ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス
May 20th, 2013
非標的メタボロミクスは、代謝プロファイルのスナップショットを生成する仮説を提供します。このプロトコルは、細胞、血清、または組織からの代謝物の抽出と分析を紹介します。代謝物の範囲は、液 - 液相抽出、差分解析ソフトウェアに結合されたマイクロウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー/高分解能質量分析法（UPLC-HRMS）を用いて調査している。
次の実験の全体的な目標は、生物学的サンプルのさまざまなグループの代謝プロファイルのスナップショットを比較することです。これは、液体、液体抽出を使用して有機分子と極性分子を分離することによって達成されます。第2のステップとして、液体クロマトグラフィーによって分子をさらに分離し、高分解能質量分析法で分析することで、保持時間、質量電荷比、および強度データを提供し、さらなる分析を行います。
次に、液体クロマトグラフィーの実行をアラインメントし、特徴を検出、定量、およびソートします。グループ間で異なる豊富な特徴を特定するため。結果は、液体クロマトグラフィー、高分解能質量分析によって検出される分析種の異なる存在量に基づく、処理条件による特徴の違いを示しています。
この方法は細胞代謝の研究にも使用できますが、バイオマーカーの発見やゼノ生物代謝に関する洞察も提供できます。接着性ラインの場合は、10cmプレートの細胞に1.5ミリリットルの培地を追加します。プレートを氷の上に置き、細胞を持ち上げるためにそっとこすります。
1.5ミリリットルの持ち上げた細胞懸濁液を、あらかじめ標識された10ミリリットルのガラス遠心チューブに移します。次に、サンプルを含む10ミリリットルのガラス管のそれぞれに、2〜1個のクロロホルムメタノールの6ミリリットルを追加します。サンプルを低速で30分間振とうした後、1,935倍Gの低加速減速設定でサンプルを遠心分離し、摂氏4度で10分間遠心分離し、長いステムパスチャーピペットを使用してフェーズを完全に分離します。
有機層を新しいラベル付き10ミリリットルガラス遠心チューブに移します。次に、水性層をきれいなプラスチック製の2ミリリットルのeinorチューブに移します。この時点で、有機サンプルと水性サンプルを窒素ガス下で蒸発させます。
乾燥させたサンプルを50〜100マイクロリットルの開始溶液に再構成し、目的のUPLCメソッドに使用します。サンプルを静かに上下にピペットで動かして、分析物の溶解を助けます。次に、各サンプルを0.22ミクロンのナイロンチューブフィルターに移し、サンプルが完全にフィルターを通過するまで約5分間、Gの14,000倍まで回転させます。
サンプルを検査して、サンプルに目に見える沈殿物が残っていないことを確認します。ろ過したサンプルの上清を、バイアルにインサートキャップを付けた標識済みUPLCバイアルに移します。次に、フリックしてサンプルバイアルの底から気泡を取り除きます。
サンプルを冷やした自動車サンプラーに入れます。次に、液体クロマトグラフの制御ソフトウェアを使用して、有機サンプルの実行を作成します。これに続いて、最適化されたUPLC条件に基づいて有機サンプルの分析を作成します。
最適化されたUPLC条件を使用して、水相のメソッドも作成します。既知のターゲット分析種のセットに関心が高い場合は、これらの化合物の重標識アナログを使用してUPLC条件を最適化し、メソッドを作成します。これらの条件を使用して、UPLCが適切に平衡化するのを待ちます。
これには、溶媒の完全なプライミングを含める必要があります カラムを取り付け、新しいカラムの平衡化量について製造元の指示に従う前に、高分解能質量分析計の制御ソフトウェアを使用して将来の問題を診断するのに役立つ開始背圧のログを維持してください。ポジティブ モードの方法を作成します。次に、同じ条件を使用して、ネガティブモードメソッドを作成します。
機器を清掃して校正します。分光器に安定したスプレーを確立し、キャリブレーション溶液が光源と光学系から適切に散逸するまで待ちます。スプレーの許容可能な安定性は、使用されているlcメソッドと同じ流量でキャリブレーション溶液を注入した少なくとも100回のスキャンで強度の3〜5%の相対標準偏差を与える必要があります。
乱数発生器とキーを使用して、分析によってもたらされるバッチ効果を避けるために、サンプルをランダムに設定します。すべてのサンプルのシーケンスを設定します。適切な注入量を設定し、最初のサンプルの前にブランクを実行します。
サンプル間のキャリーオーバーまたはマトリックスの影響が疑われる場合は、適切なブランクまたは洗浄を実行し、シーケンスを開始し、分析全体の圧力変動や信号強度の損失などの問題がないか定期的に監視します。重大な問題が検出された場合は、実行を停止します。機器を清掃して校正します。
分光器に安定したスプレーを確立し、キャリブレーション溶液が光源と光学系から適切に散逸するまで待ちます。示差分析を開始する前に、合計イオン電流を手動で確認するか、サンプル中の既知の化合物のフィルタリングされたクロマトグラムを確認します。すべてのサンプルでランの再現性と注入スラッシュUPLCスラッシュスプレーの安定性を確保するには、質量分析計からRAWデータファイルをふるいが設置されているワークステーションのハードドライブに転送します。
ふるいを開きます。新しい実験を開始し、適切なファイルをふるいにロードします。比較グループを割り当て、SIE V が解析用のパラメータを生成できるように 1 つの参照ファイルを選択します。
プロンプトに従い、個々の実験の要件ごとにパラメーターを調整します。パラメータに正または負のモードの正しい付加体リストをロードします。解析が終了したら、フレームのリストが画面に表示されていることを確認します。
lc アライメントがランドマークのピークに重なっていることを確認します。アライメントされていない lc ランのいずれかがランドマークピークに大きな偏差を示している場合。これは、サンプルに問題があることを示している可能性があります。
類似サンプル母集団内の変動係数でデータをプロットします。目的の特性に基づいてリストを並べ替えます。次に、各ピークがグループ間で適切なピークアライメントになっているかを調べます。
ピーク積分、ガウス、ピーク形状信号強度、同位体、付加物の割り当て。必要に応じてデータをエクスポートして、さらなる分析を行ったり、確認やMS実験の最終段階までのためのターゲット質量リストを作成したりできます。微分に使用された2つのプログラムによって多数のヒットが同定され、緑色のドットはコントロールでより豊富に特徴付けられ、一方、赤色のドットは処理でより豊富です。
ドットサイズが大きいほど、グループ間の折り畳み変化の大きさが増加していることを示し、色の強度は、写真の色の彩度が増加するにつれてP値が減少することを示します。以下は、有機相ポジティブイオンモードを示すクロマトグラムです。UPLC MS 分析ウィンドウ A は、S Civ 2.0 からの総イオン電流を示しています。XCMSでDパネルとして識別された特徴の抽出されたイオンクロマトグラムがウィンドウBに表示され、ウィンドウCはsveから既知の腐敗として識別された特徴の抽出されたイオンクロマトグラムを示しています。
ウィンドウ D は、sve から既知の腐敗として識別された特徴について抽出されたイオンクロマトグラムを、総イオン電流に正規化した sve から示しています。腐敗が知られている治療群で減少した差次的に豊富な特徴は、正確な質量データベース検索により、暫定的にd パナディンとして同定されました。分析種の同一性は、U-P-L-C-H-R タンデム質量分析法で確認されました。
ここに示されているのは、サンプルと純粋な化合物のクロマトグラムと質量スペクトルの比較です。クロロホルムの取り扱いは非常に危険であり、換気の良いドラフトなどの適切な予防措置に従う必要があることを忘れないでください。
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概要
このプロトコルは、ターゲットなしのメタボロミクスを使用して生体サンプルから代謝産物を抽出し分析するプロセスを概説しています。液液抽出に続いて液体クロマトグラフィーと高解像度質量分析を行い、包括的な代謝プロファイルを生成します。
主要な研究要素
科学分野
- メタボロミクス
- 分析化学
- 生物サンプル分析
背景
- ターゲットなしのメタボロミクスは代謝プロファイルについての洞察を提供します。
- 液液抽出は有機分子と極性分子を分離します。
- 高解像度質量分析は詳細な分子データを提供します。
- 差分分析はサンプルグループ間の変動を特定するのに役立ちます。
研究の目的
- 異なる生物サンプル間で代謝プロファイルを比較する。
- 処置条件間で異常に豊富な代謝産物を特定する。
- 包括的なプロファイリングのために高度な分析技術を活用する。
使用方法
- 代謝産物の分離のための液液抽出。
- 分離のためのマイクロフロー超高速液体クロマトグラフィー。
- 詳細分析のための高解像度質量分析。
- 特徴を定量化し分類するための差分分析ソフトウェア。
主要な結果
- グループ間での異常に豊富な代謝産物の同定。
- 保持時間、荷電比、強度のデータ。
- 処置条件に基づく代謝の変動に関する洞察。
- 様々な生物サンプルからの代謝産物の包括的なプロファイリング。
結論
- ターゲットなしのメタボロミクスは代謝仮説を生成するのに効果的です。
- 高度な技術は代謝プロファイルの理解を強化します。
- 結果は代謝メカニズムに関する将来の研究に情報を提供できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Untargeted metabolomics using UPLC-HRMS enables comprehensive metabolic profiling across diverse biological matrices, supporting early discovery and translational research. This workflow provides high-resolution, label-free quantification of metabolic changes, facilitating biomarker discovery and mechanistic de-risking in drug development pipelines. Its scalability and reproducibility make it a valuable asset for portfolio-wide metabolic pathway interrogation and lead prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables unbiased metabolic pathway screening to clarify biological mechanisms.
- Supports functional target validation by quantifying differential metabolite abundance.
- Facilitates mechanistic de-risking through comprehensive metabolite coverage.
- Provides data for predictive confidence in early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Generates validated metabolic profiles for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for assay standardization.
- Supports scalability from microflow to higher throughput formats.
- Enables reliable evaluation of compound-induced metabolic changes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns metabolic signatures with disease-relevant biomarkers for translational continuity.
- Bridges discovery findings to preclinical validation through robust metabolite quantification.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on metabolic pathway impact.
- Enhances predictive value for candidate selection in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This untargeted metabolomics workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis-driven and exploratory studies.
- Discovery Biology: Provides high-content metabolic data for pathway elucidation and target de-risking.
- Screening: Offers reproducible, quantitative metabolite measurements for assay readiness.
- Analytics: Delivers retention time, m/z, and intensity data for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects metabolic changes to disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized platform for repeated metabolic profiling across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in metabolic research.
- Operational Value: Standardizes sample processing and data acquisition for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early metabolic risk assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on metabolic insights.
Implementation Considerations
- Requires expertise in UPLC-HRMS operation and metabolomics data analysis.
- Demands access to high-resolution mass spectrometry and bioinformatics infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for sample preparation and data processing.
- Adaptable to various biological matrices with protocol modifications as needed.
- Careful handling of hazardous solvents and calibration procedures is essential for data quality.
