3,4他の例は、または&#39;融合&#39;ペプチドが含まれるリン脂質二重層の膜融合や過渡孔形成を媒介することができるタンパク質は、例えば、ポリ（プロピルアクリル酸）のようなアニオン性アルキルアクリル酸の5ホモは別のよく研究されたアプローチであり、これらのポリマーに、ペンダントカルボン酸のプロトン化状態が遷移を指示エンド-リソソームのpH範囲において、疎水性膜の中断状態になります。6,7 エンドソーム溶解挙動をスクリーニングするための一つの有用なモデル系はeですX生体内pH依存性溶血アッセイ。このモデルシステムでは8、赤血球膜は、エンド-リソソーム小胞を囲む脂質二重膜の代用として機能します。この一般化モデルは細胞透過性ペプチドおよび他の高分子遺伝子送達システムのエンドソーム溶解挙動を評価するために他の人によって使用されています8月11日今回の実験では、ヒト赤血球および試験材料は模倣する定義されたpHで緩衝液中で同時インキュベートアール、（7.4）は、細胞外（6.8）初期エンドソーム、およびエンドリソソーム後期（&lt;6.8）環境に対応しています。潜伏期間中に放出されたヘモグロビンの量は、洗剤を用いて溶解し、陽性対照試料で放出されたヘモグロビンの量に正規化されている赤血球の溶解、の尺度として定量化される。 潜在的にエンドソーム溶解試験材料の小さなライブラリーをスクリーニングすることから、1つは、pH7.4で全く溶血を生じないが、有意に上昇し、その裾のサンプルを推測することができますpHでolysis &lt;6.5は、細胞質ゾルの薬物送達のための最も効果的かつcytocompatible候補となります。これらの基準に適合する材料は、不活性のままで無差別にエンド-リソソーム区画に内在化後の局所pHの低下にさらされるまで、脂質二重膜（細胞毒性を引き起こす可能性がIE）を破壊しないことが予想される。 このプロトコルでは、赤血球はヒトのドナーから単離されており、実験的なエンドソーム溶解薬物送達剤を用いてpHを5.6、6.2、6.8、または7.4で共存培養した。無傷赤血球をペレット化し、上清を（溶解赤血球から放出されたヘモグロビンを含む）プレートリーダー（ 図1）を経由してヘモグロビンの吸光特性を分析する。

<table border="1"><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> BDバキュテイナー - K2EDTAバキュテイナー管</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 22-253-145 </td><td>採血用</td></tr><tr><td> BDバキュテイナ採血針、20.5ゲージ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 02-665-31 </td><td>採血用</td></tr><tr><td> BDバキュテイナチューブホルダー/ニードルアダプタ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 22-289-953 </td><td>採血用</td></tr><tr><td> BDのブランドイソプロピルアルコール綿棒</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 13-680-63 </td><td>採血用</td></tr><tr><td> BDバキュテイナーラテックスフリー止血帯</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 02-657-6 </td><td>採血用</TD&gt; </tr><tr><td>塩酸（濃） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A144-500 </td><td> D-PBSのpHを調整するための。 </td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T8787 </td><td>陽性対照</td></tr><tr><td>ダルベッコPBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td>ナルゲンSFCAメンブレンMF75滅菌使い捨てボトルトップフィルターユニット</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 09から740-44A </td><td></td></tr><tr><td> BDの96ウェルプレート平底、組織培養処理されたポリスチレン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 08から772-2C </td><td>アッセイの終了時に、板読書のため。 </td></tr><tr><td> BDの96ウェルプレート、丸底組織培養処理されたポリスチレン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 08-772-17 </td><td>実験的な薬剤と赤血球のインキュベーション。 </td></tr></テーブル&gt;

生体高分子薬の細胞質ゾルデリバリーのためのph応答性エンドソーム溶解剤の評価のためにex vivoで赤血球溶血アッセイ

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

エンド-リソソーム小胞を構成するリン脂質二重層は細胞内標的に対する生物学的薬剤の送達に障壁をもたらすことができます。この障壁を克服するために、合成麻薬キャリアの数を積極的にエンドソーム膜を破壊し、細胞質内に貨物を提供するように設計されています。ここでは、細胞内薬物送達システムのcytocompatibilityとエンドソーム溶解活性のために迅速、ハイスループットスクリーニングとして使用することができ溶血アッセイを、説明します。 溶血アッセイ、ヒト赤血球および試験材料では、細胞外の早期エンドソーム、後期のendo-リソソーム環境を模倣する定義されたpHの緩衝液中で同時インキュベートされています。ペレット無傷赤血球に遠心分離工程に続いて、培地中に放出されたヘモグロビンの量を分光光度法（最高のダイナミックレンジの405 nm）で測定されます。パーセント赤血球の破壊は、その後陽性対照SAMPに対する相対定量化されLESは、洗剤を用いて溶解。このモデル系では赤血球膜には、エンド - リソソーム小胞を囲む脂質二重膜の代用として機能します。所望の結果は、生理学的pH（7.4）とpH約5から6.8からのendo-リソソームのpH範囲で堅牢な溶血で無視できる溶血です。

<html>典型的には、理想的なpH依存性溶血性挙動を示す薬剤は、薬物、核酸、または他の生物活性分子の細胞質送達のための最高の可能性を秘めている。これは、pH7.4で最小限の溶血を示し、 図2に描かエージェントとして第1に代表されるが、エンドソームのpH範囲（&lt;6.5）における溶血性行動が急激に増加しています。これらの薬剤は血液適合性ではない可能性があり、潜在的にこれらの濃度で細胞毒性の可能性がありますことを示唆して、いくつかの薬剤は、生理的pH範囲（ 図2の 40μg/ mlのエージェント＃2）で溶血性行動の有意なレベルを示すことができる。 試験物質の濃度を増加させ、特に（ - 6.2 5.6）テスト低いpH範囲で、溶血のより高いレベルに対応するように、ほとんどの場合、溶血は、また、用量依存的である。 の &quot;alt =&quot;図1 &quot;のfo：コンテンツ...

溶血アッセイは、細胞内の貨物の配達のための薬物送達システム &quot;cytocompatibilityとエンドソーム溶解活性の急速な、高スループットの画面として使用することができます。アッセイは、環境pHの関数としての赤血球膜の破壊を測定します。

生体高分子薬の細胞質ゾルデリバリーのためのpH応答性エンドソーム溶解剤の評価のためにex vivoで赤血球溶血アッセイ

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

本実験の全体的な目的は、エンドソーム膜の生物学的モデルとして赤血球を用い、生物学的製剤を細胞内へ届けるための薬物輸送ベクターによる膜破壊能を定量的に評価することです。このビデオは、ヴァンダービルト大学の先端治療研究室（Advanced Therapeutics Laboratory）によって制作されました。ヒト被験者が関与するすべての手順は、ヴァンダービルト大学の制度的審査委員会（Institutional Review Board）によって承認されています。まず、エンドソーム、溶血、および溶血についての簡単な紹介をします。バイオ医薬品のキャリアは、非特異的または受容体介在性エンドサイトーシスを通じて、細胞内のエンドソームに取り込まれます。エンドサイトーシスの後、貨物はリソソーム内で分解されるか、あるいは外切出しによって細胞外空間へ輸送されます。しかし、図に示すように、エンドソーム内のpH低下はpH応答性薬剤キャリアに利用可能です。これらのキャリアは酸性環境に反応して膜破壊性を持ち、エンドソーム膜に物理的に孔を形成させたり、不安定化させたりします。エンドソームが破壊されることで、薬剤貨物が細胞質に放出され、細胞質、ミトコンドリア、または核などの標的部位へと拡散します。本アッセイでは、生理的pHにおけるエンドソーム膜のモデルとして赤血球を使用します。理想的なデリバリービークルは、安定性を維持し、赤血球膜を破壊しないものである必要があります。しかし、pHを低下させると、デリバリービークルが不安定になり、疎水性相互作用が生じて赤血球膜が破壊され、ヘモグロビンが放出されます。その後、赤血球からヘモグロビンを単離し、405、450または541ナノメートルにおける吸光度を用いて分光光度法により定量することができます。吸光度が高いほど、より強力なエンドリチック活性（細胞内溶解能）を持つことになります。これは生理学的pHにおけるタイムラプス顕微鏡観察で可視化できます。薬物キャリアが存在しても、赤血球は安定したまま維持されます。しかしながら、エンドソーム経路に特徴的な低いpHでは、デリバリービークルが赤血球膜を急速に破壊・消失させます。本研究に必要な材料には、500 mLの脱イオン水と4.383 gの塩化ナトリウムを用いて調製し、ボトルトップ真空ろ過装置で滅菌ろ過した150 mMの塩化ナトリウムが含まれます。pH 7.4、6.8、6.2、および5.6のリン酸緩衝生理食塩水溶液は、適切な量のリン酸一ナトリウムおよびリン酸二ナトリウム緩衝液を混合し、ボトルトップ真空ろ過装置を用いて滅菌ろ過することで調製しました。pHメーターおよびpH試験紙を用いてpHをモニタリングし、測定の正確性を確保するためにいくつかの方法を用いました。20% Triton Xは、20 mLのTriton X 100を80 mLの超純水に溶解させ、激しく振とうした後、超音波処理して溶解させることで調製しました。これは機関審査委員会の承認後に実施されました。研究看護師または採血技師に依頼し、凝固を防ぐためにカリウムEDTAコーティングされた真空採血管を用いて、匿名ドナーから25 mLの全血を採取してください。このビデオでは、バキュテナーアダプターに接続された20.5ゲージの採血針を使用します。採取した血液を500 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離後、血漿層と赤血球層が明確に分かれているはずです。振とうして層を乱さないように注意してください。血漿のレベルに印を付け、マイクロピペットまたは吸引装置で静かに吸引し、漂白剤に入れて廃棄します。印を付けた線まで 150 millimolar 塩化ナトリウムで血漿を置換します。バイアルにキャップをし、数回反転させて穏やかに混合した後、2回目の遠心分離を500 Gで5分間行い、続いて上清を吸引します。上清を150 millimolar 塩化ナトリウムで標線まで置換し、数回反転させて穏やかに混合した後、3回目の遠心分離を500 Gで5分間行います。上清を吸引し、pH 7.4のPBSで標線まで置換します。血液ストックを4本のチューブに均等に分注します。それぞれ、生理的pHの7.4、初期エンドソームpHの6.8、後期エンドソームpHの6.2、および後期エンドソームまたはリソソームpHの5.8という、テストする各pHに対応させます。500 Gで5分間の遠心分離を4回目かつ最終回として繰り返します。上清の液面をマークし、穏やかに吸引して上清を漂白剤の中に廃棄します。上清を適切なpHのPBSで置換します。赤血球の最終ストックは、ストック溶液を適切なpHのバッファーで50倍に希釈して調製します。本例では、濃縮赤血球1 mLを49 mLのPBSに加え、血液調製前にバイアルを数回緩やかに転倒混和させて赤血球を混合させました。デリバリービークルのストック溶液を20倍濃度で調製します。ポリマーについては、希釈後の初期試験濃度として2100 µg/mLおよび800 µg/mLを推奨します。これにより、インキュベーション時の最終濃度は105 µg/mLおよび40 µg/mLとなります。遠心分離により無傷の赤血球を除去できるよう、コニカル底またはラウンド底プレートを使用してください。20倍濃度のポリマー溶液10 µLを各ウェルにピペットで分注します。結果を最適化するため、サンプルは少なくとも3連または4連で調製することを推奨します。Triton Xはすべての細胞を溶解させるため、陽性対照として使用できます。最終濃度1%のPBS（pH 7.4）は陰性対照として使用できます。希釈した赤血球溶液を190 µLずつ各ウェルにピペッティングしてください。その際、赤血球溶液が均一に保たれていることを確認してください。懸濁状態を維持するために、軽く振とうまたは混合させる必要がある場合があります。赤血球を添加すると、極めて溶血性の高い化合物では、すでに溶血が始まり始める場合があることに注意してください。37 °Cで1時間インキュベートし、溶血を進行させます。プレートを取り出して遠心分離を行い、500 Gで遠心して赤血球をペレット化します。その後、上清100 µLをフラットボトム96ウェルプレートに慎重に分注します。赤血球のペレットを乱さないことが重要であるため、細心の注意を払って操作してください。プレートリーダーを用い、450 nmで各ウェルの吸光度を測定します。ヘモグロビンの濃度が高すぎて吸光度の測定値が高すぎる場合は、プレートを541 nanometerで読み取ることができます。逆に、ヘモグロビンの濃度が低すぎて吸光度の測定値が低い場合は、吸光度を最大化するためにプレートを405 nanometersで読み取ります。データを分析し、溶血率を算出するには、PBSでは赤血球が全く溶血せず、Triton Xでは赤血球が100%溶血すると仮定して計算します。示された式により、各サンプルのホモリシス率（%）が算出されます。Microsoft Excelなどのソフトウェアを使用することで、数百個のウェルからの実験結果を迅速に解析することが可能です。以下に、上述したpH範囲における、いくつかの濃度での代表的な結果を示します。この処方は理想的なpH応答を示し、生理学的pHでは溶血活性を示しませんが、エンドソームpHではスイッチのような挙動を示し、赤色の矢印で示されるように著しい膜破壊を引き起こします。これで、当研究室によるpH依存的赤血球溶血アッセイの解説ビデオをご覧いただきました。本アッセイは、比較的安価で使いやすく、ハイスループットな手法であり、バイオ医薬品の溶血性デリバリー向けに設計された一連のポリマーのコンビナトリアルライブラリのスクリーニングに使用できます。本アッセイは、タンパク質、ペプチド、核酸を含むさまざまなバイオ医薬品の細胞質への送達能および生物活性を非常に高く予測できることが分かりました。ただし、本アッセイにはいくつかの潜在的な弱点があることに留意すべきです。本手法は、実際にエンドソーム膜を物理的に破壊するポリマーやペプチドにとって、優れた予測ツールになると考えられています。しかしながら、本手法はポリマーや、プロトンスポンジ機構に基づいて作用するその他の系に使用するための予測ツールとしては適していません。さらに、赤血球の脂質二重層の構成は、エンドソーム膜やリソソーム膜の構成を正確に模倣しているわけではないことを考慮する必要があります。脂質組成およびコレステロール含有量の観点から、常に追試を行う準備をしておくべきです。赤血球溶血の結果は、補完的な手法やアッセイと併せて評価してください。例えば、エンドソームまたはリソソーム染料を用いた蛍光顕微鏡観察をコロカライゼーション解析に併用することで、生物学的製剤がエンドリソソーム経路から脱出する様子を可視化できます。さらに、送達された薬剤や生物学的製剤の生物活性または下流への影響の測定を、常に最終ステップとして行う必要があります。最後に、バイオハザード廃棄物の取り扱いおよび廃棄は、常に所属機関の規定に従って適切に行ってください。これでビデオを終了します。実験の成功をお祈りいたします。

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