微生物の同定とキャラクタリゼーションのためのパイロシーケンシング

次の実験の全体的な目標は、パイロシーケンシング法を使用した16 sリボソームDNA配列分析を通じて細菌を同定することです。これは、まずビオチン化プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により標的DNAを増幅することで達成されます。次に、ビオチン化アンプリコンをストレプトアビジン被覆スフェロビーズを使用して固定化し、洗浄バッファーを使用して精製します。

次に、アンプリコンを変性させ、16 sリボソームシーケンシングプライマーをDNAの一本鎖にELLします。このステップの目標は、シーケンシングのためにDNAを準備することです。最後に、DNAシーケンシング反応は、合成によるシーケンシングの原理に基づいて核酸をシーケンシングする迅速かつ正確な方法であるパイロシーケンシングによって行われます。

ビオチン化アリコンは、DNAポリメラーゼのテンプレートとして使用され、DN TPSを一度に1塩基ずつ取り込むことで、ピロリン酸が生成されます。TP Sul Ureaseは、ピロリン酸をA-T-P-A-T-Pに比例して変換し、ルシフェラーゼを介したルシファーからルシファーへの変換を触媒し、TPの量に比例した光を生成します。この光はパイロトレース上にピークとして記録され、ヌクレオチドの取り込みを示します。取り込まれていないDN NTPは、合成の継続のために次のDNTPが追加される前に、Aprasによって分解されます。

ログラムに記録された化学発光シグナルにより、DNAの配列を決定することができます。得られた結果はリボソーム16のSDNA配列であり、リボソームDNA参照データベースと比較することにより細菌を同定するために使用されます。パイロシーケンシングは、微生物のゲノムシーケンシングを容易にする汎用性の高い技術であり、細菌種の同定、細菌株の識別、および抗菌剤に対する耐性を付与する遺伝子変異の検出に使用できます。

このビデオでは、細菌アンプリコン生成の手順を実演します amplicon pyroシーケンシングとDNA配列解析 テンプレート増幅の手順を開始するには、必要なすべての溶液を解凍し、それぞれを完全に混合します。すべての作業は室温で行うことができます。この表に従ってPCR反応を設定します。

ほとんどの場合、最終的な塩化マグネシウム濃度が1.5ミリモルであれば、満足のいく結果が得られることに注意してください。ただし、25ミリモルの3.5マイクロリットルまでより高いマグネシウム濃度が必要な場合は、塩化マグネシウムを反応に添加できます。1つのプライマーは、その5つのプライムエンドでビオチン化する必要があり、プライマーはHPLCで徹底的に精製することをお勧めします。

反応混合物を静かにピペッティングして混合し、適切な量をPCRチューブに分注します。次に、各PCRチューブにテンプレートDNAを添加します。1反応あたり10ナノグラムのゲノムDNAが推奨されます。

PCRチューブをサイクラーに入れ、マスターミックスを作成する前にこのサイクリングプログラムを開始します。連鎖球菌の熱心なコーティングされたセロスビーズのボトルを渦巻いて、均質な懸濁液を確保します。このフローチャートに従ってマスターミックスを作成します。

ビーズ、結合バッファー、高純度水をマイクロ遠心チューブに組み合わせます。使用するPCR産物の量に応じて、60〜75マイクロリットルのマスターミックスをPCRプレートの各ウェルに分注し、総容量がウェル当たり80マイクロリットルになるようにした。各ウェルに5〜20マイクロリットルのビオチン化PCR産物を加えます。

ウェルあたりの容量は80マイクロリットルになるはずです。ウェルをストリップキャップで密封し、オービタルシェーカーを使用して室温で5〜10分間、PCRプレートを1,400RPMで撹拌します。この手順を開始するには、シーケンシングプライマーをニーリングバッファーで0.3マイクロモルに希釈し、反応プレートの各ウェルに25マイクロリットルを分注します。

プレートをバキュームワークステーションに配置します。この図に従ってワークステーションのトラフを埋めます。トラフに50ミリリットルの70%エタノール、トラフに40ミリリットルの変性溶液、トラフに40ミリリットルの変性溶液を2つ、トラフに50ミリリットルの洗浄緩衝液、トラフ4に50ミリリットルの高純度水、トラフ5に70ミリリットルの高純度水。

真空ポンプをオンにし、真空ツールのスイッチがオンに設定されていることを確認し、フィルタープローブを高純度水で洗い流します。トラフ5では、ビーズを積んだPCRプレートをワークステーションに置き、PCRプレートと反応プレートの両方が同じ向きになるようにします。バキュームツールをPCRプレートのウェルに下げます。

20秒間、またはすべてのボリュームが吸引されるまで、ビーズはバキュームがオンのままでバキュームツールによって捕捉されます。ツールを70%エタノールで20秒間、またはすべての容量が吸引されるまでフラッシュします。次に、ツールを変性溶液で20秒間、またはすべてのボリュームが吸引されるまでフラッシュします。

その後、ツールを洗浄バッファーで20秒間、または真空をオンにしたまますべてのボリュームが吸引されるまでフラッシュします。バキュームツールを垂直90度を超えて5秒間持ち上げて、バキュームツールからすべての液体が排出されるようにします。次に、ポンプをオフにし、バキュームツールを3つの反応プレートに合わせます。

バキュームツールをウェルに下げます。その後、約10秒間左右に静かに振って、シーケンシングプライマーを含むウェルにビーズを放出します。バキュームツールをウォータートラフに入れて洗浄し、DNAのシーケンシングプライマーを洗浄します。

リアクションプレートをプリウォームプレートホルダーに入れます。プレートを摂氏80度で2分間加熱します。プレートをホルダーから取り外し、カウンターに置いて室温で5分間冷まします。

この手順を開始するには、電源コードの上部にある電源スイッチを使用して機器の電源を入れ、必要な容量を決定します。装置ソフトウェアでランファイルを設定し、ツールメニューでプリラン情報を選択します。実行前情報ページに記載されている指示に従って、カートリッジを充填します。

ピペットの先端を各ウェルの隅にできるだけ下に置いて、気泡が存在しないことを確認します。カートリッジゲートを開き、ラベルを前に向けてカートリッジを挿入します。カートリッジが正しく挿入されていることを確認し、ゲートを閉じます。

プレート保持フレームを開き、反応プレートを装置内に配置します。プレート保持フレームと器具の蓋を閉じます。ランを入れたUSBスティックをUSBスティックに挿入します files機器ソフトウェアで作成したUSBポートに 機器プレスの前面にあるUSBポート。

目的の実行ファイルのメニューが表示されます。スクロール矢印を使用して目的の実行ファイルを選択し、選択を押します。すべてのプリセット圧力および温度レベルに達すると、装置は実行中に試薬の分注を開始します。

装置画面には、選択したウェルのパイロがリアルタイムで表示されます。スクロール矢印を使用して、他の井戸のパイロを表示します。測定器が実行が終了し、実行ファイルがUSBスティックに保存されたことを確認したら、閉じるを押します。

USBスティックを取り外します。一般的なパイロシーケンシングの実行結果を以下に示します。フォワードおよびリバースPCRプライマーは、DNAテンプレートの保存された領域、つまり16 sリボソーム配列用に設計されています。

この例では、シーケンシングプライマーは、青色で示されているアンプリコン内の十分に特徴付けられた同定超可変DNA配列のすぐ上流に配置されています。この超可変配列は、保存されたシーケンシングプライマーを内部品質管理として使用して多数の細菌種の細菌同定を可能にし、可変領域を囲むDNA配列をチェックして、正しいDNA領域が分析されたことを確認できます。Pyroシーケンシングソフトウェアを使用すると、生成された配列を細菌のリボソーム配列の内部データベースと比較およびアラインメントして、細菌を同定できます。

さらに、配列を解析して、抗生物質薬剤耐性を付与する突然変異を特定することができます。例えば、ヘリコバクター・ピロリの23 sリボソーム遺伝子の突然変異を解析すると、GAAとGAの2つの突然変異パターンが明らかになり、抗生物質耐性を付与することがわかりました。Pyroシーケンシングは、微生物のゲノムシーケンシングを容易にする汎用性の高い技術です。

微生物学アプリケーションにおけるパイロシーケンシングの利点には、迅速で信頼性の高いハイスループットスクリーニング、微生物や微生物ゲノム変異の正確な同定などがあります。さらに、パイロシーケンシング法では、SNPの点変異、挿入、欠失のタイピングや、一部の抗菌薬耐性パターンで発生する可能性のある複数の遺伝子コピーの定量化など、抗菌薬耐性の完全な遺伝的多様性を解析できます。このビデオをご覧いただき、ありがとうございました。また、シーケンシング実験のご活用