の生細胞サイクル分析

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエのGFPまたはRFPで遺伝子操作され、GFPまたはRFPで標識された細胞集団を使用して、組織の相対的な細胞周期の位相と細胞サイズを測定することです。まず、遺伝子交配を設定して、特定の組織または細胞集団において、所望の蛍光タンパク質および所望の遺伝子操作で標識された細胞を含む子孫を生成します。研究中の適切な発生段階の子孫から目的の組織をきれいに分離し、次に組織を単一の細胞懸濁液に解離し、生存可能なDNA色素で染色してDNA含有量を測定します。

染色された解離サンプルをフローサイトメトリーで分析します。最終的に、in vivoの結果は、研究中の遺伝子操作によって引き起こされた細胞サイズと細胞周期期の変化を測定します。紫外線色素を用いた生ショウジョウバエ組織上の既存のフローサイトメトリー法に対するこの手法の主な利点は、バイオレット色素サイクルが、バイオレット4 0 5レーザーを含む安価なベンチトップサイトメーターと互換性があり、低予算で購入でき、単一のラボスケールで維持できることです。

この方法は、単に組織全体のサイズと増殖速度を測定するだけでなく、より詳細な細胞周期の段階と細胞サイズに関する情報を提供することにより、細胞周期分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるKagelとDan Sun、そしてOlga Gukoです。私たちの技術者は、幼虫の解剖のために産卵後約110〜120時間で、3番目の幼虫Instarで成熟した幼虫を収集します。

正確な瞳孔のステージングは、この収穫のための変態中の研究に不可欠です 白い前蛹 必要に応じて、私はメサ 37°Cの水浴で蛹または幼虫のバイアルのペトリ皿を密封して熱を活性化します。リネージュトレースクローン用のチャックフリップベース。ペトリ皿の封印を解いた後、インキュベーターに入れて、瞳孔解剖のための所望の発達段階まで老化させます。

損傷を防ぐために気泡がある瞳孔ケースの前端で蛹をそっとつかみ、浮いている蛹を内側に配置して適切につかみます。次に、マイクロハサミで蛹の後端を動物の背側部分に向かってわずかな角度できれいに切り取り、胸部と背側中央部にヒスト脂肪を押し込むことなく内圧を解放し、背側中央に沿って慎重に頭を切り取り、翼と前眼の脳複合体の損傷を避けて脂肪を除去します。次に、鉗子で瞳孔表皮の後縁をつかみ、瞳孔ケースから引き抜くことにより、瞳孔ケースから瞳孔を取り出します。

解剖した蛹を清潔な解剖皿に移します。鉗子で眼の脳複合体の前方のキューティクルに小さな穴をあけます。ゴム球付きのガラスパスティピペットを使用。

部分的に解剖した蛹を通してPBS解剖液を優しく洗い、残っている彼の化した脂肪と腸組織を取り除きます。瞳孔の翼を得るには、2番目の鉗子を使用して、1つの鉗子で蛹の頭を押さえます。翼のキューティクルの最も後部の先端をつかみ、カーカスの側面から引っ張って外します。

次に、ヒンジで翼を切断または引き抜いて体から取り外し、死骸やその他の材料から離れた山に入れて、瞳孔の目または脳を取得します。目の脳複合体が外れて蛹から解放されるまで、蛹を洗います。鉗子を使用して、瞳孔の目を脳からそっと引き離し、目的の組織を保存します 潤滑された過去のピペットを使用して、解剖した組織を慎重に移します。

チューブを摂氏23度、500 RPMで70分間振とうしながらインキュベートします。次に、中速で5秒間穏やかにボルテックスし、サンプルをさらに15〜20分間シェーカーに戻します。Vortexは、脳と瞳孔の目のために中速で5秒間もう一度サンプリングします。

36時間以上経過している。PFは、500 RPMで摂氏23度のDNA染色溶液中で組織を45〜60分間解離します。次に、組織の大きな塊を、約50マイクロリットルのDNA染色液とともに解剖皿に移すことにより、1つずつ手動で解離します。

手動で引いたピペットを約100〜150マイクロメートルの開口部で素早く上下させることができます。解離した標本を5ミリリットルのチューブにプールします。500 RPMで振とうしながら、摂氏23度でさらに30分間インキュベートします。

サンプルが完全に解離していることを目視で確認します。無細胞の透明な瞳孔の翼のキューティクルが関連しないことに注意してください。サンプルをサイトメーターにロードして、ファックス分析を開始します。

次に、前方散乱と側方散乱を検出するチャンネルを選択し、細胞サイズと膜の複雑さを示します。DNAのDサイクルバイオレット染色を検出するには、バイオレットレーザー励起からVL1つの高さ、幅、面積を測定する必要があります。また、青色レーザーチャネルの1つの領域を選択して、GFP蛍光を測定します。

RFP解析には、青色レーザーチャネル3を使用します。attune のこのチャネルは、RFP 検出用に最適化されています。ゲート1を使用してストッププロットを生成する分析からデブリと塊を販売し、SSC対FSCのプロットでデブリと凝集物を除外するためにゲートを設定します。VLの1つの領域とVLの1つの領域のプロットでSSCとFSCのプロットでデブリと凝集物を除外し、GA 2を使用して、未染色の細胞サブG1のアポトーシス細胞と細胞塊を除外します一重項の同定に基づいて。

GA 3 は、ゲート 1 と 2 内の細胞を含み、VE L 1 の高さに基づく蛍光と DNA 含量のプロットで GFP 陰性です。次に、歩行 4 は、蛍光対 DNA 含有量のプロットで GFP 陽性であるゲート 1 と 2 内の細胞を包含します。また、GFPと前方散乱で測定したセルサイズのドットプロットからゲート5と6を生成することもできます。

細胞周期の位相を調べるには、ゲート 3 とゲート 4 で定義された集団の x 軸に DNA 含有量、Y ais に細胞数をプロットする 2 つのヒストグラムを使用します。セルサイズについては、ヒストグラムはゲート5と6に母集団を設定し、X軸にFSCをプロットし、実行中のサンプルは10, 000で停止するようにY軸にカウントを設定します。GFPの陽性イベントも300マイクロリットルの獲得量を設定しました。

適切なしきい値と電圧の設定は、提供されているテンプレートに含まれています。サンプルを標準または高感度の100マイクロリットル/分で分析し、記録します。Attuneソフトウェアによって生成された記録データファイルはFCS形式であり、ほとんどの細胞周期モデリングソフトウェアと互換性があります。

4つのドットプロットと2つのヒストグラムを含むこの代表的なワークスペースは、Grailed gal 4導入遺伝子によって駆動される、後翼でGFPとCyclin Dを発現する幼虫の翼サンプルを示しています。歩行 1 のセル サイズの最初のドット プロットは、破片と凝集体を除外しています。2番目のドットプロットは、GSPとDNAのプロットで未染色の細胞、サブG、1D、NA含量、および凝集を除外するために、歩行2でシングレットを区別します。

GFP陰性細胞と陽性細胞は区別でき、x軸に沿った位置に基づいて2つのNと4つのNDNA含有量が明らかになります。このグラフは、GFPと前方散乱光で測定したセルサイズのプロットを使用して、ゲート5とゲート6を生成します。結果として得られた解析により、GFPまたはRFP陰性集団、ならびにGFPまたはRFP陽性細胞のDNA含有量とカウントのヒストグラムが得られます。

提供されているRFPテンプレートを使用します。同じ組織タイプと発現パターンで同様の結果が得られます。RFP の場合、提供されているテンプレートと電圧は、幼虫の目、脳、翅、瞳孔の目、脳、翅の分析に適しています。

attuned ソフトウェアで。細胞周期ヒストグラムまたは細胞サイズヒストグラムの自動スケール機能を使用すると、各集団のグローバル最大値を決定できます。これらの細胞周期プロファイルは、後部でGFPを発現する幼虫の眼のGFP陽性細胞と陰性細胞を表しています。

GMR GAL 4 U-A-S-G-F-P 導入遺伝子を用いて、GFP 発現後部細胞の細胞周期の位相差を明らかにします。GFP陽性細胞と陰性細胞の間の細胞サイズの相対的な変化もプロットできます。この細胞周期プロファイルは、46時間A PFの瞳孔脳から導き出されました。GFP陽性細胞は、G one S調節因子、サイクリンDおよびE two Fを発現する系統追跡クローンであり、静止を妨害してS期の侵入につながります。

これは、この段階で通常停止する非発現GFP陰性細胞とは対照的です。G 1では、attuneソフトウェアがヒストグラム上にユーザー定義の領域を生成し、G one sとG twoのフェーズを描きます。各実行の統計テーブルは、ユーザー定義の領域とパーセンテージ内のセルの絶対数を決定します。

あるいは、mod fitなどのモデリングソフトウェアを使用して、各フェーズおよびアポトーシス細胞の割合を推定することもできます。このビデオを見れば、細胞周期解析のためにショウジョウバエからいくつかの組織を単離し、標識する方法を十分に理解できるはずです。