水性二相系を用いた細胞の共培養パターニング

この手順の全体的な目標は、完全に水性の環境で細胞を直接パターン化することです。これは、まずポリエチレングリコールやデキストリンなどの長鎖ポリマーを細胞培養培地が入った別々のチューブに溶解することによって達成されます。第2のステップは、アニズを試み、ペレットを回収し、一方または両方のポリマー溶液中に細胞を所望の播種密度で再懸濁することです。

次に、ポリマー溶液を細胞培養皿に分注します。2つのポリマーの非適合性により、2つの完全水性液体の空間パターニングが可能になります。細胞をいずれかのポリマー溶液または両方のポリマー溶液に含めて、さまざまなパターンを作製できます。

最後のステップは、細胞が4時間以上接着した後、ポリマー溶液を除去し、それを培地に置き換えることです。最終的には、明視野顕微鏡または蛍光顕微鏡を使用して細胞のパターン化を確認できます。この技術がマイクロコンタクトプリンティングのような既存の方法よりも優れている点は、マイクロパイプパターンのようなシンプルなツールを用いて、細胞を全水性環境でパターニングできることです。

この方法は、細胞遊走を評価し、細胞間ペリクリンおよびオートクリンシグナル伝達を調査するための組織工学に使用でき、その手順は、高山研究室の学部生であるAbrahamと大学院生のJoshua Whiteです。まず、2つの異なるポリマーを実験で使用する特定の媒体に溶解します。この例では、ポリエチレングリコール(PEGとも呼ばれる)とデキストリン(Dexとも呼ばれる)の分子量は、それぞれ35キロダルトンと500キロダルトンです。

ここに示すチャートのように、それぞれ異なる濃度のPEGとdexを持つ15ミリリットルのコニカルチューブに16個の2ミリリットルのサンプルを調製します。これを達成するには、チャートに従って適切な量のPEGとdexを計量し、両方のポリマーが完全に溶解するまで穏やかに揺さぶって培地で混合します。これには、ポリマーが完全に溶解してから数時間かかる場合があります。

解決策は曖昧であるべきです。サンプルを1000 Gで5分間遠心分離して相分離を確認します。密度の高いボトムフェーズはデックスリッチになります。

トップフェーズはペグリッチになります。次に、0.1ミリリットルの追加培地をチューブにゆっくりと加え、サンプルを20秒間ボルテックスします。次に、サンプルを再度遠心分離して、相分離を確認します。

溶液は透明です 追加の容量の培地を添加した後、このステップを繰り返し、さらに0.1ミリリットルの培地を添加し、溶液が透明になり、相分離しなくなるまでサンプルを遠心分離します。これは、その特定の混合物の臨界点のしきい値に達したことを示します。この時点での各チューブの最終的な重量を記録します。

最後に、面の分離点における 2 つのポリマーの重量あたりの重量パーセントを決定します。ビンの節点曲線をプロットし、重量ペグあたりの重量パーセントを Y 軸に配置し、重量デッキあたりの重量パーセントを X 軸に配置します。この曲線は、この媒体中の PEG と dex の面分離のしきい値濃度です。

細胞の排除パターニングを開始するには、ビンリンパ節の閾値によって決定される臨界点値の2倍でPEGとdexの別々の溶液を調製します。これらの実験では、重量あたり 5% の重量 PEG と 12.8% の重量デッキを 10% の FBS と 1% の抗生物質と共に DMEM に追加します。チューブはロッカーに配置され、完全に溶解します。

次に、この実験のための排除パターニングに用いる細胞を採取し、80%コンフルエンスにあるhela細胞を0.5%tripsinを用いて3分間トライプする。採取したら、ヘモサイトメーターを使用して細胞の数を数え、次にペレット化して、5%PEGを添加した培地でミリリットルあたり375,000細胞で細胞を再懸濁します。この濃度によりサンプルが生成され、培養すると翌日にはコンフルエントになります。

次に、マイクロピペッターを使用して、12.8%deck溶液の0.5マイクロリットルの液滴を乾燥した96ウェルプレートに分注し、排除パターニングを行います。Dexの液滴は、後で使用するために無菌条件下で乾燥させることができます。次に、200マイクロリットルのPEGヘラ細胞懸濁液をゆっくりとウェルに分注します。

D液滴を覆うには、まずD液滴をPEG溶液で覆ってから周囲を埋めることが重要で、これにより液滴がウェル全体に広がるときに液滴が破壊されるのを防ぐことができます。すべてのウェルをパターン化し、慎重に播種したら、細胞培養プレートを加湿インキュベーターに入れます。取り扱い中に皿が傾かないようにし、細胞を12時間接着させた後、パターンを乱さないように水平なインキュベーター棚に置いてください。

PEG溶液を取り出し、200マイクロリットルの培地で3回洗浄して、残留ポリマーを除去します。次に、200マイクロリットルの新鮮な培地を加え、プレートをインキュベーターに戻します。培養物を定期的に監視して、細胞の増殖と除外ゾーンへの移動を観察します 島のパターニングを開始します。

細胞培養培地に、重量あたり5%の重量PEGおよび重量あたり12.8%の重量の溶液を調製します。また、アイランドパターニングに使用するhela細胞を採取し、再度、ヘモサイトメーターを使用して利用可能な細胞の総数を決定します。次にペレットと蘇生。

培地で1ミリリットルあたり500万個の細胞で細胞を回転させます。12.8%dexを継続すると、細胞がヒーラ細胞と同様に接着しない場合、24時間以内にコンフルエントに達するには、より高濃度の細胞が必要になる場合があります。次に、200マイクロリットルのPEG溶液を96ウェルプレートの各ウェルにピペットで移します。

次に、PEG溶液を含む各ウェルに0.5マイクロリットルのデッキセル懸濁液をゆっくりと加えます。液滴は底に沈み、培養表面に接触します。次に、プレートをインキュベーターに慎重に移し、12時間後にパターンを乱す可能性のあるディッシュを傾けないように注意します。

PEG溶液を取り出し、200マイクロリットルの培地で3回洗浄します。次に、200マイクロリットルの新鮮な培地を加え、プレートをインキュベーターに戻します。培養物を定期的にモニタリングして、細胞の増殖と島から外側への移動を観察します。

10%FPSと1%Antibioticsを使用したDMEMで、重量あたり5%の重量PEGと12.8%の重量デッキの溶液を準備することにより、共培養パターニングを開始します。また、排除およびアイランドパターニングで使用される2つの細胞タイプを成長させ、それらが合流点近くになるようにします。同時に、ここでは、Hep Gの2つのC3 a肝細胞の島を使用し、それらを取り囲むNIH 3 T3の線維芽細胞を使用します。次に、2つの細胞タイプを採取し、ヘモサイトメーターを使用して別々にカウントします。

これらの2つの細胞タイプは、明視野顕微鏡ペレット、Hep Gの2つのC3 A肝細胞を使用して簡単に区別でき、アイランドパターニングとresusは12.8%デッキで費やされます。次に、線維芽細胞をペレット化して排除、パターニング、および5%ペグで懸濁液を蘇生します。次に、0.5マイクロリットルのD細胞懸濁液を乾燥した96ウェルプレートに分注し、dex液滴を200マイクロリットルのpeg細胞懸濁液で穏やかに覆います。

その後、12時間後にプレートをインキュベーターに移します。培地を取り出し、200マイクロリットルの培地で3回すすいでください。次に、200マイクロリットルの新鮮な培地を加え、プレートをインキュベーターに戻します。

最後に、共培養のアルブミン染色強度を監視することで、線維芽細胞共培養の有益な効果を評価することができます。ここでは、さまざまな水性二相系を形成するために必要なポリマー濃度を、ビン節点曲線より上の濃度でのビン節点曲線で説明します。このシステムは、ビンの節点曲線の下に 2 つのフェーズを形成します。

解決策は、少なくとも2回の透明な単相二相システムです。二元曲線上に見られる濃度は、このビデオで説明されている水性二相系で使用するのに十分です。それらの使用の最初の例は、小さな領域を細胞の空洞のままにすることができる除外パターン化です。

アイランドパターニングは、小さな領域を細胞と一緒に配置できる排他パターニングとは正反対のものを作り出します。これら2つの手順の組み合わせを利用して、ここに示すように、細胞の島を別の細胞タイプで囲むことができる独自の共培養を形成することができます。排除パターニングを使用してプレーティングされたHela細胞は、空隙を埋めるために増殖および遊走します。

時間の経過とともに。ボイドのサイズをモニターすることで、さまざまな条件下での細胞の遊走と増殖に関する貴重な洞察を得ることができます。一方、アイランドパターニングは、細胞の増殖を測定するために使用できます。

アイランドパターニングと除外パターニングの組み合わせにより、共培養の明確な領域が生まれます。ここに示されているのは、線維芽細胞に囲まれた肝細胞の島です。これらのコロニーは、少なくとも4日間は培養において組織を維持することがわかっています。

このシステムを使用すると、同じプレート上で複数の細胞島を増殖させることができます。島単独で増殖させた場合、肝細胞は線維芽細胞との共培養で増殖した場合よりもアルブミンの産生がわずかに少なかった。この手順を試みる際には、臨界濃度の2倍の濃度のポリマーを使用して二相溶液を形成することを忘れないでください。

このビデオを見れば、水性二相系を定式化し、それを使用して細胞をパターン化し、形状を定義する方法について十分に理解できるはずです。