Name: 新生児の脳室下帯のエレクトロ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学ぶ新生児の脳室下帯エレクトロポレーション法で神経幹細胞を遺伝的に標識・操作する技術。プラスミドDNAを側脳室に注入し電気パルスを印加することで、神経発生の分子メカニズムを効率的に研究できる。

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この作品は、国防総省（アイデア開発賞、W81XWH-10-1-0041、AB）、CTの幹細胞助成金（A-B）、および健康NRSA 10668225ホルムアミド（DMF）の国立研究所からの補助金によって支えられている。本材料は、部分的にコネチカット幹細胞研究助成金プログラムの下コネチカット州によってサポートされた仕事に基づいています。その内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもコネチカット、コネチカットやCTイノベーションの州の公衆衛生学教室の国の公式見解を示すものではない、（株）出資者は、データ収集を研究デザインに何の役割を持っていませんと分析、公表することを決定、または原稿の準備。

この手順では、エール大学動物実験委員会の要求に従ったものである。科学者は、動物実験委員会のガイドラインは、その制度上の要件に応じて承認され、使用されていることを確認する必要があります。 1。第1節。 DNAは、ソリューション、およびガラスピペットの作製<ol><li>高純度（OD 280分の260&gt; 1.80）、高濃度（μg/μlの&gt; 2.5）エンドトキシンフリーのDNAを生成します。 </li><li> 22μmのフィルターを通して0.9％生理食塩水や滅菌フィルターを準備します。 </li><li>カンタル線を使用したモデルのPP-830ナリシゲPC-10ガラスピペットプラー場所に10cmの火災洗練されたホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ（1.10 mm外径：1.5ミリメートル、ID）を指定します。 70.5一歩ずつ加重プル℃にプーラーをセット円形の鉗子とのヒントを破ると、ギザギザの縁のための解剖顕微鏡で検査します。 15分間UVランプ下ベベルのヒントや場所。引っ張らピペットは先端の端から2ミリメートルでマークする必要があります。 </li><li>重量/体積速いグリーンsoluti 0.1パーセントを準備乾いた速いグリーンで滅菌濾過0.9％食塩水を混合することにより、上の。 </li></ol> 2。第2節。動物の準備、ガラスピペットの読み込みおよびプラスミドインジェクション<ol><li>ガラスシャーレ4〜予冷に、ケージ0から1までの子犬生後個別に場所を取り外し℃にした後、濡れた氷の上に置きます。 </li><li>約5分後、足のピンチ応答を利用することによって、麻酔の状態を確認してください。脳室内注射への移動が発生しない場合は、件名子犬。 </li><li>ファストグリーン、DNA、および食塩水の組み合わせは急速な蒸発、結晶化、ガラスピペットの封鎖をもたらすことができることに注意するのは重要です。したがって、原液や注射直前にパラフィルム上にアリコート1から2μlを生成します。 </li><li>引っ張らガラスピペットで分注し全体音量を吸引します。 </li><li>親指とあなたの小さい利き手の人差し指で子犬の頭を保持する。 </li><li>ランプを点灯させdがちょうど光ビームの外に子犬の頭を保持する。必要であれば、子犬によって反射された光の量を減らすために、頭の上に生理食塩水を入れた。心室は現在点灯しなければならない。 </li><li>あなたの利き手を使用すると、（ 図1Aおよび1B）に最も近い側脳室に針を挿入します。注射部位は、ラムダ縫合および目と矢状縫合に横2ミリメートルからほぼ等距離にあるべきである。挿入は、側脳室への浸透性を確保すべき、P0は子犬のために2mmのマークにピペットを引っ張った。偶然にも、あなたは、頭蓋内圧のリリースからピペット内に髄液の充填バック表示される場合があります。プラスミドの注入を支援頭蓋内圧を減少させるために、pup.Step 2.8の頭の上にあなたのグリップを緩めます。エアプレッシャーインジェクター（Picospritzer、パーカー）を使用して、側脳室へのプラスミドの約0.5μLを注入します。 </li></ol> 3。第3節。エレクトロポレーションおよびリカバリ<ol><li> SEトン5平方パルス、950ミリ秒間隔で100ボルトで50ミリ秒/パルス、エレクトロポレーション用の発電機の電圧。プラスミドエレクトロの空間特異性は、電荷転送の方向性によって決定される。細心の注意は、SVZ 8に沿って幹細胞集団の異質性を与えられた配置に与えられるべきである。増殖と細胞の運命のレートの違いは、腹と背吻側-尾位置9,10ために特定されました。 </li><li>プラスミドを注入された後、PBSにピンセット電極を浸す。このステップでは、電荷移動を最大にし、抵抗による熱傷を防止するためである。 </li><li>プラスミド注射部位（ 図1Cおよび1D）と同側の耳の近くに子犬の背側壁上に正極を配置します。子犬の鼻面に対側半球腹側部に負極を配置します。 </li><li>パルスフーツを押すことによって、現在の転送を開始する魔女は、背から約25°の角度間隔を使用して横方向に電極をペダルと掃く。 </li><li> 5分間加熱パッド上にエレクトロポレーションした子犬を置きます。優しく穏やかな刺激で子犬を30秒毎に回転させます。 </li></ol>

<ol><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+methods+to+identify+and+manipulate+newly+born+neurons+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 5, 64(2011).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PloS ONE. 3, e1883(2008).</li>
<li>Chesler, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+gene+expression+by+postnatal+electroporation+during+olfactory+interneuron+nurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis.</a> PloS ONE. 3, e1517(2008).</li>
<li>Platel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneity+of+adult+neural+stem+cells+and+the+emerging+complexity+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).</li>
<li>Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+of+defined+lateral+ventricular+walls%3A+a+novel+and+rapid+method+to+study+fate+specification+during+postnatal+forebrain+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis.</a> Neural Development. 6, 13(2011).</li>
<li>de Chevigny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-7a+regulation+of+Pax6+controls+spatial+origin+of+forebrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons.</a> Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).</li>
<li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).</li>
<li>Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+neurogenesis+generates+heterotopias%2C+olfactory+micronodules+and+cortical+infiltration+following+single-cell+Tsc1+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion.</a> Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).</li>
<li>Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+controlled+conditional+knockdown+system+using+the+Tol2+transposon-mediated+technique%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique.</a> PloS ONE. 7, e33380(2012).</li>
</ol>

著者が作る全く開示していません。

ここでは詳細新生児SVZのエレクトロポレーションの技術は、急速かつ確実にラベルを付けたり、SVZの幹細胞およびその子孫を操作するためのテクニックを。エレクトロポレーションは、他の技術と比較して持っていることはいくつかの利点があります。まず、セ​​ルの焦点ラベリングを考えると、1は細胞自律的かつ非細胞自律的な効果を識別することです。誘導系を用いて、第2の、遺伝子操作は、1つのシナプス統合の前または後の効果を比較することができます。また、1は、loxP部位を含むプラスミドで、CRE発現するマウスをエレクトロポレーションによって、複数のプラスミドの使用を回避することができます。第四に、遺伝子レポータープラスミドは転写トランスを研究するために使用することができます。このケースでは、転写活性のみ操作された細胞で測定することができる;サブ領域が顕微解剖されるとき追加された特異性を導入することができる。第五に、一時的な継続的な増殖によるトランジット増幅細胞の標識と希釈OFプラスミドがチミジン類似体11で標識と同様の&quot;birthdating&quot;メソッドとして使用することができます。細胞の一過性の標識が欠点として見...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>重いポリッシュホウケイ酸チューブ</td><td>サター·インストゥルメント</td><td> BF150-110から10 </td><td></td></tr><tr><td>デュアルステージガラスマイクロピペットプラー</td><td>ナリシゲ</td><td> PC-10H </td><td></td></tr><tr><td>速いグリーン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 0521192205 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830方形波パルスジェネレータ</td><td>ハーバード装置</td><td> 45から0052 </td><td></td></tr><tr><td> Tweezertrodes </td><td>ハーバード装置</td><td> 45から0488 </td><td></td></tr><tr><td>光ファイバー光源</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12-562-36 </td><td></td></tr><tr><td>タングステンハロゲンランプ</td><td>ウシオアメリカ株式会社</td><td> 1002247 </td><td></td></tr><tr><td> Picospritzer II </td><td>パーカー·インスツルメンツ</td><td> 052-0312-900 </td><td></td></tr></tbody></table>

新生児の脳室下帯のエレクトロ

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

神経幹細胞（NSC）ライン生後側脳、ニューロン、アストロサイト、上衣細胞1を含む複数の細胞型を生じさせる。 NSCの自己複製、コミットメント、および分化に関わる分子経路を理解することは、活用のための脳を修復し、より良いの中枢神経系障害を理解するための独自の可能性が重要です。哺乳類のシステムを操作するための従来の方法は、全体の動物レベル2で、遺伝子工学の時間がかかり、高価な努力が必要でした。したがって、研究の大半は、in vitroまたは無脊椎動物におけるNSCの分子の機能を検討されている。 ここでは、新生児の脳室下帯（SVZ）エレクトロポレーションと呼ばれている新生児のNPCを操作するための簡単​​かつ迅速な技術を実証した。同様の技術は、胚NSCを研究するために十年前に開発されcorticaに関する研究を支援している3,4リットル開発。さらに最近では、これは5月7日出生後のげっ歯類の前脳を研究するために適用した。この手法は、SVZのNSCおよびその子孫の堅牢なラベリング結果。したがって、生後SVZエレクトロポレーションは、哺乳動物のNSCの遺伝子工学のためのコストと時間の効果的な代替手段を提供します。

背側、背側、そしてピンセット電極の&quot;抜本的な&quot;運動（ 図1E）に続く横下帯と連続してほぼすべての放射状グリアの標識における新生児の脳室下帯エレクトロポレーション結果。しかし、エレクトロポレーションは、それぞれの実験の要件に合わせたが、電極を席巻し、ビデオに記載されている特定の配置と向きを使用していないことができます。例えば、背側に限局放射状グリアは、それらのライニングから心室の横断面を異なるため、1つは単一の領域9,10エレクトロポを選ぶことができます。さらに特異性も小さい電極を使用して指定することができます。 プラスミドDNAを迅速に最初の3週間11内に希釈される。したがって、プラスミドDNAを用いて同定するゲノム改変された細胞は推奨されません。この制限を回避するには、CREリコンビナーゼ発現プラスミドはIntrod学アールゲノム的に発現して蛍光タンパク質（tdTomato）12の上流のlox P部位に隣接停止シーケンスを持っているマウスへのGFPと共にuced...

我々は、新生児の脳室下帯のエレクトロポレーションと呼ばれる低侵襲技術を実証した。テクニックは、新生児の仔の側脳室にプラスミドDNAを注入し、提供し、遺伝的に神経幹細胞を操作するために電流を印加することで構成されています

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

この手順の目的は、脳室下ゾーン神経幹細胞の分子成分を遺伝的に標識し、操作することです。これは、最初にDNAをロードしたガラスピペットをPゼロPの側脳室に挿入することによって達成されます。これにより、側脳室の内側を覆う神経幹細胞にDNAを移行することができます。最終的には、免疫組織化学、分子生物学、顕微鏡法、電気生理学などの分子技術を組み合わせて、脳室下領域神経幹細胞の運命、増殖、遊走、成熟の変化を視覚化します。新生児脳室内ゾーンエレクトロポレーションは、ニューロン幹細胞とその子孫の増殖、分化、移動、成熟の調節に関与する分子経路など、ニューロン新生の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。トランスジェニックマウスなどの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、SVZのニューロン幹細胞を迅速かつ堅牢に標識し、時間効率と費用対効果の高い方法で行えることです。まず、エレクトロピュレートへのDNAが高純度で濃縮されており、エンドトキシンを含まないことを確認します。10センチメートルのファイヤーポリッシュBOシリカガラスキャピラリーチューブをピペットに引き込みます。ここでは、摂氏70.5度で1ステップの加重プルを引っ張るように設定されたPP8 30 ghhi PC 10ピペットプーラーを使用します ピペットを引っ張った後、円形の鉗子を使用して先端を壊します。次に、解剖顕微鏡でピペットを検査し、ギザギザのエッジがないことを確認します。必要に応じて、砥石を使用して先端を面取りすることができます。次に、注がれたピペットをUVランプの下に15分間置きます。15分が経過したら、チップの端から2mmのところに細いチップマーカーでピペットに印を付けます。最後に、滅菌ろ過された0.9%滅菌生理食塩水と乾燥した速粘液緑色麻酔薬を混合することにより、体積あたり0.1重量の速粘液を調製します。生後0〜1日の仔犬を、ガラス製のペトリ皿を摂氏4度に予め冷やして西の氷の上に置いた約5分後、足のつまみ反応を利用して麻酔の状態を判定する。動きがない場合は、脳室内注射を開始します。.ファストグリーン溶液とDNA溶液を組み合わせ、バイオフィルムに1〜2マイクロリットルを分注します。高速グリーン溶液とDNAの組み合わせは、ガラスピペットのブロッキングにより急速な蒸発と結晶化をもたらし、マイクロフィルムシリンジで全アリコート容量を吸引し、ガラスピペットを空気圧インジェクターにロードする可能性があるため、これを注入直前に行うことが重要です。次に、最後の利き手の親指と人差し指の間に子犬の頭をそっとつかんで保持します。次に、ランプをオンにして、子犬の頭を光線のすぐ外側に保持します。心室がはっきりと見えない場合は、滅菌生理食塩水で頭を湿らせて、頭皮によって反射される光の量を減らします。次に、利き手を使って、針を手

neonatal-subventricular-zone-electroporation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

E16ラット胚の子宮内での脳室内注入とエレクトロポレーションで

E15マウス胚の子宮内での脳室内注入とエレクトロポレーションで

子宮内エレクトロポレーションでは発達中の中枢神経系（CNS）における空間的および時間的に制御された方法で迅速な遺伝子デリバリーを可能にする。ここでは、終脳、間脳や網膜など、複数の胚中枢神経系領域、中に発現構築物を提供するために使用することができる子宮内エレクトロポレーションプロトコルにおける適応性の高いを説明します。...

使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

このプロトコルは含ま改良植手順を説明...

exの子宮内エレクトロポレーションと全半球植：早期皮質の発達についての研究のための簡単な実験方法

神経芽細胞の遊走は、出生後の神経発生における基本的なイベントです。我々は、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよび急性脳スライスのタイムラプスイメージングを使用して、移行のその後の視覚化によって神経芽細胞の効率的な標識のためのプロトコルを記述します。私たちは、ビデオトラッキングによる神経芽細胞の動態を定量的に分析するための説明が含まれています。...

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

軟膜表面はますます注目を受けているCNSにおけるユニークな前駆ゾーンです。ここで、我々の詳細を修飾エレクトロポレーション法を使用して、この前駆ゾーンの迅速な遺伝子操作のための方法。この手順は、細胞系統および細胞分化に関与するシグナル伝達経路の細胞および分子研究のために使用することができ、娘細胞の運命および特性を解明する。...

新生児軟膜表面エレクトロ

この手順は、子宮内エレクトロポレーションによって、発生中のマウス前脳の介在ニューロンを標的にする方法を示しています。この技術は、皮質の表層に向けられた介在ニューロンサブタイプで選択的な遺伝子発現を達成するのに特に効率的でした。...

皮質介在ニューロンのサブタイプ選択的エレクトロポレーション

この原稿は、単一細胞レベルおよび蛍光標識された神経細胞の興奮で、ニューロンの構造的接続性を記述するために子宮内エレクトロポレーション（IUE） で使用するプロトコルを提供します。組織学は、樹状突起および軸索突起を特徴付けるために使用されます。急性スライスにおける全細胞記録は、興奮性を調査するために使用されます。...

子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

子宮エレクトロポレーションの二重は、空間的および時間的に分離された細胞集団を標的にすることを可能にする。この技術は、通常の条件で蛍光タンパク質を使用して、また、目的の遺伝子を摂動する機能実験の後に、それらの細胞集団間の相互作用を視覚化するのに有用である。...

時間的および空間的に分離された細胞集団を標的とする子宮エレクトロポレーションの二重

ここで提示されるのが、子宮エレクトロポレーションで使用する胚フェレット脳における遺伝子操作を行うプロトコルである。この方法は、生体内の新皮質における神経前駆細胞の標的化を可能にする。...

インビボ子宮内電気ポレーションによるフェレット新皮質における神経前駆細胞の標的化

霊長類の大脳オルガノイドのエレクトロポレーションは、霊長類(病原)生理学的新皮質の発生に近いモデルシステムにおいて、異なる前駆細胞タイプおよびニューロンに一過性の遺伝子改変を導入するための正確かつ効率的なアプローチを提供します。これにより、神経発達および進化過程の研究が可能になり、疾患モデリングにも適用できます。...

霊長類脳オルガノイドの遺伝子改変のための標的マイクロインジェクションとエレクトロポレーション

学ぶ新生児の脳室下帯エレクトロポレーション法で神経幹細胞を遺伝的に標識・操作する技術。プラスミドDNAを側脳室に注入し電気パルスを印加することで、神経発生の分子メカニズムを効率的に研究できる。

新生児の脳室下帯のエレクトロ

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