Name: 転写産物および代謝物からの精製ショウジョウバエヘッド (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: 学ぶショウジョウバエ頭部からの転写産物と代謝物の抽出法。凍結・凍結乾燥・有機溶媒処理により高品質なRNAと代謝物を取得し、神経変性疾患の細胞メカニズム解明やオミクス研究に応用できます。

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我々は技術支援やフライ株式のインディアナ大学ブルーミントンショウジョウバエストックセンターのためのジャニスサンティアゴ、ガブリエル·フィゲロア、ホセ·エレーラに感謝しています。 DHとCWは、NSF-IOS-1051890からの資金によってサポートされていました。 PF-FとLMMは、フロリダ大学から商談シード基金によってサポートされていました。

1。複製を生成し、ハエをフリーズ（注意、液体窒素） 目的：遺伝子型/時間ポイントして、急速冷凍されるごとに、少なくとも200人の女性を集めて下さい。 <ol><li>遺伝子型：Gal80 TS; daughterless調節領域および温度感受性Gal80の制御下にあるGAL4のユビキタスな発現のためにDA-GAL4、株。制御ラインとして、我々は以前に有害な影響を誘発しないことが示されているUAS-LacZを使用していました。 UAS-Atxn3-27QとUAS-Atxn3-78Q、非病原性と病原性の実験的な構造物であった。 （Y、HS-HID建設は処女雌のより効率的な収集のために前に使用されますが、我々は、理由Gal80 TSとY、HS-HIDを導入するために必要な余分の時間がそれに対して決定されている; DA-Gal4の染色体上のIIとⅢ。） </li><li>瓶に女性10名と男性5名を組み合わせることにより、全株式を展開混雑防ぐためだ。全ての実験は、準備が簡単で、ダニと速いショウジョウバエの成長と低蔓延を助長ジャズミックスフライメディアで行った。 </li><li>各時点のDA-GAL4男性、100 UAS-Atxn3-78Q処女（唯一の1 UASのラインが例として使用されます）; 50 Gal80 tsを収集します。 </li><li>遺伝子型/時間ポイントあたり10十字架を作る。二酸化炭素（CO 2）寝台/パッドの上に雄と雌を麻酔。場所は10処女UAS-Atxn3-78Qハエ（5日よりも古くない）と5人の男性Gal80 TS; DA-Gal4の各大型ボトルには、酵母ペースト（再水和乾燥酵母）でスパイク。遺伝子型は、時点、ボトル識別子（文字AJ）とボトルのラベルを付けて、25℃でそれらを配置する</li><li> 2日後、ボトルから大人を消去乾燥酵母のふりかけと最適な幼虫の成長を促進するための水の噴出を追加し、18℃（Gal80、アクティブにボトルを置く抑圧されたGal4）。これが処女雌対受精卵に由来する子孫の実験的変動性を導入するかもしれないとして、十字架をコピーしないでください。また、各ボトルから子孫が独立した生物を表す（各ボトルがユニーク子孫を生成）を複製しますが、転送された十字架（のコピー）が技術的になります（同じ遺伝子構成を持つ追加の子孫）を複製します。 </li><li>子孫は18℃でeclosesと、CO 2寝台/パッドの上に麻酔は、目的遺伝子の処女を収集し、（バイアル当たり二から一二ハエ）と小さなバイアルの中に置いてください。ボトルの識別子を使用してラベルのバイアル。プールは異なるボトルの便を運行する航空会社はありません。 24時間18℃に戻ってバイアルを置きます。子孫を最大化するために、連続した朝と夕方に集め続ける。 </li><li>各バイアルは、18℃で24時間を完了すると、29℃（Gal80非アクティブ、GAL4アクティブ）にそれらを移す。これは、0日目に、実験の出発点は、tである彼はそれらの発現を開始する導入遺伝子。 </li><li>彼らは日10と20に到達するまで2日ごとバイアルをきれいにするハエを転送します。 </li><li>ハエが希望する年齢（1、10、20日）に到達すると、小さな漏斗を用いて予め標識クライオバイアルに食品バイアルからそれらをカウントし、転送します。ハエを麻酔しないでください。ベンチでバイ​​アルを反転します。 </li><li>ハエが転送（ストレス）から回復できるように、30分待ってから、中に液体窒素や店舗内に浸漬することによりバイアルをフラッシュフリーズ予め標識、予冷フリーザーボックスのことを忘れないでください 。同じ順序でハエをフリーズそれらはサンプル間クライオバイアル制服に費やされる時間を作って、クライオバイアルに移した。 </li></ol> 2。フライヘッズの収集と凍結（コールドルーム、プレチルすべての機器、注意、液体窒素やドライアイスで実施） 目的：高速分離、回収、組織の凍結乾燥。 <ol><li> ASSEMふるい（遺体を収集するために、上部チャンバー内の最大メッシュ、ヘッド、超小型部品を収集するために底部の蓋収集する下部チャンバーで二番目に大きい）-80およびプレ寒さを℃で少なくとも30分間CをBLE。 </li><li>同じボトル由来ハエの貢献を最大化することにより、クライオバイアルから200ハエを集める。朝や夕方に収集するハエの違いを補正するために、すべてのサンプルが同一朝/夕の比率を（我々は47％の朝/ 53パーセント夕方使用）を使用していることを確認注：2つの100頭のサンプルから得られたRNAを組み合わせることができます後一回で200ハエと同等のものを生成します。 </li><li> 5分間ドライアイス上にパラフィルム（〜9×14 cm）の部分を冷やします。 </li><li>パラフィルム、一度に少数の上に完全なハエを持つ空のクライオバイアル、カウントは100ハエに達するまで絵筆、ドライアイス上で別のクライオバイアル内のストアを使用して飛ぶ。 </li><li>液体窒素でふるいを浸し、上位CHAMBに100ハエを追加えー。 1分間激しくふるいを振る。再び液体窒素に浸し、1分間振とうする。 </li><li> -80℃でふるい、マイクロチューブの下側チャンバーから頭を収集し、場所を開き℃に</li><li>マイクロチューブを開き、パラフィルムでトップをラップし、小さな穴を作る。 </li><li> 2日以上のための凍結乾燥機でサンプルを置きます。 </li></ol> 3。トータルRNA抽出とmRNA精製（RNaseZapとすべての面扱い、頻繁に変更されるの手袋） 目的：収量を最大にするために、組織をホモジナイズし、全RNAを抽出し、mRNAを精製。 <ol><li>凍結乾燥機からサンプルを取り出して、各マイクロチューブに3小、滅菌、スチール研削ボールを追加します。ジェノ/グラインダーに入れ、1分間1500ストローク/分で動作します。 </li><li> 、チューブを開き、1mlのTrizolを追加し、パラフィルムでチューブをシールします。 1分を挽く、必要に応じて鋼球を取り除くために、逆さまチューブをタップします。 1分を挽く。 </li><li> しないでくださいこの時点でチューブを遠心（チューブが脆くなります。）新しいRNaseフリーのマイクロチューブに混合物（鋼球を除く）に転送します。ペレット4で卓上遠心で細胞破片°12,000 x gで10分間インキュベートする。 </li><li>新しいマイクロチューブに上清を移してください。 1 - ブロモ-3 - クロロプロパン（BCP）の0.1ボリュームを追加し、15秒間激しく振り。 3分間室温でインキュベートする。 4℃で遠心機でスピン°12,000×gでノートで15分間、C：多くのRNA抽出プロトコルは、この段階でクロロホルムを使用し、BCPは相分離の効率を高めることによって、RNA収量を最大にするために意図されている。遠心分離工程の間に4℃でサンプルを保存しておくことはまた、相分離の効率を高め、水相にタンパク質とゲノムDNAの混入を低減します。 </li><li>新しいマイクロチューブに上部の水層を転送します。氷冷イソプロパノール0.5容量を追加することにより、RNAを沈殿させ、マイル〜6倍の反転xである。室温で10分間インキュベートする。 4℃で遠心機でスピン℃で10分間、12,000×で グラム。 </li></ol>注：RNAを回収することに加えて、タンパク質はまた、トリゾールの有機層と中間相から抽出することができるので、両方のプロテオミクス、トランスクリプトーム解析は、同じサンプルに対して実施することができます。我々は我々の分析では、この手順を実行しませんでしたが、トリゾール抽出は、可溶性タンパク質の優れた表現と、ほとんどのバッファ/洗剤抽出より膜および核蛋白質の高い表現をもたらします。リーとLo 17は 2-DゲルおよびLC-MS/MS含むプロテオミクス解析に適しトリゾール用いてタンパク質を抽出する手順を説明します。 <ol start="6"><li>上清を取り除きます。 1mlの氷冷70％エタノール（DEPC処理水を使用）、ショート渦とのミックスを追加することにより、RNAを洗浄します。 4℃で遠心機でスピン℃で12,000×gで5分間。 </li><li>上清を取り除きます。空気乾燥のためのペレットトン以上15分。 RNAペレットへのDEPC水80μlを加え、10分間55℃に置きます。 4℃で一晩にしておきます。 </li><li>光度計、分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。 260 nm/280 nmの吸光度の比は、2.1が最適であることと、1.8と2.1の間でなければなりません。 </li><li> 30μgのバルクRNAを取り、100μlに合計ボリュームを上げ4 UのDNase I、60 U RNasin、10μlの10×反応バッファー、及びDEPC処理水を追加します。 20分間37℃でインキュベートする。 </li><li> RNeasy Mini Kitを用いてRNAを精製する。 30秒間すべての遠心分離を行い、すべての &quot;任意&quot;の手順を含める場合を除き、製造者の指示に従ってください。 </li><li>光度計を用いてRNA濃度を測定し、バイオアナライザで &quot;トータルRNAピコ&quot;アッセイを用いて、RNAの品質を評価する。 </li><li> mRNAの精製のために、RNaseフリーのマイクロチューブに30μlのDynabeadsを転送します。 </li><li> 1〜2分間磁石にチューブを置き、上清を除去します。にビーズを再懸濁しBinding Bufferを15μlの。繰り返します。 </li><li>トータルRNA5μgのを皮切りに、DEPC処理水を用いて15μlに音量を調整します。 65℃の熱で2分間、氷の上での場所のためのC。 </li><li> 15μlのプレ洗浄したビーズにトータルRNAを15μlを追加します。ビーズにRNAをアニールするように30分間、5分毎にピペッティングして混和します。 1〜2分間磁石の上に置き、上清をすべて削除します。 </li><li>注意深くピペッティングによる洗浄バッファーBミックス35μlを添加する。磁石の上に置き、慎重に上清を除去する。二回洗浄を繰り返します。 </li><li> 2分間80℃に15μlの冷10mMトリス-HCl（pH7.5）及び加熱を加えることによりmRNAを溶出します。直ちに-80℃で、磁石上にチューブを置くRNaseフリーのチューブに上清を移し、凍結）3.8のように定量化する。収率は、トータルRNAの〜1-5％であるべきである。 </li></ol>メタボローム解析のために、プロトコル1と2）を実行し、下）4に進んでください： 4。メタノール - クロロホルムエクストラ代謝物のction 目的：個別極性及び非極性代謝物。 <ol><li>抽出中に脂質の自動酸化を防止するために0.1 mg / mlの濃度でクロロホルムにヒドロキシトルエン（BHT）をブチル化防止剤を追加します。後続のすべてのステップについては、このBHT-クロロホルムを使用しています。 </li><li>チルド、予め秤量した円錐形のスクリューキャップポリプロピレンチューブへの転送200頭、-80℃で凍結℃、凍結乾燥。乾燥重量を決定します。 </li><li>チューブで5月7日のジルコニアビーズを入れて、800 Hzで20秒ずつの2つのサイクルのビードビーターでホモジナイズする。 </li><li>重い試料の乾燥重量に基づいて、以下の比率で水、メタノール、クロロホルムを追加：11.74 Xメタノール; 10.59 X水; xはグラムで最も重い試料の重量であり、製品である11.74 Xクロロホルム、 mlのボリューム。凍結乾燥されたヘッドを含むビーズビーターチューブにすべて計算されたメタノールと水の総量の45％を追加します。 </li><li> Homogeni20秒ずつ2回以上のサイクルのためにビードビーターでzeを。 </li><li>クロロホルム（100％）と氷の上で円錐形のガラスバイアル中の水の残りの部分（55％）のボリュームを兼ね備​​えています。その後、ガラスバイアルに（ビーズ付き）組織混合物を転送します。 10分間振とうする。氷上で10分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で遠心機でスピン°Cを2,000×gで5分間。パスツールピペット（プラスチックを避ける）と第二マイクロ遠心チューブ内の場所と極性（上部）相を除去。 </li><li> -80小さなガラスバイアルと凍結で非極性（下）位相℃に保存窒素ガス気流下で乾燥し、窒素タンクから実行されているチューブは抽出物中の可塑剤を避けるために、高純度のタイゴンであることを確認してください。 </li><li> 620μlの重水素化クロロホルムを持つ非極性相を再水和する。ラベル付きのNMRチューブに600μlを移す。防爆-80℃の冷凍庫で保管してください。 </li><li> Centrivapで極性相を置き、チューブを30℃で完全に乾くまで実行℃（約7時間）。 </li><li> REH[ - （トリメチルシリル）プロピオン酸-2,2,3,3-D4酸3]内部標準として1mMのTMSPと重水で620μlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.3）で極性相をydrate。 30秒間ボルテックスする。 4℃で遠心機でスピン℃をNMRスペクトルを妨げる沈殿顔料および他の大きな分子〜10,000 rpmで5分間。ラベル付きのNMRチューブに上清の600μlを移す。 </li></ol>

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</ol>

著者らは競合する経済的利益を宣言しない。

我々の以前のトランスクリプト11、12での経験、代謝15、および神経変性疾患6,8を踏まえ、我々はここで病原性遺伝子の大人の特異的発現とハエの頭の数千人を集めるための新しいプロトコルを提示し、のmRNAおよび代謝産物を精製したRNA-それぞれ、配列やNMR分光法、。これらの実験の性質は、ユビキタスGal4のラインと遺伝子発現の時間的な規制の使用の選択を含むフライコレクションの前にいくつかの技術革新、の組み込みを必要とした。 Gal4活性に関しては、導入遺伝子のユビキタスな発現には2つの理由で重要であった。まず、ATXN3、ハンチンチン 、 アミロイド前駆体タンパク質 、およびスーパーオキシドジスムターゼ1を含む神経変性疾患に関与する遺伝子の多くは、他の人の間で、広く神経細胞およびグリア細胞にだけでなく、神経系外の他の細胞型で発現される。我々はしたかった正しくユビキタスな発現の結果を分析するだけではなく神経の表現に焦点を当て、これらの病原性遺伝子の生物学のこの側面をモデル化します。第二に、それは大量にハエの脳を収集することは不可能であるが、我々はハエ頭（条件当たり三連で200以上）11、12に行うことができます。頭全体の均質化は、神経および非神経組織をミックスしているので、ユビキタス導入遺伝子の発現は、同じ導入遺伝子を発現する細胞の集団から均一RNAおよび代謝産物を得るために重要になります。それは最近のレポートは、DA-GAL4が 25全くユビキタスではないかもしれないことを示唆したが、DA-GAL4が 、その高い発現レベルを、そのかなり均等に分布しないために選ばれたことに注意することが重要です。我々は以前にアーム、TUB-、およびACT-GA4など、他のユビキタスGal4の行を、考えていたが、彼 ​​らはすべてのそれらをより少なくなり、成人の中枢神経系や筋肉に複雑な発現パターンを示したこの研究のためにdequate。実際には、大人の脳で免疫蛍光は、DA-GAL4はほんの数千軸索から成る脳中枢にし、いくつかの大型ニューロン（ 図2）において高レベルで蓄積された広範なしかし弱い発現を誘導することが示された。構築物の発現レベルは低かったが、これらの条件が劇的にポリQ依存的に生存率を低下させた。神経毒性タンパク質により誘導され、ゆっくりと進行性の細胞の変化を観察するために重要であった低発現レベルを保ちながら、この式のダイナミクスは、我々のニーズを満たしていた。 神経毒性タンパク質の発現を誘導するユビキタスの予測結果は、それが大人になってから羽化する前に致死性の原因となったということでした。幸いなことに、この合併症はGal80 TSを利用したバイパスされた。上述したように、遺伝子発現は時間FRAとよくフィットする、約48時間の温度シフト後に最大レベルに達した実験の私。 Gal80 TSを使用することの別の利点は、神経毒性タンパク質が恒常的に汎神経的表現されている実験とは対照的に、全く発現が神経系の発達の間に存在しなかった、ということでした。したがって、Gal80 TSの使用は神経系が敏感な発達段階で、これらの神経タンパク質の毒性活動に露出していなかった&quot;クリーン&quot;な背景を作成しました。我々の見解では、成人における遺伝子発現の活性化は、成人発症病理のこのクラスの良いモデルとなりました。しかし、Gal80 tsはまた温度変化に関連付けられているいくつかの複雑さを導入しました。一つは、低温（18-20℃）で成長しているハエが有意に長かった実験を行う、ライフサイクルを遅らせたということでした。また、高温（29から31℃）でハエを成長させ、25℃で熟成飛ぶ℃に比べて短く寿命によって示されるように、彼らの新陳代謝を加速することはよく知られているシ転写と代謝の研究は、高温で熟成ハエで実行されますNCE、我々は、細胞ストレス経路とエネルギー代謝に重要な変更を確認することが予想されます。それは実験、非病原性を持つ1 Atnx3-27QおよびLacZを発現している無関係なコントロールに2つのコントロールを導入することが非常に重要だったのはこのためです。我々が直接毒性Atxn3の発現にリンクされてそれらの変更を識別できるようにこれらのコントロールは、遺伝子発現や高温に伴う代謝の変化をベースラインを提供します。成人発症、進行性の疾患を研究するため - といくつかの欠点（温度の問題と次の段落） - 全体的に、我々は多くの利点を提供ハエのコレクションにいくつかの変更を導入しています。 Gal80 TSと一時的調節が参考に加えていたが、それはまた、予期せぬ合併症を導入しました。 Gal80 tsの両方を運ぶハエを発生させながら安定した在庫ND DA-GAL4コンストラクトは、我々は両方の構築が実行可能であったが、滅菌のために二重にホモ接合体で飛ぶことに気づいた。ホモ接合Gal80 TSとda-GAL4系統は、それ自体で実行可能な、肥沃であったので、組み合わせは少子化を表示理由は明確ではありません。それは、GAL4がショウジョウバエの組織22〜わずかに毒性があることは古くから知られている。これは、酵母転写リプレッサーGal80の異種発現が内因性転写機構と、潜在的に干渉することによって、GAL4の毒性に寄与していることが、その後、可能性があります。この毒性は、DA、早期開発と性的決定に重要な役割を果たしている遺伝子の制御下にあるGAL4のユビキタス分布によって悪化する可能性がある。かかわらず、不妊の根本的な原因の、我々はGal80 tsを広げ、鎬を維持しながら、DA-Gal4の上にバランサー染色体を維持することにより、DA-Gal4のハエGal80 トン sの mozygosityは、GAL4が不妊に対してより重大な要因であることを示唆している。我々はUASの導入遺伝子のそれぞれと交差するように隔週でこれらの男性の何百ものを使用したので、このソリューションでは、鍵となった。しかし、適切な子孫の選択時に追加の作業を作成バランサを運んで交差しています。子孫の唯一の4分の1（25％）は、選択時間を追加した、（女性、非バランサ）収集瓶あたりの収量が減少し、遺伝子型/複写/時間あたり少なくとも200ハエを取得するために必要なボトルの数を増加させたポイント。ハエの収集が必要とされる大規模なセットのために時間がかかるとなったものの、全体的に、私たちは、ほんの数時間の病原性遺伝子の発現をオンにした後に細胞の変化を勉強することは普遍的に進行性の神経細胞の喪失に関与する新規かつ興味深いプロセスを識別するものと確信しています。 遺伝的なデザインは場所にあったら、私達はに特別な注意を払っ生物学的変動を導入する可能性の実験操作。これは男性を捨てると一日二回子孫の検査を意味しますが、まず、我々は唯一の、試料の均質性を確保するために処女雌を集めました。エージング中、12以上ハエが過密状態やストレスを避けるために、同じバイアルで飼育されていた。また、凍結する前に、ハエは麻酔なしクライオバイアルに移し、30分間の転送から回復させた。これらの一見些細な要因は、実験に関係ないでしょう、最終的な分析の変動性を導入し、遺伝子発現や代謝に影響を与えることができる。 凍結材料（ヘッド、RNA、及び代謝物）の品質を保証するために、我々は組織の劣化に寄与することができるそれぞれの細部に特別な注意を払った。ハエが少数でクライオバイアル（バイアルあたり最大12ハエ）に転送されるので、我々は200頭のコレクションのために多くのバイアルを取得しなければならなかった。これらの操作はDだったドライアイスや液体窒素で低温室で非常に気を使って1。ハエ、ヘッドの分離、および情報分子の精製のコレクションがあまりにも材料がこの長いプロセスの終わりに、分解されたことを発見するために時間がかかります。材料はその品質を保持していることを保証することに加えて、このプロトコルは、凍結乾燥およびビーズ鼓動を含むRNA及び代謝物の収率を最大化するいくつかの手順を説明します。これらの手順は、全体のハエからRT-PCRや定量的PCRのため、通常の抽出に必要な、しかし、彼らはそのようなハエの頭のような小さなサンプルから一貫性のある浄化のために重要なされていません。我々は、他のステップはRNAの収量に影響を及ぼすと判断した。たとえば、年上のハエは関係なく遺伝​​子型の、若いハエよりも大幅に少ないRNAを作り出した。この観察結果は、高温でエージング劇的な変化を誘導することが示唆された。また、100頭からRNAを抽出すると、実際に200頭からよりも効率的だったので、我々は2つ​​のbに浄化を進め唯一バイオアナライザによる品質の検証後にそれらを結合するためのサンプルあたり100 atches、。また、mRNA精製用カラムは、カラムごとに使用される全RNAの量を最適化することが必要、簡単に飽和しているようだった。 代謝物は小分子の多様なものが混じっているので、品質管理は、DNA、RNA、またはタンパク質と比べて難しくなります。マススペクトロメトリー（ - 残念なことに、この時点ではどのような動物モデルの代謝物のない完全なカタログ、NMR分光法、液体クロマトグラフィーの利用拡大など、いくつかの技術革新のアプリケーションに、今後数年間のおかげで変わりつつあるのかもしれない何かがありませんLC-MS）。 NMRは、MSよりも感度が低いですが、それはサンプルの破壊、バイアス（LC）を導入するノー分析手順、および担当者といくつかの実験条件24の統計的に比較することができ、高い再現性を含めていない多くの有望な利点を示しています。したがって、サンプルができNMRデータを検証するためにLC-MSで観測を確認または再解析する再試験。ここで、我々はショウジョウバエにおける代謝物のカタログをコンパイルするために使用しているハエから予備NMRデータを示した。この情報は、神経変性疾患の基礎となる細胞メカニズムを理解促進するための新しいウィンドウを開いて、病原性遺伝子の発現が正常な代謝を変化させる方法を決定するために重要となります。 新興OMIC技術は以前に達成されなかった詳細レベルでの神経変性疾患を研究するための最良の機会を提供しています。おそらく、これらの高スループット研究で克服するための最大の障害は非常に機密性の高い方法で分析することができる再現性のサンプルの忠実なコレクションです。手順は、この一貫性を達成するための方法を提供し、ここで紹介し、簡単にデータセット間で比較することができる結果につながるでしょう。関係する私たちの主な研究分野は、遺伝子急行の変化を調べていますがイオンと代謝物は、生成されたハエはまたプロテオームまたはepigenomic分析に供することができた。神経変性の間に発生するプロテオミクスおよびepigenomic変化はまた、疾患のプロセスに非常に重要であると思われる。科学界は、最終的に病気のプロセスに影響を与える分子の変化の完全なスペクトルを識別すると、病気の真のシステムレベルでの理解が可能となる。このレベルでは、疾患修飾療法はついに現実のものとして出てくる。

最後の世紀には、 ショウジョウバエは特に開発の深い生物学的質問でも、細胞生物学、遺伝学、神経生物学の1を調査するための非常に貴重な実験室のツールであることが証明されています。この成功の理由は、ミバエは操作が容易であることで、拡大を続けるツールボックス18、21、31、および高品質の注釈26を備えた比較的単純なゲノムを持っているを持っている。 3人のノーベル賞の授与（1933、1995、2011）によって示されているようにフライコミュニティ内での創意工夫と一定の技術革新と組み合わせてこれらの技術的利点は、、、幅広い科学的貢献につながっている。さらに最近では、 ショウジョウバエは人間の病気、主に発達障害、先天性免疫、癌、神経変性2を研究するための適切なモデルとして登場しました。我々は、特に神経変性疾患の細胞·分子レベルでの解明に興味を持っています。これらの複雑で多様なコnditionsが異常に折り畳まれたタンパク質のアセンブリ、おそらく水溶性オリゴマーにリンクされている、したがって、容易にハエをモデルにしています。アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症は、いくつかの運動失調、タウオパシー、プリオン病、などの希少疾患を含む主要な神経変性疾患、のすべてが最後の15年の23に飛んでモデル化されています。フライ研究所は主に病原体タンパク質の神経毒性に関与する新たな遺伝子を同定するために、ショウジョウバエの遺伝学の優れた能力を活用することによって、これらの疾患を理解することに貢献してきました。神経毒性カスケードに関連する新たな遺伝子が同定されれば、その効果は、通常、異常なタンパク質のコンフォメーションの量と種類を評価するために蛋白質の分布と細胞病理を決定する免疫組織学的変性の把握パターンに含めて従来のアプローチとは、、、、生化学的解析によって分析される。最後に、behavioral解析は、疾患の転帰の機能読み出しとして機能します。これらの十分に確立された技術は、酸化ストレスおよびミトコンドリア機能障害13、転写調節不全9、27、30、異常な軸索 ​​輸送とシナプス活性14、異常なRNAを含む、病気のプロセスへの1つまたはいくつかの候補遺伝子の寄与を調べるために利用されてきた生物学9、調節不全の細胞シグナリング29、ERのdyshomeostasis 6は 、携帯proteostasis 33、および他の多くの23を妨げた。しかし、これらの毒性タンパク質が相互接続された複数の経路を同時に干渉する可能性がどのように明確ではないが、何がこれらの変化を時系列であり、病因に各経路の相対的な寄与は何ですか。数十年にわたる研究は、単一の遺伝子に焦点を当て、人間と動物モデルの両方の仮説駆動型のアプローチが引き起こす細胞メカニズムの不完全な、不可解な絵につながっている神経変性。これらの毒性タンパク質アセンブリは、神経病理学を起こしているかによって、正確なメカニズムの現在の理解不足は疾患修飾治療薬の開発に重要な制限です。 我々は現在、これらの病原体タンパク質がグローバルセルラー摂動を誘導する方法を理解するための新しいアプローチの適用に興味を持っています。オミクス時代の到来は、近い将来の効果的な病気の治療につながる可能性が洗練されたハイスループット技術を使用して、複雑な生物学的な問題の深いプロービングが可能になります。遺伝子発現（トランスクリプトミクス）の研究は、高品質のアノテーションは、ほとんどの転写産物を予測することができるので、複数のゲノム配列の完了後に設立された。転写解析（RNA-seq）がに次世代シーケンシングの最近のアプリケーションでは、公平なアプローチは改善定量範囲、低コスト32を含むマイクロアレイに比べて、新たな利点と機会を提供してきました。私たちはより良い優性遺伝性失調症、脊髄小脳失調症3型（SCA3）またはマシャド·ジョセフ病の最も一般的な形式を理解することは、RNA-seqの利点を活用したいと思います。 SCA3はAtaxin3遺伝子（ATXN3）16のCAGトリヌクレオチド膨張によるフル浸透度を持つ単一遺伝子、優性疾患である。この変異は、集計にそれが発生しやすくなり、長いポリグルタミン（ポリQ）のトラックとAtxn3タンパク質の産生につながる。変異Atxn3すべての疾患に関連した摂動の責任SCA3における神経剤であるので、これは、これらの新しいOMICアプローチを適用するための理想的な疾患である。さらに、SCA3はハエ34でモデル化された最古の神経変性疾患の一つであった。 RNA-seqのためのフライのヘッドを大量に収集するための場所で手続きを停止させたまま、私たちは他の情報分子の世界的な研究を行うため、同じ材料を使用することができることに気づきました。他の新興discip間で行、プロテオミクス、エピ、メタボロミクスはないものの課題がない、以前に達成されない深さで細胞病理の検査を可能にします。としてのmRNAとは対照的に、タンパク質や代謝物のカタログはすべての可能なスプライシングバリアントとすべて正常および病原性代謝物のさらに謎めいた起源を予測する上での増加が困難なため、この時点でかなり不完全です。大きな努力が、現在、多くの生物にと病気の条件でタンパク質をカタログするために進められている。このため、我々は、 ショウジョウバエのような単純な生物を用いて、SCA3病因に変更された代謝物の貢献に注力したいと考えていました。これは特に、高い再現性を提供し、試料5、24を破壊しない核磁気共鳴（NMR）の最近の導入で、比較的新しい有望な分野である。我々は、代謝物プロファイリングはneurodegeneratiに関与識別バイオマーカーと疾患のメカニズムに貢献できることを提案する上。 これらOMICプロジェクトでの重要な考慮事項の1つは、彼らが実験的な変動を最小限にするための大規模な、均一なサンプル（200フライ頭）だけでなく、正確な精製技術を必要とすることである。我々はマイクロアレイのために以前に使用され、また、RNA-seqの12のために最近使用した手順に従って、ハエを集めるようになりました。しかし、我々はすぐにSCA3コンストラクトをmisexpressingに関係する多くの問題に遭遇しました。まず、分析のための標的組織は、脳であったこれらの実験4、Gal4のためのドライバを選択する必要がありました。 SCA3は脳の病気であるため、当然の選択では、汎神経ドライバーだろう。我々は全体の頭からmRNA及び代謝物を収集するつもりしかし、このオプションでは、発現している組織と非発現構築物から混合された材料を生産するでしょう。すべてのセルがコンストラクトを表現均質なサンプルを生成するために、私たちは弱いがユビキタスドライバーライン、daughterless（DA）-GAL4を使用することを決めた。 Interesチクチクする、ATXN3 20を含む神経変性疾患に関与する遺伝子の多くは、ユビキタスな発現の選択が適切な意思、広い分布を持っている。病原Atxn3-78Qのユビキタスな発現開発中に致死性の原因となった：そして、我々は、第二​​の問題が発生しました。この致死性を回避するために、我々は、GAL4 19の時間起動を制御するGal80 tsを組み込んだ。これは、私たちは、最大20日間までの実験ハエ、年齢、それらを収集、それらを凍結し、RNA（トリゾール）または代謝物（メタノール-クロロホルム）抽出（ 図1）のどちらかのために彼らの凍結乾燥した頭を処理することができました。我々はすでに、トランスクリプトームとメタボローム解析のための試料を得るために、このプロトコルを使用しているが、この技術には他の明白なアプリケーション（ 例えばプロテオミクスや神経peptidomic分析）があります。 実験概要：これらのプロトコルの全体的な目標はconsiのコレクションをサポートすることです転写産物および代謝物の抽出のためのフライヘッドのステント試料。これらの手順の具体的な目標は、Atxn3-27QとAtxn3-78Q（非病原性と病原性の実験的構築物）を発現するハエと同様に、単一のサンプルが200フライヘッドで構成されたLacZ（制御構文）を取得することです。現在の技術は、単一細胞28を含む、非常に小さな試料の分析を行うことができますが、我々は、このように私たちは、高い統計的自信を持って病気のプロセスに関連付けられている細胞の変化を識別することができ、実験生物学、および技術的な変動を除去するために200頭をプールした。このアプローチは、変性を駆動する最も重要な経路に向けて私たちを導く、集団で一貫している遺伝子発現の変更のみを検出するように設計されています。我々はこれらのハエの頭の中の年齢依存性の変化に興味があるので、それぞれの遺伝子型は1、10で得られた、年齢の20日間であった。 これらの基本的な側面グローバルな分析は、生物の生産がサポートしている、強固な統計分析を複製しています。マイクロアレイおよびRNA-seqを使って我々の以前の経験は3回で生体試料の分析はそのデータ11、12の強力な統計的有意性を提供することを示唆している。私たちは、それぞれの遺伝子型と時間ポイントの単一の生物学的複製（REP 1）を生成する方法）第1節で説明します。これらの手順は、限り、各担当者が適切に識別されるように、担当者2と3を生成するために繰り返されるか、または並行して行うことができます。 3担当者は、第四（あるいは第五）担当者は非常に一つ以上の収率が低く、熟成中のハエの損失、または物質の偶発的な損失（ハエ、ヘッド、またはRNA）に関連する問題をカバーするために推奨される設定は、目標であるが、サンプル。 我々は10十字架は（文字AJによって識別ボトル）200頭/遺伝子型/時間のポイントを得るために十分な子孫を産生することがわかった。細心の注意は、ボトル多数のため、混乱を避けるために適用する必要があります再び1つのREP（10瓶×3遺伝子型×3時間ポイント= 90ボトル）を入手する必要がありました。このため、我々は遺伝子型、時刻、およびボトルの文字を使用して各ボトルに指定した。例えば、SCA3-27Q 20Eは20日間熟成Atxn3-27Qを発現しているハエの第五ボトル（10）を表します。子孫孵化するしたら、ハエは一意の識別子で標識別々のバイアルに保持されます。 私たちは、それぞれの試料に対して得られたハエ、ボトル、Excelスプレッドシートで収集ポイント（朝と夕方）の数字を維持しています。我々は、アカウントの致死と逃亡を考慮に入れて凍結する前にバイアル当たりハエの数の見直しを行いました。それらの最終的なカウントから、200ハエを追加バイアルは易くなり、サンプルの保全に貢献する、冷凍庫を開ける前に配置することができます。 1瓶から収集されたハエが1つだけの担当者で使用することができるので、すべての担当者が複数のボトルからハエが含まれていたものの、私たちは、生物学的反復当たりの貢献を最大化。我々は予約済み他のレップのために、交換用のサンプルとして、または他の関連する実験（ウェスタンブロット、定量PCR）のために、スケジュール担当者で使用されていないボトルからハエ。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> 猫。数 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>ジャズミックスショウジョウバエ食品</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> AS-153 </td><td></td></tr><tr><td>クライオジェニックバイアル</td><td>コー​​ニング株式会社</td><td> 430658 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ</td><td> Axygen </td><td> MCT-175-CS </td><td></td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td>アンビオン</td><td> AM9786 </td><td>すべてのサーフェスを扱う</td></tr><tr><td> 5/32 &quot;粉砕ボール、ステンレス鋼</td><td> OPSの診断</td><td> GSS 156-5000-01 </td><td></td></tr><tr><td>トリゾール</td><td>アンビオン</td><td> 15596018 </td><td></td></tr><tr><td> 1 - ブロモ-3 - クロロプロパン</td><td>シグマ</td><td> B9673-200ML </td><td></td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A416-500 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC処理水</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP561-1 </td><td></td></tr><tr><td> DNase Iを</td><td>プロメガ</td><td> M6101 </td><td></td></tr><tr><td> RNasinリボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>プロメガ</td><td> N2111 </td><td></td></tr><tr><td> RNeasy Miniキット</td><td>キアゲン</td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td>のDynabeads mRNA精製キット</td><td>インビトロジェン</td><td> 610から06 </td><td></td></tr><tr><td>円錐形のスクリューキャップチューブ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 02-681-344 </td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップW / O-リング</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 02-681-364 </td><td></td></tr><tr><td> 2.0ミリメートルジルコニアビーズ</td><td> BIOSPEC製品</td><td> 11079124zx </td><td></td></tr><tr><td>メタンオール、HPLCグレード</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A4524 </td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム、HPLCグレード</td><td>アクロスの有機物</td><td> AC39076 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ショウジョウバエの株式 </td></tr><tr><td> DA-GAL4 </td><td>ブルーミントンストックセンター</td><td> 5460 </td><td></td></tr><tr><td> Gal80 [TS] </td><td>ブルーミントンストックセンター</td><td> 7108 </td><td></td></tr><tr><td> UAS-MJD-27Q </td><td>ブルーミントンストックセンター</td><td> 8149 </td><td></td></tr><tr><td> UAS-MJD-78Q </td><td>ブルーミントンストックセンター</td><td> 8150 </td><td></td></tr><tr><td> UAS-LacZを</td><td>ブルーミントンストックセンター</td><td> 8529 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td> +マットを注入ICのスリーパー</td><td> + MATICを注入</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ篩セット</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 3410531 </td><td> 2最大のメッシュを使用</td></tr><tr><td>ジェノ/グラインダー2000 </td><td> SPEXサンプル前処理</td><td> SP2100-115 </td><td></td></tr><tr><td>ソーバルの伝説のマイクロ</td><td> ThermoScientific </td><td> 75002436 </td><td></td></tr><tr><td>フリーゾーンプラス2.5Lのカスケードフリーズドライシステム</td><td> LabConco </td><td> 7670041 </td><td></td></tr><tr><td>バイオアナライザ対2.6 </td><td>アジレント</td><td> 2100 </td><td></td></tr><tr><td> DynaMag-2マグネット</td><td>インビトロジェン</td><td> 123-21D </td><td></td></tr><tr><td>光度計分光光度計</td><td> ThermoScientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ファストプレップビーズビーター</td><td> ThermoScientific </td><td> FP120 </td><td> &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> Centrivap ​​Vacufugeプラス</td><td> Labconco </td><td> 022820001 </td><td></td></tr></tbody></table>

転写産物および代謝物からの精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ヘッド

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

過去10年間、私たちはモデル生物としてショウジョウバエを用いた神経変性の分子·細胞メカニズムを理解しようとしてきた。ミバエは明白実験的な利点を提供しますが、神経変性疾患の研究は、主に遺伝的相互作用、組織学、免疫蛍光、およびタンパク質生化学などの伝統的な技法に頼ってきた。これらの技術は、明確に定義された生物学的問題で単一遺伝子の役割の詳細な理解につながる機序、仮説ドリブンの研究に有効である。しかし、神経変性疾患は、非常に複雑であり、時間をかけて複数の細胞小器官やプロセ​​スに影響を与える。新しい技術やオミクス時代の到来は、複雑な疾患の根底にあるグローバルセルラー摂動を理解するためのユニークな機会を提供しています。 、 ショウジョウバエなどのフレキシブルなモデル生物は、それらの強いannotのこれらの新技術を適応させるための理想的ですationと高い扱いやすさ。これらの小動物の一つの課題は、しかし、そのようなハエの脳のように、関連性の高い組織から十分な情報分子（DNA、mRNA、タンパク質、代謝物）の浄化である。その他の課題は、実験のためにハエの大量収集から成りレプリケート（統計的頑健性のために重要）と高品質の生物学的物質を精製するための一貫性のある手順を開発。ここでは、遺伝子発現や代謝の全体的な変化は、神経変性疾患に寄与する方法を理解するためにフライヘッドと転写産物および代謝物の抽出数千人を集めるための手順について説明します。これらの手順は簡単にスケーラブルであり、病気へのプロテオミクスおよびepigenomic貢献の研究に適用することができます。

DA-Gal4活性の制御の下で展開されたAtxn3のユビキタスな発現により誘導される致死性を回避するために、我々はGal80 TSとGAL4の時間的な規制を導入しました。しかし、ハエの大量のコレクションと凍結に進む前に、我々はGal80 tsとDA-Gal4活性の制御の下で私たちの導入遺伝子の発現動態を決定したい。これを行うには、我々は、十字架を生成した18℃で子孫を残し、大人のハエを採取し、18℃で24時間のためにそれらを維持℃にそこで我々は、制限温度（29℃）でハエを置き、0、6のためにそれらを培養し、12、24、36、48、72時間。次に、プロトコル10を発表続く単一のハエからウェスタンブロットによって展開されたポリQ対立遺伝子の蓄積を検出しました。式が最初に検出されましたが、温度シフト後のかすかな6時間、それが飽和レベル（ 図2A）に達したとき、48時間まで増加し続けた。 Interesチクチクする、不溶性のポリQの高い分子量のバンドは、それが大きな凝集体を形成するタンパク質のにかかる時間をシグナリング、48時間後に現れた。我々はまた、免疫蛍光（ 図2B）によって展開されたポリQ対立遺伝子の分布を決定するために各時点でハエの脳を解剖した。タンパク質は第一不均一な分布を持つが、温度シフト24時間後に検出された。 24および48時間の間にタンパク質のレベルは触角葉とキノコ体の突起（ 図2B）を含むいくつかの脳中枢がはっきり見えるように、上昇し続けた。 48および72時間の間で展開されたポリQ対立遺伝子の発現は、GAL4システムが完全にこの時点で活性化されたことを示唆し、最大レベルに達した。これらの結果に基づき、我々は、その後の実験のための最初の時点（1日目）のような温度シフト後24時間を選択しました。 10および20日齢ハエのコレクションも温度シフト（TIから始まって測定した私の実験は病原性と制御の導入遺伝子の新たな表現から始まり、時間が0）、。 Atxn3は、29°CでGal80 tsとDA-GAL4の制御下で、24時間後に検出されたことを私達が検証され、我々はこれらのハエは20日間神経変性の徴候を示すかどうかは疑問に思いました。これらのハエが大人としての病原性タンパク質を発現開始以来、我々は、彼らが神経変性表現型を示すために長いインキュベーション時間を必要とするかもしれないことを恐れていた。これらの条件でAtxn3-78Qの毒性を決定するために、我々は、lacZ、Atxn3-27Q、およびAtxn3-78Qを発現しているハエを収集し、その長寿を記録した。 LacZおよび20日後には90％の生存率の上に表示Atxn3-27Qを発現しているハエのに対し、20日目での低い生存率（30％）（ 図3）を示したAtxn3-78Qを発現しているハエ。実際には、Atxn3-78Qは飛ぶ最後の5 dで加速し、損失は（20％）に有意であった10日目（7％死亡）および15日目で死ぬことを開始しましたAYS。したがって、これらの結果は、病原性遺伝子の成人式は短縮寿命、Atxn3-78Qによって誘導される神経変性表現型の主要な兆候をもたらしたことが示された。 このプロトコルの最も重要な側面の一つは、抽出された材料の品質を確保するため、フリーズ後の試料​​の取り扱いと保存しました。我々は、光度に応じDNase処理前に200頭（年齢および遺伝子型に依存）ごとの総RNAを15から80μgの間で抽出した。約3分の1（6から25μg）を260 nm/280 nmでの吸光度の比でDNase処理後に高純度のRNAとして回収した。しかし、我々は、RNA-seqのためのcDNAライブラリーを調製するためのRNAの品質を判断する最良の方法は、バイオアナライザで全RNAを分析することがわかった。幸いなことに、RNAのわずかな量（5 ng）をバイオアナライザで使用されていたので、サンプルあたりのいくつかのライブラリを生成する能力に影響を及ぼさなかった。例として、我々は合計の2つのサンプルを実行したRNAはバイオアナライザチップ上のDNase処理の前に、そのうちの一つは、（ 図4A-C）の低下であることが疑わ。高品質なRNA（サンプル1）リボソームRNAを（ 図4A）を表す3鋭いRNAバンド、ちょうどサイズと200 ntの下に小さいバンドで2000ヌクレオチド（nt）下記2を生産。 NT 2000の周りに2つのバンドは、18S rRNAの（小さ ​​いピーク）とショウジョウバエのrRNAの生物学（ 図4Bを参照）のユニークな側面である28S rRNAの（大きいピーク）からの2つの断片に対応する。これらの資質はまた、バイオアナライザトレース（ 図4B）で観察された。これとは対照的に、分解されたRNAサンプル（サンプル2）リボソームRNAの鋭いピークを生成し、500未満のNT（ 図4A）の複数のバンドを蓄積していませんでした。このサイズ分布は容易に短いサイズの広いピークが認められたバイオアナライザトレース（ 図4C）に区別された。 wを注意することも重要劣化したサンプルが少ないRNAを持っていたことが明らかに2 RNAサンプル間のy軸の単位の違いなど。唯一の（1.8と2.1の間に260 nm/280 nmの吸光度の光度比、2.1が最適であることと、プロトコールステップ3.8を参照）の最大の品質を表示するRNAはライブラリーの生成に使用されます。 代謝物の抽出のために、我々は古典的な水/メタノール/クロロホルム（2.0:2.0:1.8）極性および非極性の両方の代謝物35の抽出を最大限にするには2つのステップに抽出手順3スプリットを追った。極性および非極性相を分離した後、我々はそれぞれ、重水や重水素化クロロホルムでそれらを再構成し、NMRで分析用の内部標準を追加しました。 NMRスペクトルは、代謝プロファイリングの両方に適した、よく高品質の抽出物の精製を示す平坦なベースラインと細い線（ 図5）で解決されたこの抽出法を用いて得られたdは、代謝物の多数の識別図5は、文献7の化学シフトによると、グルコースやスクロース、および2鍵となる代謝酸、乳酸、酢酸などの非常に豊富な代謝物に対応するいくつかの顕著なピークの同定を示す。化学シフト（ppmで）標準分子（TMS、右から最初のピーク）に対して相対的に分子の電磁遮蔽を表しています。もっとshieldedmoleculesは原子核の周りに高い電子密度を持っており、アルキル含むスペクトルの右側に表示されます。アミドと芳香族水素などDeshielded分子はスペクトルの左に表示されます。忙しい中間部（3-4 ppm）は糖分が濃縮されています。 <img alt="図1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50245/50245fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50245/50245fig1.jpg" /> <stチョロン&gt;図1。実験的なワークフロー。まず、目的の遺伝子型（上段）のハエを集めるために十字架を設定します。そこで、我々は℃の遺伝子発現、1、10の年齢にそれらを、20日をアクティブにすると、（2行目）、それらをフラッシュフリーズ29に処女をシフト。我々は、次のマイクロ篩（3番目の行）を使用して冷凍頭を収集します。ヘッドは、凍結乾燥した地面、およびRNA（4行目）または代謝物（下の行）を抽出するために処理されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50245/50245fig2.jpg" /> 図2。発現動態 Atxn3-78Q発現を示す（）ウェスタンブロット（Gal80 TS; DA-GAL4 / UAS-Atxn3-78Q）29℃でインキュベートハエで0℃から72時間へのC。かすかなバンドは最初の6時間後に検出され、彩度が誘導後48時間で到達する。 （B）は同じハエの脳全体の免疫。脳は、固定し、解剖したDは、拡張されたポリQ蛋白質を認識する抗体で染色した。タンパク質は、最初キノコ体（MB）の突起や触角ローブ（アラバマ州）で検出される。 48および72時間の間に、式が最大レベルに達すると豊富な神経支配による脳中枢における高い視認性。 OLと中央の脳の間には、いくつかの大型ニューロンを除く光学ローブ（OL）に見られるように、ニューロンあたりの発現量は弱いです。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50245/50245fig3.jpg" /> 図3。 Atxn3-78Qは、寿命を減らし成虫期（Gal80 TS; DA-GAL4）におけるLacZ、Atxn3-27Q、および遍在Atxn3-78Qを発現しているハエ29℃で、長寿のために監視されたLacZを （青）とAtxn3-27Q（緑）を発現するハエは20日目で死亡率の低いレベルを示した。これとは対照的に、表示されたAtxn3-78Q（赤）を発現するハエ10日から始まる顕著死亡。 15日目までに、彼らは20日目で70％の死亡率に達し、今後5日間加速生存率の20％削減を示した。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50245/50245fig4.jpg" /> 図4。高品質と劣化サンプルからのRNAの品質評価。RNAはBioanalyzerのチップ上で実行されました。 （A）は、バイオアナライザは高品質なRNA（試料1）と分解されたRNA（試料2）サイズマーカー（左車線）の隣で実行されます。中央車線でリボソームRNAに対応する三つの鋭いピークに注意してください。 （B）はバイオアナライザはわずか2000 NTおよび200の下に別の下の二つの特性の強いピークで、サンプル1のトレースを。 （C）バイオアナライザはほとんど分解されたRNAから構成されてサンプル2のトレースを。パネルBとCの間のy軸上の単位の違いに注意してください。 図5。極性代謝物の代表的な1次元NMRスペクトル。 ショウジョウバエと相補的な2D COSY（相関分光法）とHSQC（異核単一量子相関）ピーク割り当てのための実験からの極性代謝物の代表的な1次元のプロトンNMRスペクトル。グルコース; 3：β-アラニン; 4：アセテート; 5：乳酸、2スクロース：代謝物が知られている化学シフト-1に従って識別されます。

私たちはここからmRNAおよび代謝物の抽出および精製するための手順について説明し<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;頭。私たちはより良い神経変性の基礎をなす細胞の摂動を理解するためにこれらの技術を適用している。これらの方法論は、簡単に拡大縮小され、他の &quot;OMIC&quot;プロジェクトに適合させることができる。

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

この手順の目的は、一貫したハイスループット解析が可能な品質と量で、ショウジョウバエの頭部から転写物および代謝物を回収することである。まず、適切な遺伝子型と日齢のハエを3連（トリプリケート）で作成し、急速凍結させる。次に、組織を凍結状態に保ったまま、ハエの頭部を胴体から分離し、抽出のための試料調製を行う。次に、頭部を凍結乾燥させます。最後に、転写産物または代謝物をそれぞれ抽出するため、組織をトリオールまたはクロロホルムで処理します。最終的に、バイオアナライザーおよびNMR解析を通じて、高品質なRNAおよび代謝物が得られたことを確認できます。この手法は、進行性神経変性の細胞学的基盤に関する知見を提供できるだけでなく、がん、老化、ストレス介在性疾患などの他の疾患にも適用可能です。まず、UAS制御下の目的のトランスジェーンを持つ未交尾雌10匹と、温度感受性Gal4およびwaterlessを持つ雄5匹を交配させます。4匹の雄を大型ボトルに移してください。ボトルにラベルを貼り、25 °Cで保管します。2日後、ボトルから成虫を取り除き、ボトルを18 °Cに置きます。次世代のELOが出現したら、処女虫を回収して小型のフライフードバイアルに入れ、バイアルにラベルを貼って18 °Cで24時間保管します。18 °Cで24時間経過した後、バイアルを29 °Cに移します。ハエが10日齢および20日齢に達するまで、2日ごとに清潔なバイアルに移し替えます。ハエが目的の齢に達したら、個体数を数え、小さな漏斗を用いてラベル済みのクライオバイアルに転移させます。バイアルをベンチ上で倒立させ、30分間待ちます。次に、バイアルを液体窒素に浸して急速凍結させ、ラベル貼付済みの予冷済みフリーザーボックスに保存します。ハエの頭部を回収するため、ふるいを組み立て、-80°Cで少なくとも30分間予冷しておきます。9 by 14 cmのパラフィルムをドライアイスで5分間冷却します。クライオバイアルからパラフィルムの上に、数本ずつハエを移します。絵筆を使用してハエの数を数え、100匹が集まるまでドライアイス上の別のクライオバイアルに保存します。次に、ふるいを液体窒素に浸し、その後、100匹のハエを上部チャンバーに入れて、ふるいを1分間激しく振ります。再度液体窒素に浸し、さらに1分間振ります。ふるいを開けます。下部チャンバーから頭部を回収してマイクロチューブに入れ、すべてのサンプルが凍結乾燥の準備が整うまで-80 °Cで保存します。マイクロチューブの蓋を開け、上部をパラフィルムでラップし、小さな穴を開けます。RNAを抽出するため、サンプルを凍結乾燥機に入れ、最低2日間処理します。凍結乾燥機からサンプルを取り出し、各マイクロチューブに小さな滅菌済みステンレス製粉砕ボールを3個ずつ加えます。組織ホモジナイザーにセットし、毎分1,500ストロークで運転します。1分間運転後、トリアゾールを1 mL加え、パラフィルムでチューブを密閉してさらに1分間粉砕します。必要に応じてチューブを逆さまに叩いてステンレスボールを離し、さらに1分間粉砕します。混合液を新しいRNaseフリーマイクロチューブにピペットで分注します。卓上マイクロ遠心機を用い、12,000 ×g、4°Cで10分間遠心分離し、細胞残渣をペレット化します。上清を新しいマイクロチューブに移した後、0.1容量の1,3-ブロモクロロプロパンを加え、15秒間激しく振盪します。室温で3分間インキュベートした後、4°Cで12,000 ×gで15分間遠心分離し、上層の水層を新しいマイクロチューブに移します。氷冷したイソプロパノールを0.5容量分加えてRNAを沈殿させ、6回反転させて混合します。サンプルを室温で10分間インキュベートし、上清を除去した後に遠心分離を行います。氷冷した70% ethanolを1 mL加え、短時間ボルテックスしてRNAを洗浄します。遠心分離を行う前に、上清を除去し、ペレットを15分以上風乾させます。DEPC処理水 80 µLを加え、55 °Cで10分間保持します。その後、4 °Cで一晩保存し、翌日に操作を行います。テキストのプロトコルに従って30 µgのバルクRNAを精製してRNA濃度を測定し、Bioanalyzerのtotal RNA PICOアッセイを用いて、mRNA精製のためのRNA品質を評価します。30 µLのDynaBeadsを含むRNaseフリーのマイクロ遠心チューブをマグネットに1〜2分間置き、上清を除去します。ビーズを15 µLの結合バッファーで再懸濁します。チューブをマグネットに静置してインキュベートし、バッファーを除去した後、DEPC処理水を用いて5 µgの全RNAの液量を15 µLに調整します。RNAを65 °Cで2分間加熱し、氷上に置きます。15 µLの全RNAを、あらかじめ洗浄した15 µLのビーズに加え、室温で30分間インキュベートします。マグネットの上に1〜2分間静置し、上清を除去します。35 µLの洗浄バッファーBでRNAを3回洗浄し、最後の洗浄液を除去した後、15 µLの冷えた10 mM Tris-HClを加え、サンプルを80 °Cで2分間加熱してmRNAを溶出させます。S上清を直ちにRNaseフリーチューブに移し、-80°Cで凍結させます。メチルクロロホルム抽出を行う際の総RNAの回収率は、約1〜5%となるはずです。まず、クロロフォームにブチル化ヒドロキシトルエンを0.1 mg/mLの濃度になるように添加します。200個の頭部を、あらかじめ重量を測定し冷却した円錐形のスクリューキャップ付きポリプロピレンチューブに移し、-80 °Cで凍結させた後、凍結乾燥させます。乾燥重量を測定後、5〜7個のジルコニアビーズを加え、ビーズビーターを用いて800 Hzで20秒間を2サイクル、ホモジナイズします。乾燥重量に基づき、以下の比率に従って添加する水、メタノール、クロロフォームの量を算出します（ここでXは最も重量のあるサンプルの重量（g）であり、算出結果は各液体の体積（mL）となります）。凍結乾燥した頭部を含むチューブに、算出した量のメタノール全量と、全水分量の45%を添加します。ビーズビーターでさらに20秒間を2サイクル、サンプルをホモジナイズした後、クロロフォーム全量と残りの水を、氷上の円錐形ガラスバイアルに添加します。ビーズ混合物をガラスバイアルに移して10分間振り混ぜ、その後、氷上で10分間インキュベートする。続いて、4°C、2000 ×gで5分間遠心分離を行う。パステールピペットを用いて上層の極性相を取り除き、2本目のマイクロチューブに移す。小ガラスバイアルに入った下層の非極性相を-80°Cで凍結させた後、窒素ガス流下で乾燥させる。脱水クロロホルム620 µLを加え、非極性相を再水和させます。600 µLをラベル付きのNMRチューブに移し、多相系を30 °CのSentri VAに設置します。チューブが完全に乾燥するまで、約7時間Sentri VAを作動させます。0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液（重水調製、内部標準として1 mM TMSPを含む）620 µLを用いてポリフェーズを再懸濁し、30秒間ボルテックスします。10,000 RPM、4 °Cで5分間遠心分離します。SUPINATE 600 µLをNMRチューブに移し、GAL A TTSおよびDOLA scale 4の制御下にあるexpanded at attacks in three trench遺伝子の発現ダイナミクスを測定します。制限温度での異なる時点からウェスタンブロットを実施したところ、ここに示すように、6時間時点では発現は弱かったものの、48時間まで増加し続け、飽和レベルに達しました。このタンパク質は、摘出したショウジョウバエの脳を用いた免疫蛍光染色によっても検出され、温度シフト後24時間でまず検出され、その後48時間から72時間の間で最大レベルに達しました。ATIN 3 78 Qの毒性を判断するため、LAX Z aax in 3 27 QおよびAAX in 3 78 Qを発現するハエを収集し、その生存期間を記録しました。lack ZおよびATEX in 3 27 Qを発現するハエは20日後も90%以上の生存率を示したのに対し、atex in 3 78 Qを発現するハエは20日目の生存率が低い結果となりました。この例では、DNA処理前の全RNAサンプル2つをバイオアナライザーチップで分析しました。高品質なRNAサンプル1では、2000ヌクレオチドの直下に2本の鮮明なRNAバンドが、そして200ヌクレオチド未満にリボソームRNAを示すより小さいバンドが1本確認されました。これらの品質は、バイオアナライザーのトレースでも同様に観察されました。対照的に、分解したRNAサンプルであるサンプル2では、リボソームRNAの鮮明なピークは見られず、500ヌクレオチド未満の複数のバンドが蓄積していました。このサイズ分布は、より短いサイズの広範なピークが認められたバイオアナライザーのトレースにおいて容易に区別されました。ライブラリの作製には、最高品質を示すRNAのみが使用されます。この図のNMR解析では、文献の化学シフトに基づき、グルコースやスクロースなどの高含有量メタボライト、および乳酸と酢酸という2つの主要な代謝酸に相当するいくつかの顕著なピークが同定されています。このビデオを視聴することで、大量のJoss headから高品質な転写物および代謝物を取得する方法について十分に理解でき、神経細胞の消失を媒介する毒性アミロイドによって誘発される分子および細胞レベルの摂動を明らかにすることが可能になります。

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