Name: 微小血管機能およびリモデリングに動脈結紮の影響を評価するためにネズミSpinotrapeziusモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: 学ぶ動脈結紮によるネズミSpinotrapeziusモデルの構築法。血管内視鏡と共焦点顕微鏡を用いて微小血管リモデリングと機能性血管拡張を評価し、虚血性疾患における血管応答性の理解を深める。

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我々は彼のトラック &quot;空​​港ラウンジ&quot;、 &quot;壁紙&quot;、および &quot;イブニングメロドラマ（出現順に）を含め、関連するビデオで彼のクリエイティブコモンズライセンスされた音楽の使用のためにケビン·マクラウドを認める。&quot;我々はまた、手術ビデオで彼らの支援のためNdubisi OkekeとフレデリックTorstrickを承認したいと思います。

1。 Spinotrapeziusフィード動脈結紮手術<ol><li>腹腔内注射することにより、マウスを麻酔。 100 mg / mlのケタミンの0.06ミリリットル：0.5 mlシリンジ、策定中で 20.0 mg / mlのキシラジンの0.03ミリリットル 0.4 mg / mlとアトロピンの0.01ミリリットル 0.9％生理食塩水の0.30ミリリットル。 用量：グラム体重当たり0.01ミリリットルの*は、ip </li></ol>マウスの回復が誘導から時間内に収まるようマウス株と株価時*線量変数は、それに応じて調整してください。 <ol start="2"><li>角膜の乾燥を防ぐために、標準の眼軟膏を適用します。 </li><li>脱毛クリームの簡単なアプリケーションに続いて、トリミングバリカンを使用して、バックから髪を削除します。 </li><li>クロルヘキシジンやポビドンヨードで手術野を消毒してください。ポビドンヨードで終わる、エタノールで3回ポビドンヨード代替。 </li><li>加熱パッドと滅菌ドレープで、先に調製した外科的な作業面にマウスを移すに代わるものであること。 </li><li>アイリスはさみや鉗子標準パターンを使用して肩甲骨の骨突出に尾約5mm（ 例えば 、FST、11271から30）はテンで背部皮膚を通して組織を線形切開（3-5 mm）を作成し、平行切断棘がある。ターゲットの切開部位は、皮膚の色素沈着が許せば背脂肪パッドの皮可視化によって特定されるかもしれません;脂肪パッドの尾国境でカット。必要に応じて切開を展開し、春のはさみを使用して、セカンダリの皮膚層を貫通している。 <ol><li>解剖学ノート - spinotrapezius筋肉が背側に位置し、背骨の両側に沿って、L3へのT4から延びている。前縁はほぼ肩甲骨に横方向に延びる。筋肉は最も後縁は前縁に内側に位置しており、背骨と揃う築くことができるように尾側方向に先細り。二つの脂肪パッドも注意することが重要であり、spinotrapeziusに直接背腹敷設頭蓋2分の1に向かって筋肉。 </li><li>偽結紮手術はspinotrapezius血管系のリモデリングに変化は見られなかったような切開に起因する炎症は、血管リモデリング応答に影響を及ぼさないことが示されている。二つの空間的な要因がこの結果に貢献しています。最初の切開は筋肉内の血管反応は、典型的に検査され、関心領域から頭蓋方向に5mmによって除去される。また、背部皮膚の切開部位はspinotrapezius筋肉の頭蓋第三の上に位置して腹脂肪パッドによって血管結紮部位から分離されている。 </li></ol></li><li>筋肉の乾燥を防ぐために温めておいたリンゲル液で切開を灌漑。パパベリンなどの血管拡張剤の適用は、連結のための標的動脈を可視化するのに役立つ。 </li><li>解剖顕微鏡下では、基礎となるMUSCから（削除せず）解剖を鈍らせると分離するために背の白い脂肪パッドを鉗子を使用それが入り、その外側縁にspinotrapeziusを離れると、血管系を可視化するために、ウラル組織。 </li><li> 1つまたは2つのペアになって静脈に沿って、筋肉の外側縁にで、その途中でspinotrapeziusに腹の脂肪パッドを通過する標的動脈の位置を確認します。この動脈は反射や筋肉内動脈の経路を観察するために筋肉を交換することによって確認することができる筋肉の尾半分の大部分を供給します。ライゲーションのためのターゲットの場所は動脈腹脂肪パッドを終了し、筋肉に入るのセグメントであり、この地域では非常にアクセスが可能です。動脈·静脈のペアが優しくこの地域で腹脂肪パッドから分離する必要があるかもしれません。 spinotrapeziusが横背と腹脂肪パッドのどちらかその船を含む、複数の動脈·静脈のペアによって供給されることに注意してください。これらの船舶を妨害しないように注意してください。 <ol><li>複数の指標が動脈を区別するために使用することができる静脈から。最善の方法の1つは優しくマイクロプローブで血液の流れを妨げると筋肉から上流に移動することです。閉塞が解除されるまでの流れは動脈内に再開されません。静脈の壁は動脈が欠けている結合組織の白っぽい鞘を含んでいるので色も、​​使用することができます。静脈は一般的にサイズが大きくなっているようにまた、一つは、血管拡張剤を塗布する前に直径を考慮することがあります。 </li></ol></li><li>動脈は、そのペア静脈に近接して、典型的には、動脈の後ろにマイクロプローブを通過し、自然で広いギャップを作るために先端を使用して、マイクロプローブと約5mmのセグメントを分離するために、第5鉗子で鈍的切開を使用動脈と静脈の間の裂け目。これは、縫合糸がスレッドに経由されるギャップである。 </li><li> 10から0シングルスレッド縫合糸と針ホルダー場所外科医の結び目を使用して、解剖セグメントの近位端に向かって送り動脈（〜70μmの直径）の周りのライゲーションを用いた。ナンプラー動脈の切断を可能にするために合字との間に十分な分離とCE解剖動脈セグメントの遠位端に向かって追加のライゲーション、。 <ol><li> spinotrapeziusフィード動脈に関連付けられた小スケールは、大腿動脈などの大きな血管の結紮に比べて増加した外科的困難につながる。経験の浅い外科医は特に剥離率の高さ、不注意による出血、他の手術の合併症を持つことになります。特に懸念されるのは、識別および流れはちょうど切削前に妨害された後に無色の動脈を切断することの難しさです。外科医は動脈だけでなく、2字の分離を容易に観察可能とカットの確認を横断する場所を見つけるのに視覚的なガイドを持っているとして、これらの理由から、2合字を配置すること、手​​続きに不慣れな方にお勧めです。しかし、より多くの経験豊富な外科医がいる限り、彼らは明らかにすることができるよう、十分な合字を見つけることができるリガチャーの動脈下流を識別し、カット。このテクニックは意図せずに鋭い結紮縫合糸に近い容器をニッキングのリスクを減少させている間、それは動脈が離断された確認の増加難しさを含む欠点がないわけではない。 </li></ol></li><li>下流ライゲーション部位（筋肉に向かってIE）の血流の減少（遮られたRBC列）を観察することにより、ライゲーションを確認します。 </li><li>解剖用ハサミを使用するには、2つの合字の間にライゲートした動脈を横断する。唯一の1字が置かれていた場合（11a）は、下流方向に細心の注意を払ってカットします。 </li><li>プレーンフィルム（1mm）を読み込ま薬は実験手順の一環として、（尾）の下流に配置されてもよい。 </li><li>彼らの元の向きに変位筋膜と脂肪組織の位置を変更します。 </li><li> 8から0非吸収性縫合糸を用いて皮膚切開を閉じます。その後観察下準備温水回復ケージにマウスを置き、APの管理ブピバカイン、0.02〜0.05ミリリットル0.25パーセント局所浸潤などの鎮痛propriate。 </li></ol> 2。 in situで Spinotrapezius生体顕微鏡、 <ol><li> 3月4日、L·min -1の流速で100％酸素で気化イソフルラン3から4パーセントで誘導チャンバ内でマウスを麻酔。 <ol><li>注射麻酔薬よりも少ない心血管うつ病があるので、吸入麻酔の使用は、機能的な測定のために好適である。利用できないで吸入麻酔なら、そのようなペントバルビタールナトリウムとして長時間作用型の注射麻酔薬は、動物が配置された後に繰り返し注射を避けるために好ましい。 </li></ol></li><li>一度麻酔し、継続的にメンテナンス濃度（一般に約2％）と、0.5から1、L·min -1の流量で麻酔マスク（通称ノーズコーン）を通じてイソフルラン届ける。 <ol><li>マウスは、主に彼らの鼻の通路を通って換気するので、それが唯一のNECです麻酔マスクのダイヤフラムと鼻をカバーするessary。 </li></ol></li><li>必要であれば、トリミングバリカン及び脱毛クリームを使用して、バックから髪を削除します。 </li><li>熱パッドに動物を輸送する。 <ol><li>低温誘導性の血管収縮を防ぐために適温の状態でマウスを維持することが重要であるが、これはランプ、水循環熱パッド、電子レンジで加熱パッド等を介して行うことができます</li></ol></li><li>直腸温度プローブを挿入し、35にサーモコントローラ℃に設定してください。 </li><li>アイリスはさみと標準パターン鉗子を用いspinotrapeziusの尾側端で皮膚切開を加えます。 </li><li> 、脂肪パッドに頭側切開を延長馬の靴の切開を作成して、乾燥を防ぐためにラップで皮弁をカバーしています。 </li><li>可視性を最大化するための鉗子と春のハサミで皮下結合組織を解剖鈍らせる。 </li><li>近い峠として刺激電極を置き、できるだけ熱、現在のフィールドの大きさを最小限にし、脊椎へのちょうど横に露出筋肉の尾終わりにそれらを配置することができる。 </li><li> 1 Hzで配信さ200μ秒の持続時間、2ミリアンペア振幅の方形波で、電極のデータ集録システムは、電極刺激アイソレータ、およびコンピュータ·コントローラを用いた電極配置を確認するためのテスト刺激を行う。 </li><li>乾燥を防ぐために露出した筋肉の上にラップを置きます。 </li><li>血管径を平衡化される時に、30分の期間を計時開始。 </li><li>血管構造を表示するためにspinotrapezius筋肉の上に生体顕微鏡を置きます。 <ol><li>浸レンズを使用する場合は、客観的かつプラスチックラップの間に、PBSを一滴。 </li></ol></li><li>主な動脈（可視最大の船舶）の上から始めて、興味のある容器を見つけるために、XY平面でステージを操作します。 <ol><li>小さなarteriolの可視化反射光顕微鏡でesは赤血球列が提供するよりもコントラストが必要です。当社は、主に微小血管のコントラストを高めるためにサイドストリーム暗視野イメージング顕微鏡を使用していますが、コントラストは、高分子蛍光デキストランを静脈内注射後の反射光蛍光顕微鏡で改善することができます。 </li></ol></li><li> 30分間平衡化した後、目的の血管の画像/ビデオをキャプチャします。 </li><li>上記のように、90秒間、200マイクロ秒の持続時間の方形波で8 Hzで配信2ミリアンペア振幅を、筋肉を刺激する。 </li><li>別の画像/ビデオ直後の刺激をキャプチャして、血管が安静時直径に戻されるまで、毎分をキャプチャし続け、10分〜。 </li><li>反対側の筋肉を使ってステップ6から18を繰り返します。 </li><li>データ解析は、画像解析ソフトを用いてビデオキャリパーまたはオフラインでリアルタイムに行うことができます。 </li><li>マウスが続く安楽死させるる動物実験委員会のプロトコル。 </li></ol> 3。 Spinotrapeziusティッシュハーベストおよび固定<ol><li>腹腔内注射によりマウスを麻酔; Spinotrapeziusフィード動脈結紮のステップ1のように定式化。 </li><li>アイリスはさみと標準パターン鉗子を用いて、マウスの肩甲骨の骨突出に頭蓋切開数ミリメートルを作る。両側尾次に横方向に切開を展開します。 </li><li>優しく肌を反射し、浅筋膜を切断することによって、背胴から肌を解放します。 </li><li>標準ピンセットを用いて背脂肪組織を除去した後、筋肉を反映しており、同様に腹の脂肪組織を切開する鈍的切開を使用しています。 </li><li>鉗子と春のはさみを使用して筋肉を覆う筋膜を取り除きます。このステップでは難しく、時間がかかる場合がありますが、免疫蛍光染色とイメージングを向上させることが重要であることができます。組織が水和保つことは筋膜の除去を容易にすることができる。 </li><li>見つける側筋の境界線、およびそれに腹側にある脂肪体からspinotrapezius筋肉を分離するために鈍的切開を使用しています。 </li><li>尾側方向への頭蓋内の鈍的切開を続行します。いくつかの血管が筋肉のこの腹面に出入りすることに注意してください。灌流が必要な場合は、これらの血管をtransecting前に行われるべきです。その筋肉の尾側半分に、その外側縁を挿入それに腹を嘘筋肉にも注意してください。いくつかのカットは完全にエッジを定義し、解放するために、この境界に沿って必要な場合があります。 </li><li>消費税​​spinotrapezius筋肉。これを行うには： <ol><li>上記のような筋肉の外側縁無料。 </li><li>筋肉のほとんどの頭蓋程度横切ってカットします。 </li><li>矢状面において、内側縁（背骨に沿って）に沿って切り取ります。 </li></ol></li><li>反対側の筋肉にある手順の4から9を繰り返し、次に、mを安楽死させる動物実験委員会の承認された方法によってウーズ。 </li><li>冷メタノールに浸漬（4℃）によって、または室温で20分間、4％パラホルムアルデヒド/脱イオン水溶液中のゼラチンコートしたスライドガラス上の組織を固定してください。 <ol><li>あるいは、灌流固定を採用してもよい。手順2の前に、1の5ミリリットル×4の5ミリリットル続く、0.1mMのCaCl 2および左心室を経由して2％のヘパリン生理食塩水、トリス緩衝と右心房に切開を行い、開胸を行い、灌流血管系％容器固定用パラホルムアルデヒド、最後に1の5ミリリットル×0.1 mMのCaCl 2 7と生理食塩水、トリス緩衝。 </li></ol></li><li>すぐに次の固定、4回20分間試料を洗う各0.1％サポニンと0.01Mのリン酸緩衝食塩水（PBS）を用いて行った。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、彼らが競合する金融利害関係はありません宣言。

ここに提示されたマウスspinotrapezius結紮モデルは動脈閉塞から生じることを機能的および構造的適応を研究するために効果的な小さな動物モデルである。このモデルは、広く使われている後肢虚血モデル4に相補的である、という点では高い空間分解能で無傷の微小血管のネットワークの全体の筋肉のビューを提供します。この筋肉がちょうど背部の皮膚の下に配置されているのでまた、それは生体顕微鏡でシリアルイメージングへ、そして灌流又は薄膜2を介して注入局所薬物送達へのアクセスが可能です。これらの機能は、それ動脈閉塞後の血管リモデリングと血管拡張機能における新規治療標的の影響を研究する中で魅力的な小さな動物モデルを確認します。 いくつかの主要なdにより後肢結紮モデルで得られたデータにspinotrapezius結紮モデルで得られたデータを比較する際にその注意を払って使用するようにしてくださいifferences。まず、spinotrapezius筋肉は筋肉を安定しており、彼らは機能とファイバ型分布の面で、脚の筋肉とは異なります。私たちのグループは、以前spinotrapezius筋における動脈結紮として後肢モデル1,8における大腿動脈結紮後に後足で観察された低酸素状態に比べて、よく発達した側副動脈網を有する株で小さいか無視できる低酸素状態を作成することを実証しています- 10。我々はまた、C57BL / 6マウスに比べてspinotrapezius結紮モデルは毛細血管担保と既存細動脈コネクション3の拡大によりC57BL / 6改造によってBalb / cマウスのネットワーク改造で、Balb / cマウスの異なるリフォーム応答を生成することが示されている。これらの観察および後肢結紮モデルで作られたものとの間に興味深い平行があり、ここで、Balb / cマウスをC57BL / 6マウス9,11,12に比べライゲーション後の長期灌流回復を体験&lt;/&gt;（商標）。我々はまだspinotrapezius結紮モデルにおいて、これらの予測変数をテストしていないものの、組織虚血、マウスの13歳性別14、病気15の存在の他のモデルでも、動脈閉塞症に対する組織の反応に影響を与える。 第二に、spinotrapeziusモデルで連結されている動脈のサイズは大腿動脈よりも実質的に小さいため、ライゲーションはspinotrapeziusで、循環器ツリーの下位レベルで、 すなわち 、さらに下流にある小さな組織の体積に影響を与える後肢3と比較。この介入にそれぞれの生理学的反応（ 例えば、血管リモデリング）を比較するとき、したがって、これら2つのモデルでライゲーションの場所における解剖学的な違いを考慮する必要があります。 第三に、spinotrapeziusの薄さは、酸素が隣国から組織のunperfused部分に到達することを許すことができる3上述のように後肢モデルで組み合わさ虚血および低酸素症に比べて組織。第四に、ライゲーションのspinotrapezius下流の部分への流れの回復は後肢ライゲーションよりも高速です。 spinotrapezius結紮モデルはユニークな慢性的なモデルであり、虚血再灌流障害の一過性動脈閉塞やモデルの他のモデルと混同してはいけません。我々は、これらの条件の種類に対応するため、このモデルを適応させることが可能に考慮するが、これは、本明細書で提示された仕事の範囲の外にあります。最後に、私たちは若いとマウスそれ以外の場合は健康や高い心拍数5のような固有の生理的な限界のために利用する場合は特に直接、ヒトでの虚血性疾患の臨床症状には、このモデルでは前臨床観察を関連を警戒。それにもかかわらず、我々は、ライゲーションに組織応答の基本的なメカニズムを明らかにし、潜在的に識別するための貴重なツールとして、この新しいモデルを考えるを用いたin vivoの設定でrapeutic目標。 spinotrapeziusフィード動脈結紮手続において提供される手術のノートに加えて、（解剖学ノート（6A）、静脈（図9a）から動脈を区別する、および単一のリガチャ（11a）の使用）からプロシージャの利点のいくつかの他の側面議論。 まず、背脂肪パッドボーダー（または経皮視覚化が不可能な場合は肩甲骨に尾数mm）上で行われ、最初の切開は、理想的には外科医が快適である限り小さくし、必要に応じて手順の間に展開されます。この慣行は、外科医のために便利である切開を閉じるために必要な縫合を最小限に手続き時間を短縮し、リカバリ中にも動物への刺激が少ないです。筋肉が拡張されたフィールドで見つけることが容易になることができるので、別の方法として、より大きな皮膚切開は、外科医の好みに応じて適切であるかもしれません。この場合には、切開月背骨に向かって折りたたみ可能にするために内側オープンフェースで馬蹄形の恩恵を受ける。皮膚切開を行うと表面の血管が損傷して出血を引き起こしている場合、セカンダリ皮膚の層を通って延びているが、滅菌ガーゼで軽く圧力を適用し、止血のための時間を提供します。 また、ノートのは、必要最小限の力で組織を処理するために重要であり、可能な限り近い筋の外側縁へと離れて、意図虚血領域からピンセットで保持します。この習慣は動脈結紮によって誘発血管リモデリング応答を混乱かもしれない追加の炎症媒介組織反応につながる可能性挫滅を回避するのに役立ちます。 結論として、我々は細動脈の結紮に血管や組織の応答を調べるための外科的モデルとしてマウスspinotrapezius筋肉の使用を実証している。このモデルは、（たとえば、血管の変化の生体内評価に適しています例えば、機能的血管拡張）、および血管の変化の ex vivo での評価（例えば、血管網の免疫蛍光イメージングと定量）について。両方の前臨床および臨床研究では、細動脈の閉塞（ヒトではマウスやアテローム性動脈硬化プラークのライゲーションなどを通じて）への個々の反応は、自分の年齢に依存していることが実証されている疾患の有無（ 例えば糖尿病）閉塞動脈の直径、個々の遺伝子構造、及び11月15日組織の代謝要求。などここで提示されるものとマウスモデルでは、これらの複雑な関係に捜査を容易に株特異的解剖学的および遺伝的差異および疾患特異的な表現型の研究を利用する。

慢性虚血の動物モデルは、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、脳血管疾患などの虚血性疾患の病態生理を研究するための貴重なツールです。げっ歯類では、人間のように、動脈閉塞は動脈形成と血管新生を含む、血管網の構造的な改造につながる。健康で若い患者では、この改造は、虚血誘発傷害から組織を救出するために十分なことができますが、糖尿病などの併存疾患が深刻な改造と回復を脅かす可能性があります。血管リモデリングイベントのメカニズムを理解することは、これらの内因性血管再生プロセスを刺激する治療法を開発するために不可欠です。 現時点では、後肢の大腿動脈結紮または切除が4,5小動物の慢性虚血誘発性血管リモデリングを研究するための標準的な技術である。の直径は、接続性、および反応性の解析ライゲートした大腿動脈の血管網の下流を構成する微小血管は、しかし、筋肉の厚さに起因することは困難である。この安定背肉1における横送り動脈の一方的なライゲーション：我々は、マウスspinotrapezius筋における動脈結紮モデルを開発した。比較的薄いspinotrapezius（60〜200μm）は全組織にわたる血管リモデリングイベントの詳細な検査を可能にする、単一セルの解像度を持つネットワーク全体のトポロジを評価するための専用の顔の免疫染色に適している。 spinotrapeziusも表面的でアクセス可能であり、したがって、その血管は容易に血管反応性に改造や動脈結紮の影響の効率的な特性のために、生体内顕微鏡によって観察されています。 本稿では、詳細に記述し、マウスspinotrapezius動脈結紮モデルを示しています。 vivoおよびex vivoで 、私の中で両方の評価は、次の手術thodsは虚血状態6、全体の筋肉の微小血管網の免疫蛍光イメージングの下で損なわれることが示されている機能的な血管拡張の測定を含む、記載されている。また、モデルの有用性を実証するための2つの別々のパイロット試験の結果が含まれています。まず、C57BL / 6マウス（ 図2B）における血管蛇行の統計的に有意な増加を誘導するために動脈結紮モデルを利用した。細動脈の血行における動脈形成時のねじれが大きくなる。担保動脈の欠如（ 例えば BALB / C）に起因する虚血に対してより脆弱である他のマウス系統では、毛細管動脈血は10を観察される。毛細管動脈血が増加直径およびα-平滑筋アクチン反応の開発により検出される。第二に、筋肉の機能的電気刺激はspinotrapeziの端末動脈に血管拡張につながる私達（ 図3B）。

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>アイリスはさみ</td><td> FST </td><td> 14090から09 </td><td>タイプ：ツール</td></tr><tr><td>サイズ7鉗子</td><td> FST </td><td> 11271から30 </td><td>タイプ：ツール</td></tr><tr><td>サイズ5鉗子</td><td> FST </td><td> 11251から20 </td><td>タイプ：ツール</td></tr><tr><td>春のはさみ</td><td> Roboz </td><td> RS5671 </td><td>タイプ：ツール</td></tr><tr><td>マイクロプローブ</td><td> FST </td><td> 10140から03 </td><td>タイプ：ツール ストレートプローブで置換されてもよい</td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td> FST </td><td> 12500から12 </td><td>タイプ：ツール</td></tr><tr><td>誘導室</td><td> DistのJD医療。株式会社</td><td> IC-1086 </td><td>タイプ：道具</td></tr><tr><td>アイジェル</td><td> Dechra </td><td> NDC 17033-211-38 </td><td>タイプ：試薬</td></tr><tr><td>熱パッド</td><td> FST </td><td> 21060から01 </td><td>タイプ：道具</td></tr><tr><td>直腸温度プローブ</td><td> FST </td><td> 21060から01 </td><td>タイプ：道具</td></tr><tr><td>刺激電極</td><td> FHC </td><td> UEWSGCSE0N1M </td><td>タイプ：道具</td></tr><tr><td> Artisanのポリマークレイ</td><td> Polyform </td><td> N / A </td><td>タイプ：道具</td></tr><tr><td> PowerLabデータ収録システム</td><td> ADInstruments </td><td> MLの845 </td><td>タイプ：道具</td></tr><tr><td>刺激アイソレータ</td><td> ADInstruments </td><td> FE 180 </td><td>タイプ：道具</td></tr><tr><td> LabChart </td><td> ADInstruments </td><td> ML S060 / 7 </td><td>種別：ソフトウェア</td></tr&gt; <tr><td>反射光蛍光顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> BFXM </td><td>タイプ：道具</td></tr><tr><td>高MW蛍光デキストラン</td><td>シグマ</td><td> FD250S-100MG </td><td>タイプ：試薬</td></tr><tr><td>ビデオキャリパー</td><td>コロラドビデオ</td><td> 308 </td><td>タイプ：道具</td></tr><tr><td>自動血管分析（AVA） </td><td> Microvision社メディカル</td><td></td><td>種別：ソフトウェア</td></tr><tr><td>抗αSMA共役フルオロフォア</td><td>シグマ</td><td> 1A4-Cy3を</td><td>タイプ：試薬 クローン、1:100 </td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> BFXM </td><td>タイプ：道具</td></tr><tr><td>高分子蛍光デキストラン</td><td>シグマ</td><td> FD250S-100MG </td><td>タイプ：試薬</td></tr></tbody></table>

微小血管機能およびリモデリングに動脈結紮の影響を評価するためにネズミspinotrapeziusモデル

Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling

ネズミspinotrapeziusはT3からL4まで延びて薄く、表面的な骨格支持筋であり、背側皮膚切開で簡単にアクセスできます。そのユニークな解剖学的構造は、虚血性損傷とその後の血管リモデリングの調査のためspinotrapeziusが便利になります。ここでは、私たちの研究チームが開発し、1月3日以前に出版されたネズミspinotrapezius筋における動脈結紮モデルを示しています。そのようなBalb / cマウスなどの特定の脆弱なマウス系統については、この結紮手術は確実に骨格筋虚血を作成し、血行再建を刺激する治療法を調査するためのプラットフォームとして機能します。評価の方法はまた、生体内および共焦点顕微鏡の使用を含む、実証されています。 spinotrapeziusはよく、そのアクセシビリティ（浅背解剖学）との相対的な薄さ（60〜200ミクロン）のためにこのようなイメージング研究に適しています。 spinotrapezius筋肉は容易に顔途中でマウントすることができ組織学的切片なし全筋肉の微小血管網のイメージング。我々は、機能的な血管拡張の手順を次のメトリックを取得する生体顕微鏡を使用することを記載し、具体的には、筋収縮の結果としてarterilar直径の増加。我々はまた、研究や共焦点顕微鏡を使用することを免疫染色に必要な前駆体、組織を採取し、固定するための手順を示しています。

ライゲーションを受けるspinotrapezius筋肉を供給する主要な動脈の外科ビューは、関心のある領域を示すラベルと、 図1に示されている。一週間後にライゲーションライゲーション動脈から直接下流に位置する筋肉の収穫と免疫領域の例共焦点画像を図2Aに示されています。平滑筋細胞（赤色）を発現している平滑筋α-アクチンを含む拡大された担保の細動脈は結紮後に蛇行特性を表示します。ライゲートした筋肉内の血管経路の長さとコードの距離（すなわち、同じ容器のパスの端点上に延びる線）との比として報告血管蛇行は、（右）（; n = 8の図2B）非連結反対側の筋肉への相対的な強化されてい図3は、終末細動脈血管拡張機能が生体顕微鏡を用いて測定されたパイロット·スタディの結果を示しています。予想されるように、細動脈のディ<html> ameterが大幅に電気刺激によって誘発される筋収縮後に増加します。 <img src="/files/ftp_upload/50218/50218fig1.jpg" alt="図1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50218/50218fig1highres.jpg"/> 図1。反映spinotrapezius筋肉と送り動脈の手術野。フィード動脈はA0で示される2つの場所で連結する。これらの合字間や血流の閉塞後、動脈が示さサイトでは、Dが概説し、spinotrapezius筋肉に、AがCで概説腹脂肪、動脈からの遷移のターゲットセグメントを示した部位に離断されている矢印Bの流れの方向は破線の矢印Eで示されているとghres.jpg &quot;/&gt; 図2。蛇行のパイロットスタディのためspinotrapezius筋微小血管ネットワークの共焦点画像。（）を回収し、全マウントの筋肉は平滑筋α-アクチンについて免疫染色し、共焦点顕微鏡を用いて画像化した。視野がライゲーションされた細動脈後1週間ライゲーションの直接下流に位置する筋肉の領域を示している。 。曲がりくねった血管た（p = 0.035; 1スチューデントのt検定）（B）のパイロットスタディの結果が大幅に増加を示してライゲーションの結果として筋肉に明白であるに血管経路の長さによって測定された蛇行はライゲート筋肉で毛細血管によって示される反対側の対照と比較して、C57BL / 6マウス（n = 8）での裁判のための臍帯距離比。 <img src="/files/ftp_upload/50218/50218fig3.jpg" alt="図3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50218/50218fig3highres.jpg"/> ふぃぎゅRE 3。 in vivoでの spinotrapezius細動脈の機能的血管拡張の生体顕微鏡イメージング、。（）安静時spinotrapeziusターミナル動脈の代表的な顕微鏡写真（左）と、直ちに8 Hzの筋収縮（右）の中止に続く。安静時（b）端子細動脈径（ 8.5±0.5μmで、左）と直後（11±1μmで、真ん中）が有意に細動脈径（増加した筋収縮の90秒は、p = 0.032; 1尾）は、BALB / cマウスのt-検定ペアリング（N = 6）。変化率は（右）を示した。

我々は、ステップバイステップの手順および必要な器具の説明など、ネズミspinotrapezius筋における新規動脈結紮モデルを示しています。我々は、手術や生体共焦点顕微鏡を用いた血管網の再構築と機能的な血管拡張に関連する関連するアウトカムの測定について説明します。

微小血管機能およびリモデリングに動脈結紮の影響を評価するためにネズミSpinotrapeziusモデル

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. ...

末梢血管疾患は人口の約12〜14%に影響を及ぼし、特に喫煙者や糖尿病、肥満、高血圧、進行期、または動脈硬化を持つ個人に多く見られます。この手術の目的は、鏡像的な脊柱台形筋の尾側半分に供給する3本の栄養動脈のうち1本を結紮することで、骨格筋虚血モデルを作成することです。このアニメーションでは、これらの動脈の一般的な位置を示し、虚血に対する標的となる結紮部位を示しています。マウスの系統に応じて、血管組織に動脈欠損に特徴的な変化が生じます。これには、バイパス側路の形成や血管の蛇行性の増大が含まれます。また、生体顕微鏡を用いて、脊柱僧帽筋における機能的な血管拡張処置を行う方法についても解説します。ここでは、慎重に筋肉を露出させ、電源およびコントローラーを備えた刺激電極を配置し、その後イメージングデバイスをセットアップする手順について説明します。最後に、筋肉の切除方法と、免疫化学染色およびイメージングに適した固定処理について解説します。こんにちは、私はバージニア大学（シャーロッツビル）生物医学工学科の准教授、Shane Pierce Kotlerです。こんにちは、カイル・マーティンです。シェーン研究室の大学院生で、今回は脊髄台形筋結紮モデルの施行を行います。私たちの研究室では、心疾患、末梢動脈疾患、脳卒中などの虚血性疾患における微小血管の成長とリモデリングについて研究しています。私たちは、動脈血流の局所的な遮断が下流の微小血管ネットワークにどのような構造的適応をもたらすかを研究するために、このミラーリング脊柱僧帽筋結紮モデルを開発しました。このモデルは、確立されており広く利用されている後肢虚血モデルを補完するものと考えています。なぜなら、組織切片作成による解析を必要としない非常に薄い筋肉において、動脈形成、神経新生、および血管新生のネットワーク全体を俯瞰できるためです。この筋肉は非常に薄く、また結紮によって血流の減少を再現性高く引き起こせるため、動脈結紮の影響を微小血管床全体にわたって単一細胞レベルの解像度で可視化することが可能です。Kyleによる脊髄僧帽筋結紮モデルの段階的な手順の説明の後、カリフォルニア州立ポリテクニック大学の共同研究者が、このモデルを用いて機能的血管拡張をどのように研究しているかを紹介します。その後、バージニア大学に戻り、イメージングと染色の前に行う必要がある脊髄僧帽筋の採取について解説します。こんにちは、トレバー・カーディナルです。私はカリフォルニア州サンルイスオビスポにあるカリフォルニア州立ポリテクニック大学（Cal Poly）の生物医学工学科の助教授、Josh Cutzです。そして私は、同大学の生物医学工学の修士課程に在籍しています。私たちの研究室の主な関心は、末梢血管疾患などで見られる慢性的な虚血が、抵抗血管の機能的能力に及ぼす影響を解明することにあります。脊髄僧帽筋栄養動脈結紮術の完了後、Joshが当研究室で採用している機能的血管拡張の手順を実演します。当研究室では、動脈閉塞が血管反応性と血流制御に及ぼす影響を調べるために、この機能的血管拡張の手順を用いています。事前の準備には、10番の結紮用縫合糸、閉鎖用縫合糸、持針器、アイリス剪刀、標準的なピンセット、スプリング剪刀、および曲げられたマイクロプローブを含めてください。手術器具を準備した後、マウスを麻酔します。ここでは表示されている処方と投与量を使用します。足指のつまみ反射試験で麻酔状態を確認し、次に電気シェーバーを用いて、動物の背中から広範囲の被毛を除去し、保護用のIGELを適用します。脊髄僧帽筋結紮には肩甲骨付近の狭い範囲の除毛で十分ですが、数日後に行う予定の脊髄僧帽筋組織の採取には、より広い除毛範囲が必要となります。余分な被毛を洗い流し、製造元の指示に従って除毛クリームを塗布します。濡れたスポンジで背中を洗います。その後、アルコール綿とベタディン綿を交互に3回繰り返し、最後はベタディン綿で仕上げます。十分な照明条件下では、経皮的に背側脂肪体を確認することで、最適な切開部位を特定できます。栄養動脈は最終的に脊柱台形筋を急峻に横切るため、この部位では脂肪体の境界が皮膚を押し上げています。虹彩剪刀を動物の背側に垂直に、真上から直接挿入し、3〜5 mmの直線的な切開を加えます。照明不足や皮膚の色素沈着により、経皮的な確認が困難な場合は以下の通りとします。肩甲骨の骨突出部から側方に5mmの位置に切開を加え、皮膚層を通して切開を広げ、必要に応じて外側に拡張して脊柱僧帽筋を露出させます。結紮部位に到達するために、上層の筋膜を剥離します。本例のように表面血管が損傷し出血した場合は、止血まで待機し、必要に応じて圧迫止血を行い、乾燥を防ぐために生理食塩水で湿らせます。示されている動脈は、脊柱僧帽筋の背面沿いに走行し、その後筋肉を横切って腹側の脂肪パッドへと入ります。脊柱僧帽筋の外縁を見つけ、それを反転させるようにして持ち上げます。これにより、腹側と動脈の横断部位が露出し、血管を覆っている腹側脂肪パッドを剥離することができます。挫滅損傷を避けるため、鉗子の圧力に注意してください。ここで外科医は、結紮すべきtrapezius artery（僧帽筋動脈）を指し示しています。静脈対が存在することに留意してください。短時間作用性のadenosineや、長時間作用性のpapinなどの血管拡張剤が投与される場合があります。この症例では、矢印で示されているように、動脈が他の2本の血管の間に位置しています。1本は動脈と同程度の大きさで、筋肉を翻転させなければより外側に位置しているのが見えます。もう1本はより大きく、より内側に位置しています。2か所の結紮部位はaiで示されています。1番目の結紮を2番目よりも下流側に配置します。これにより、2番目の結紮を行う際にも血管に血液が満たされており、視認可能な状態が維持されます。Aは切断する領域を示しています。動脈とそれに対となる静脈が、Cで囲まれた腹側脂肪体に進入している部位Bに注目してください。これにより、2つ目のより小さな血管が静脈であることが分かります。また、Dで囲まれた脊髄動脈台形筋自体にも注目してください。動脈と静脈を区別するためのいくつかのポイントは、付属のテキストプロトコルに記載されています。簡潔に述べると、我々が推奨する方法は、マイクロプローブで圧迫して血流を遮断することです。血管が動脈である場合、反射筋の適用方向である下流側で血流が遮断されます。本手法では、より大きな血管を排除します。必要に応じて、80度屈曲マイクロプローブを使用して、動脈を他の血管から分離してください。これは、血管下の結合組織を突き刺し、短い側方への動きを繰り返して隙間を広げることで行います。プローブが容易に通過できるようになるまでこの操作を続けることで、縫合針を動脈の下に通りやすくさせることができます。本例では、小さな静脈を傷つけたため、軽微な出血が見られました。この血管は虚血領域から十分に離れているため、影響は最小限であると考えられます。処置として、シングルサージョンノットを締め、次の縫合の準備をします。再び、あらかじめ作成した隙間を通して、前の結紮点から数ミリメートル上流に別のサージョンノットを締結します。筋肉が反転しているため、血流の方向が予想とは逆になる可能性があることに注意してください。両方の結紮を完了した後、赤血球柱の遮断が認められるか確認します。血流が停止していない場合は、さらなる結紮が必要です。あるいは、結紮部位の間で血管を横断切開し、出血の有無を確認します。この場合、結紮が成功しており、動脈出血が見られないことを意味します。別の方法として、単一の結紮を行い、下流方向へ横断切開する方法があります。この方法が推奨される条件については、付属の文献を参照してください。筋肉を元の向きに戻し、脱出した脂肪組織と筋膜を reposition して、非吸収性縫合糸で閉鎖します。最後に、マウスを加熱リカバリーケージに入れ、観察を行い、鎮痛剤を投与して、脊髄僧帽筋の生体内顕微鏡観察に備えます。マウスはまず導入チャンバー内でイソフルランを用いて麻酔をかけ、その後、ノーズコーンを通じて持続的にイソフルランを流します。直腸温度プローブを挿入し、サーモコントローラーを35 °Cに設定します。あらかじめアイリス剪刀、標準鑷子、スプリング剪刀、およびPBSで湿らせた綿棒を準備しておきます。アイリス剪刀と標準鑷子を用いて、脊柱台形筋の尾側端に皮膚切開を加えます。切開線を脂肪パッドの頭側まで延長して馬蹄形の切開線を作成し、乾燥を防ぐために皮膚弁をプラスチックラップで覆います。微細鑷子を用いて皮下結合組織を鈍的に剥離し、視認性を最大限に高めます。電流場のサイズを最小限に抑えるため、刺激電極を可能な限り近づけて配置します。電極は、露出させた筋肉の尾側端で、脊髄のすぐ外側に設置してください。粘土を用いて固定します。PowerLabデータ収集システム、刺激装置、アイソレータ、およびLabChartソフトウェアを使用し、持続時間200 microsecond、振幅2 milliamp、周波数1 hertzの矩形波に設定してテスト刺激を行い、電極の配置を確認してください。露出した筋肉を再びラップで覆います。乾燥を防ぐため、血管径1つあたり30分間の平衡化時間を置いてから、画像または動画を撮影してください。血管構造を観察するため、生体顕微鏡を脊柱台形筋の上に配置します。浸漬用レンズを使用する場合、可視領域で最大の血管である主動脈の上の位置から、対物レンズとラップの間にPBSを1滴滴下します。XY平面上でステージを操作し、目的の血管を特定します。前述の持続時間および振幅の矩形波で筋肉を刺激しますが、刺激直後に8 Hzで90秒間的に送電します。血管を撮影し、安静時の直径に戻るまで1分ごとに撮影を継続します。データ解析は、ビデオキャリパーを用いてリアルタイムで行うか、画像解析ソフトウェアを用いてオフラインで行うことができます。初期切開から撮影までの手順を、対側の筋肉を用いて繰り返します。終了後、標準的なACUCプロトコルに従ってマウスを安楽死させ、僧帽筋組織を採取します。アイリス剪刀、標準的なピンセット、およびバネ剪刀が必要です。前述の手順に従ってマウスを麻酔します。まず、マウスの肩甲骨から数mm頭側に切開を加えます。切開部を外側に広げ、その後両側を剥離します。目的は、切開後にT3からL4まで伸びる脊柱僧帽筋を露出させることです。皮膚は、緩やかに引っ張るか、結締組織を慎重に切除することで背中から分離させます。その際、乾燥を防ぎ組織の取り扱いを容易にするため、生理食塩水で十分に湿らせながら皮膚を固定してください。鈍的剥離を用いて背側の脂肪組織を除去し、脊柱僧帽筋を露出させます。同様に、腹側脂肪組織を除去します。筋肉を翻転させた後、動物の右側の脊柱起立筋（僧帽筋）をここで確認します。次に、上層の筋膜を可能な限り除去します。この手順の部分は手間がかかりますが、顕微鏡観察中のアーティファクトを防ぐために同様に重要です。結合組織を除去した後、まず背側にほぼ平行に外縁を切断し、頭側から尾側方向へ進めながら、図に示すように組織を切り出します。次に、最も頭側の端を横方向に切断し、最後に脊髄に最も近い内縁に沿って切断して、対側筋肉を回収します。同様の手順で行います。まず背側の脂肪組織を除去し、次に腹側の脂肪組織を、最後に切開しながら表面の筋膜を除去します。器具を利き手ではない方の手に持ち替えると、より容易に行える場合があります。動物を安楽死させた後、ここで概説する手順に従って、摘出した組織の固定および洗浄を行うことができます。これは改良されたA CUCプロトコルに基づいています。代替の灌流固定手順の詳細については、付属の文献を参照してください。ここでは、反転させたspini trapezius muscle（棘僧帽筋）のラベル付き図を示します。栄養動脈を露出させた後、各領域を以前と同様に文字で示します。個体によって解剖学的構造が異なることに留意してください。このマウスは、他の2本の血管が近接しているため、この手順においてかなり困難な個体であると考えられます。ここでは、より一般的な個体を示します。指示された動脈と、その直上の傍静脈との間に比較的大きな間隔があること、および3本目の血管が存在しないことに注目してください。ここでは、平滑筋α-アクチンで染色した、結紮した右側脊柱僧帽筋の共焦点顕微鏡モンタージュを示します。虚血条件下では、結紮部位の下流の指定された領域でリモデリングが起こっています。これらの変化は画像解析ソフトウェアで定量化でき、ここでは動脈の経路長と中心距離の比として蛇行度を測定しています。ここに示す一部のサンプルデータは、対側コントロールと比較して、血管蛇行の増加に統計的に有意な結果が得られたことを示しています。また、オフライン暗視野顕微鏡上のVAで、MicroVision医療用ソフトウェアを用いて血管反応性の機能測定を行った結果を実証しています。刺激前後のビデオ血管径を測定し、それらをパーセント変化として比較しました。ここに示すサンプルデータは、刺激後に終末動脈の血管径が増加し、統計的に有意な結果となったことを示しています。こんにちは、私はAlexander Ellです。Pierce Scholer研究室の学部生として、このビデオの編集を担当しました。以上で、鏡像回転させた僧帽筋における骨格筋虚血モデルの作製方法について解説しました。次に、血管反応性と血流制御の測定に適した機能的な血管拡張の手順を実演しました。最後に、免疫化学染色およびイメージングに適した固定の準備として、筋肉を摘出する方法を示しました。サンルイスオビスポとここシャーロッツビルの共同研究者を代表して、ご視聴に感謝申し上げます。皆様の研究の成功をお祈りしております。

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医学

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ここで、重要な後肢虚血実験モデルを提示し、その後に血管新生療法の有効性を評価する機能的、血管学的および分子試験の電池が続く。...

ヒンドリム虚血のマウスモデルにおける治療血管新生の評価

本明細書では、マウスにおける左前皮下冠動脈の永久的なライゲーションを達成する方法を示す外科的処置について説明する。このモデルは、心筋梗塞の病態生理学とそれに付着した生物学的プロセスを調べるために高い関連性がある。...

左前皮下冠動脈の永久的なライゲーションを用いたマウス心筋梗塞モデル

この記事は、小さな切開を有するマウスにおける急性虚血を確立するための効率的な外科的アプローチを示す。このアプローチは、ほとんどの研究グループが、実験室でのアップグレードなしで適用できます。...

ApoEにおける後肢虚血の改変外科モデル-/- ミニチュア切開を用いたマウス

白血球および血小板の動員は、動脈形成中の側副動脈の効果的な成長に必要な必須成分を構成する。多光子顕微鏡は、動脈形成中の白血球の動員と血管外漏出を研究するために、 in vivoで...

マウス後肢モデルにおける動脈形成中の白血球動員モニタリングのための多光子生体内イメージング

ここでは、大腿動脈吻合のマウスモデルを紹介し、血管吻合狭窄を研究し、シミュレートするための貴重な動物モデルを研究者に提供します。この開発は、この疾患の根底にある病態生理学の理解を深め、血管疾患のより正確で効果的な研究を促進するために重要です。...

大腿動脈吻合管狭窄症に対するマウスモデルの開発

学ぶ動脈結紮によるネズミSpinotrapeziusモデルの構築法。血管内視鏡と共焦点顕微鏡を用いて微小血管リモデリングと機能性血管拡張を評価し、虚血性疾患における血管応答性の理解を深める。

微小血管機能およびリモデリングに動脈結紮の影響を評価するためにネズミSpinotrapeziusモデル

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