Name: ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学ぶUPLC-HRMSを用いた非標的メタボロミクス手法で、生物試料からの代謝物抽出と高分解能質量分析による包括的プロファイリングを行い、処理条件間の差異的豊富な代謝物を同定する方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、NIHの助成金P30ES013508と5T32GM008076の支持を認める。またSIEVE 2.0とDRSへのアクセスのためにサーモサイエンティフィックに感謝します。ユージンCiccimaro有用な議論のためのサーモサイエンティフィック社のマーク·サンダース。

1。細胞からのサンプル抽出<ol><li>細胞の10センチ板の場合：事前標識を10mlのガラス遠心管にメディアで持ち上げられた細胞懸濁液1.5mlを集める。接着ラインのために、細胞を氷上で保存メディア1.5mlに優しいスクレイピングと解除されるべきオプション ：社内基準が使用されている場合は、この段階で適切な分量を追加します。 コメント ：細胞代謝のクエンチングは、特定の代謝物のために極めて重要である。時間に敏感な代謝産物の分析のために、このような冷メタノール抽出などの手続きを考慮すべきである。17 </li><li>サンプルを含む10 mLガラス管の各々に6 mlのクロロホルム（CHCl 3中）/メタノール（CH 3 OH）（2:1、v / v）を追加する。 30分間低速でシェーカーまたはマルチボルテックスのサンプルを設定します。振盪後、サンプルを4℃で10分間、1,935×gで低加速/減速設定で遠心分離℃で完全に相を分離する。 オプショナル </eM&gt;：CHCl 3中の使用を避けるために、抽出は（CH 2 Cl 2中 ）をジクロロメタンで行うことができる18,12。 </li><li>長い茎パスツールピペットを使用して、新しいプレ標識を10mlのガラス製遠心管に有機（下）層を転送します。 4.1に進みます。 </li><li>きれいなプラスチック2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに後で上部の水を移す。窒素ガス下で試料を蒸発する。水相の脱塩のために2.6.2に進みまたは直接分析のために4.1に進みます。 </li></ol> 2。血清からのサンプル抽出<ol><li>プラスチック2ミリリットルエッペンドルフチューブに血清を20μlを移しオプション ：社内基準が使用されている場合は、この段階で適切な分量を追加します。 </li><li> 10秒間CH 3 OH、ボルテックスの190μLを加える。 </li><li> 10秒間のCHCl 3、ボルテックスの380μLを加える。 </li><li>相分離を誘発するために、H 2 Oを120μLを加える。ボルテックスは、10秒間のサンプルと10 RTで平衡化させ分。 </li><li> 4℃で10分間、8,000×gでサンプルを遠心°Cのフェーズを分離する。 </li><li>きれいなプラスチック2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに低い有機相を転送します。 4.1に進みます。 </li><li>きれいなプラスチック2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに後で上部の水を移す。窒素ガス下で試料を蒸発する。 </li><li> 200μlのH 2 Oに再懸濁サンプル酸または塩基試薬（0.1％酢酸、ギ酸、0.1％水酸化アンモニウム）を優先的にpH感受性代謝物を抽出するために使用することができる。完全に再懸濁試料に氷上で20分間超音波洗浄します。 </li><li> 500μlのCH 3 OHでC18スピンカラムをアクティブにします。 </li><li> 500μlのH 2 Oの2回の洗浄とスピンカラムを平衡化した後、サンプルをロードします。酸/塩基試薬が使用される場合、洗浄工程では、この濃度を維持する。 </li><li>サンプルを脱塩する500μlのH 2 Oで洗浄します。酸/塩基試薬を使用する場合は、再度、洗浄、この濃度を維持するステップ。 </li><li>あらかじめ標識クリーン2ミリリットルエッペンドルフチューブにH 2 Oで3 OH CH200μlの80％の2倍量の溶出。酸/塩基試薬が使用される場合、再度、洗浄工程では、この濃度を維持する。 4.1に進みます。 </li></ol> 3。組織からのサンプル抽出<ol><li>組織によっては、凍結した組織の10から100 mgの間で使用。氷浴中で1mlのPBS（1 M、pHが6.8）で予め標識した2ミリリットル低く保持エッペンドルフチューブに組織の全部分を追加してオプション ：内部標準が使用される場合、添加する前に、バッファに追加する組織。 </li><li>各エッペンドルフで30秒間電気ティッシュグラインダーで氷の中に組織をホモジナイズする。試料との間に、それぞれ、CH 3 OHとH 2 Oを含む2つの別々のチューブに組織グラインダーを清掃。 </li><li>あらかじめ標識を10mlのガラス遠心チューブにプラスチックピペットで組織ホモジネートを転送します。転写後、各エッペンドルフチュー​​ブをリンスCH 3 OH 1mlで2倍とガラス管の組織ホモジネートに洗浄を追加します。 </li><li>組織ホモジネートおよびCH 3 OHの洗浄を含む10ミリリットルのガラス管のそれぞれにのCHCl 3 4ミリリットルを追加します。 30分間低速でシェーカーまたはマルチボルテックスのサンプルを設定します。 </li><li>振とう後、完全に相を分離し、10分間1,935 xgで低加速/減速設定でサンプルを遠心オプション ：クロロホルムを使用しないように、抽出をCH 2 Cl 2で開発されている。 </li><li>長い茎パスツールピペットを使用して、新しいプレ標識を10mlのガラス製遠心管に有機（下）層を転送します。 4.1に進みます。 </li><li>長い茎パスツールピペットを使用して、新しいプレ標識を10mlのガラス製遠心管に水層を転送します。脱塩のために2.6.2に行くか4.1に進みます。 </li></ol> 4。 UPLCのためのサンプルの再懸濁及びろ過<ol><li> SAMPを蒸発させる窒素ガス下レ。 </li><li>再構成は、所望UPLC法（ 表1参照）の出発溶液の適切な量のサンプルを下に乾燥させた。 50〜100μlのは、通常、望ましい再懸濁ボリュームです。優しくボルテックスおよび/または分析物を溶解するのを助けるために上下にサンプルをピペット。 </li><li>サンプルが完全にフィルタ（〜5分）を通過するまで14,000×gで、最大で0.22μmのナイロンチューブフィルタとスピンに試料を移す。試料中に残っている沈殿目に見えるがないことを確認してください。 </li><li>インサート付き予め標識UPLCバイアルにフィルターサンプルの上清を移す。キャップバイアルは、その後サンプルバイアルの底から任意の気泡を除去するためにバイアルをフリック。チルドオートサンプラ（4-5℃）にサンプルを置きます。 </li></ol> 5。 UPLCのセットアップ<ol><li>液体クロマトグラフのための制御ソフトウェアを使用して、に示す条件をベースにして有機試料の実行を作成する<strオング&gt;表1。 。次いで、 任意 の表1に示す条件から水相のための方法を作成して、標的分析物の既知のセットは高い関心がある場合、これらの化合物の重標識アナログを用いUPLC条件を最適化し、これらの条件を使用してメソッドを生成する。 </li><li> UPLCが十分に平衡化することができます。これは、カラムを取り付け、新しいカラムの平衡量（通常3-5カラム容積）については、製造元の指示に従って前に溶剤の完全なプライミングを含める必要があります。将来の問題の診断に役立つ圧力をバック開始のログを維持します。 </li></ol> 6。質量分析計のセットアップ<ol><li>高分解能質量分析計のための制御ソフトウェアを使用して、 表2に示す条件を用いたポジティブモードメソッドを作成します。次に同じ条件を用いて、ネガティブモードメソッドを作成オプション ：標的分析物の既知のセットは、高いintである場合erest、最適ソースおよびこれらの化合物の重標識類似体を用いた光学条件、およびこれらの条件を使用してメソッドを生成する。 </li><li>きれいにし、測定器を校正、分析計に安定したスプレーを確立し、校正液が十分にソースと光学から放散するための時間を可能にします。スプレーの許容安定性は、使用されているLC法と同じ流量でキャリブレーション溶液の注射で少なくとも100スキャンにわたって強度のRSD 3〜5％を与える必要があります。 </li><li>すべてのサンプルのシーケンスを設定し、適切な注入量を設定して、最初のサンプルの前に空白を実行します。サンプル間のキャリーオーバーやマトリックス効果が疑われる場合は、十分な空白/洗浄を実行します。サンプルは、分析によって導入されるバッチの影響を回避するために乱数発生器と鍵を用いてランダム化された方法で設定すべきである。 コメント ：おそらくターゲットの安定同位体標準または分析基準を含む品質管理サンプルはできる信頼性、再現性、および有効な結果のトラブルシューティングと保証する上で極めて貴重。溶媒ブランク続い標準サンプルのみの技術的複製は、ブランクランに信号強度と保持時間のずれだけでなく、キャリーオーバーにアクセスするために使用することができます。 </li><li>シーケンスを開始し、圧力変動、または実行渡る信号強度の損失を含む問題を定期的に監視します。深刻な問題が検出された場合は、実行を停止し、6.2から繰り返す。 </li></ol> 7。微分解析<ol><li> 2つのワークフローは、このプロトコルのために提示されています。最初はSIEVE 2.0、サーモフィッシャーによって販売独自のラベルフリー微分解析ソフトウェアを使用することです。第二ワークフローがXCMSオンライン、スクリプス研究所を通じて、無料のプラットフォームを介して行われます11は 、差動解析を開始する前に、手動でのTICをチェックしたり、ランの再現性を確保するために、サンプル中の任意の既知化合物のフィルタリングクロマトグラムを見てと、すべてのサンプルを通して注入/ UPLC /スプレー安定。 </li><li> SIEVE <ol><li>質量分析計からSIEVEがインストールされているワークステーションのハードドライブに。生データファイルを転送します。 （ 注：それは解析の速度を制限することができるようにネットワーク接続されたポートまたはUSBポート接続されたドライブに保存されたデータのふるいを実行することはお勧めできません。） </li><li> SIEVEを開き、新たな実験を開始します。 </li><li> SIEVEに適切なファイルをロードします。 </li><li>比較群を割り当て、SIEVE、分析のためのパラメータを生成できるように単一の参照ファイルを選択します。 </li><li>プロンプトに従って、個々の実験の要件に従って任意のパラメータを調整します。分析時間を長くすることができますそれは頻繁に戻って、より寛大な設定などのパラメータを緩め、次に厳しいパラメータで開始しすることをお勧めします。 </li><li>パラメータに正または負のモードの正しい付加物リストをロードします。 </li></ol></li><li> XCMSオンライン<ol><li>ファイルを変換するオンラインXCMSの許容形式に。我々のケースでは、我々は形式をmzXMLに変換19 </li><li>オープンXCMSオンライン、およびジョブを作成します。 </li><li>アップロードし、データセットの名前を付けます。唯一の2つのデータセット（ 例えば 、コントロール対トリートメント）スタンドアロンXCMSは頭に頭の比較に限定されているようにアップロードすることができます。 </li><li>ドロップダウンリストから目的の設定を選択します。事前設定のパラメータが異なる計装のセットアップのために利用可能であり、これらは、さらに実験的なニーズに合わせて変更することができます。我々のケースでは、HPLC-Orbi2設定を使用します。 </li><li>ジョブをサブミットして確定します。 </li></ol></li><li>データ解析<ol><li>分析が終了したら、それぞれSIEVEとXCMSフレームと機能のリストについては、移入されます。液晶配向は、任意のランドマークピークを重ねていることを確認してください。アラインされていないLCの実行のいずれかが画期的ピークに大きな偏差を示す場合、これは、サンプルに問題があることを示している場合があります。 オプション ：内部標準が使用される場合SIEVEは、第見つける対応するピークグループと選択したフレームに正規化する。オンラインでXCMSの場合、正規化は、エクスポート後のスプレッドシートで行うことができます。 </li><li>のようなサンプル集団（ 例えば、コントロールサンプル）内の変動係数（CV）によってデータをプロット。大規模CV値は、1つまたは複数のサンプルの問題を示すことができる。希望の特性（ 例えば、p値&lt;0.05、倍の変化&gt; 1.5、グループ内の低い標準偏差など ）に基づいてリストをソートします。 </li><li>グループ間で適切なピークアラインメント、ピーク積分、ガウスピーク形状、信号強度、同位体、及び付加割り当ての各ピークを調べます。 </li><li>さらに分析するために必要に応じてデータをエクスポートしたり、確認との MS n実験用ターゲットマスリストを生成する。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling+of+the+fission+yeast+S.+pombe%3A+quantification+of+compounds+under+different+temperatures+and+genetic+perturbation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation.</a> Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).</li>
<li>Makarov, A., Denisov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+Evaluation+of+a+Hybrid+Linear+Ion+Trap%2FOrbitrap+Mass+Spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer.</a> Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).</li>
<li>Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative%2C+validated+capillary+electrophoresis-time+of+flight-mass+spectrometry+method+with+integrated+high-confidence+analyte+identification+for+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics.</a> Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).</li>
<li>Katajamaa, M., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+processing+for+mass+spectrometry-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Data processing for mass spectrometry-based metabolomics.</a> J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).</li>
<li>Katajamaa, M., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+methods+for+differential+analysis+of+LC%2FMS+profile+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data.</a> BMC Bioinformatics. 6, 179(2005).</li>
<li>Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+ultra+performance+liquid+chromatography+coupled+to+q-TOF+mass+spectrometry+as+a+tool+for+differential+metabolic+pathway+profiling+in+functional+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies.</a> Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).</li>
<li>Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XCMS2%3A+processing+tandem+mass+spectrometry+data+for+metabolite+identification+and+structural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization.</a> Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).</li>
<li>Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MZmine%3A+toolbox+for+processing+and+visualization+of+mass+spectrometry+based+molecular+profile+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data.</a> Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).</li>
<li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MZmine+2%3A+Modular+framework+for+processing%2C+visualizing%2C+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC Bioinformatics. 11 (1), 395(2010).</li>
<li>Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XCMS%3A+Processing+Mass+Spectrometry+Data+for+Metabolite+Profiling+Using+Nonlinear+Peak+Alignment%2C+Matching%2C+and+Identification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification.</a> Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).</li>
<li>Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XCMS+Online%3A+A+Web-Based+Platform+to+Process+Untargeted+Metabolomic+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).</li>
<li>Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Lipid+Extraction+for+Targeted+Stable+Isotope+Dilution+Liquid+Chromatography-Mass+Spectrometry+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis.</a> J. Vis. Exp. (57), e3399(2011).</li>
<li>Want, E. J., Wilson, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLCG%C3%87%C3%B4MS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li>
<li>Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+extraction+from+suspension-cultured+mammalian+cells+for+global+metabolite+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling.</a> Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).</li>
<li>Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li>
<li>Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+evaluation+of+metabolite+extraction+protocols+for+untargeted+metabolic+profiling+of+liver+samples+by+UPLC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS.</a> Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).</li>
<li>Shaham, O., Slate, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasma+signature+of+human+mitochondrial+disease+revealed+through+metabolic+profiling+of+spent+media+from+cultured+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).</li>
<li>Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dichloromethane+as+a+Solvent+for+Lipid+Extraction+and+Assessment+of+Lipid+Classes+and+Fatty+Acids+from+Samples+of+Different+Natures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).</li>
<li>Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+uniform+proteomics+MS%2FMS+analysis+platform+utilizing+open+XML+file+formats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats.</a> Mol. Syst. Biol. 1, (2005).</li>
<li>Cleveland, W. S., Devlin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+weighted+regression+-+an+approach+to+regression-analysis+by+local+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Stat.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Locally weighted regression - an approach to regression-analysis by local fitting.</a> J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).</li>
<li>Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+assessment+of+alignment+procedures+for+LC-MS+proteomics+and+metabolomics+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements.</a> BMC Bioinformatics. 9 (1), 375(2008).</li>
<li>Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+feature+detection+for+high+resolution+LC%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS.</a> BMC Bioinformatics. 9 (1), 504(2008).</li>
<li>Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAMERA%3A+An+Integrated+Strategy+for+Compound+Spectra+Extraction+and+Annotation+of+Liquid+Chromatography%2FMass+Spectrometry+Data+Sets%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets.</a> Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).</li>
<li>Kanehisa, M., Goto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KEGG%3A+kyoto+encyclopedia+of+genes+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes.</a> Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).</li>
<li>Smith, C. A., O'Maille, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METLIN%3A+a+metabolite+mass+spectral+database%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Drug+Monit%22%5BJournal%5D)">METLIN: a metabolite mass spectral database.</a> Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).</li>
<li>Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PubChem%3A+a+public+information+system+for+analyzing+bioactivities+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules.</a> Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).</li>
<li>Wishart, D. S., Knox, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMDB%3A+a+knowledgebase+for+the+human+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HMDB: a knowledgebase for the human metabolome.</a> Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
<li>Folch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipids+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues.</a> J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).</li>
<li>Avery, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+differential+ion+suppression+on+liquid+chromatography%2Fatmospheric+pressure+ionization+mass+spectrometric+bioanalytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

非標的メタボロミクスは、内因性または生体異物生物変換を調査したり、興味のあるサンプルからの代謝プロファイルを取得するための強力なツールを提供しています。サンプル、生成された大規模なデータセットに対応する能力、および有用な情報（ 例えば、精密質量データベース検索）のデータセットをマイニングする機能を分離して分析するために使用される技術の分解能と感度を持つ技術スケールの出力。最近では、これは高分解能質量分析計の進歩によって容易に、かつ高又は超高性能液体クロマトグラフィされている。差分解析ソフトウェアは、分析ボトルネックに対処して、高スループットでの保持時間シフト、フィルタリング、および統計分析のためのピーク検出調整を達成することができる。適切なインフォマティクスパイプライン20,21,22選択は、アルゴリズムセントロイディングデータに関して考慮事項を含めるべきであるピーク検出、ピーク積分、alignmenT、MS / MSデータを統合する能力、および同位体または付加物に対処する能力。適切なケムインフォマティクスデータベースの23選択も考慮すべきである。24,25,26,...

HRMSの分野における最近の技術の進歩のために、関連性の低い、仮説生成メタボロミクスのアプローチは、複雑なサンプルの分析に実現可能なアプローチになっています。百万ルーチン低い部分を容易にし10万分解能（ppm）の質量精度が可能な1質量分析計が広くなっている複数のベンダーから入手できる。2,3この質量精度は、分析対象のID、同位体パターン認識、および付加物の識別の予備割り当てに大きな特異性と信頼性を可能にします。4適切な抽出法と高性能LCまたはUPLC、複雑な混合物と結合したときリテンションタイムデータから得られ、追加の特異性を分析することができる。5 UPLCが大きくクロマトグラフィー効率を有する、可能なメタボロームの大きいカバレッジを作る高い感度、解像度、分析時間を可能にする。6得られた大量のデータセットを任意に統合することができ多重差解析ソフトウェアおよび7,8,9,10,11推定されるヒットが最初にピーク検出アルゴリズムの組み合わせ、精密質量ベースの化学式予測、フラグメンテーション予測を用いて同定することができる。有用なパターンや目的の分析物について個々の採掘、および化学データベース検索。このアプローチは、定量化のための現在の金の標準的な方法である研究MS /選択/ UPLCまたは多重反応モニタリング時間のかかる完全な構造の識別に以上に敏感とより具体的な安定同位体希釈の開発のためのターゲットの優先順位付けを可能にします。12 生体試料の様々な性質は、尿13、セル14、血清15、または組織16の抽出プロトコルの最適化につながっている。このプロトコルの特徴抽出細胞、血清、組織のために。適切な場合には、コメントや追加の参照はmodificaのために含まれています安定同位体を含めることに対処するための手順のtions、または特に不安定な代謝物の包含のため。

<table><tbody><tr><td colspan="4">試薬</td></tr><tr><td>Phosphate緩衝生理食塩水</td><td>Mediatech</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>水 (H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W7-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>アセトニトリル (CH3CN)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>メタノール (CH3OH)</td><td>FisherScientific</td><td>A454-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A464-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>クロロホルム(CH3Cl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td>ハザード</td></tr><tr><td>ジクロロメタン(CH2Cl2)</td><td>Acros Organics</td><td>61030-1000</td><td>クロロホルム</td></tr><tr><td>ジエチル エーテル</td><td>Sigma-Aldrich を置き換える</td><td>346136</td><td>クロロホルム</td></tr><tr><td>ギ酸 (FA)</td> <td>を置き換えるには Fisher Scientific</td><td></td><td>(optima)</td></tr><tr><td>NH4OH</td><td>Fisher Scientific</td><td>A470-250</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Ammonium forte (HCOONH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78314</td><td></td></tr><tr><td>MicroSpin C18 Columns Nest</td><td>Group Inc</td><td>SS18V</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>10 ml ガラス遠心チューブ</td><td>キンブルチェイス</td><td>73785-10</td><td></td></tr><tr><td>10 ml プラスチック遠心チューブ</td><td>CellTreat</td><td>CLS-4301-015</td><td></td></tr><tr><td>LC バイアル (ガラス)</td><td>Waters</td><td>60000751CV</td><td></td></tr><tr><td>LC インサート (ガラス)</td><td>Waters</td><td>WAT094171</td><td></td></tr><tr><td>LC バイアル (プラスチック)</td><td>Waters</td><td></td><td></td>186002640</tr><tr><td>0.22 &mu;m フィルター</td><td>Corning</td><td>8169</td><td>ナイロン</td></tr><tr><td>2 ml Eppendorf Tubes</td><td>BioExpress</td><td>C-3229-1</td><td>Low Retention</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>高分解能質量分析計</td><td>Thermo Scientific</td><td>LTQ XL-Orbitrap</td><td></td></tr><tr><td>HPLC/UPLC</td><td>Waters</td><td>nanoACQUITY UPLC</td><td></td></tr><tr><td>Source</td><td></td><td>Michrom ThermoAdvance Source</td><td></td></tr><tr><td>Differential Analysis Software</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sieve 2.0</td><td></td></tr><tr><td>nanoACQUITY C18 BEH130</td><td>Waters</td><td>186003546</td><td>1.7 &mu;m粒径、150 mm x 100 &mu;m</td></tr><tr><td>アセンティス エクスプレス C8</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>54262</td><td>2.7 &mu;m 粒子サイズ、15 cm x 200 &mu;メートル</td></tr></tbody></table>

ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（uplc-hrms）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

ここでは含めて興味のある生物学的サンプルのための代謝プロファイルを分析するためのワークフローを提示し、細胞、血清、または組織。試料を最初に液 - 液相抽出により極性および非極性画分に分離され、部分的に下流の分析を容易にするために精製される。水溶液（極性代謝物）と初期抽出の有機的（非極性代謝物）のフェーズの両方が代謝物の広い範囲を調査するために処理される。代謝産物は、そのパーティション特性に基づいて異なる液体クロマトグラフィー法により分離される。この手法では、マイクロ超性能（UP）LC方法を提示したが、プロトコルがより高い流量と低い圧力に適合している。質量分析計への導入は、一般的な最適化された化合物または元の条件のいずれかを使用してすることができます。イオンの広い範囲の検出は、最近、Cでの高解像度を使用して幅広いのm / z範囲にわたって正と負の両方のモードにおいてフルスキャンモードで行われるalibrated楽器。ラベルフリー差分解析は、バイオインフォマティクスプラットフォーム上で実施される。このアプローチのアプリケーションは、代謝経路のスクリーニング、バイオマーカー探索、及び薬剤開発が含まれています。

示された結果は、農薬やミトコンドリア複合体I阻害剤ロテノンとSH-SY5Y神経膠芽腫細胞の6時間の処理から選択したデータを示す。簡潔にするために、唯一の有機相ポジティブモードデータが提示される。サンプルが処理され、上述したように分析した（ 図1、表1、表2）とラベルフリー定量化、およびSIEVE XCMSオンラインで2つの差解析プラットフォーム上にロードした。ヒットの数が多い（ 図2、図3）は 、差動解析に使用される2つのプログラムによって識別されますが、これらの機能は、おそらくアーティファクト、不完全に統合されたピークは、と疑問分析値の他の機能が含まれています。これは、適切な信号強度、同じグループのサンプルを、バックグラウンドレベル、および良好なクロマトグラフピーク形状（ 図3）との間の低い変動をヒットをスクリーニングすることによって判断することができる。 downstreを実証するために、初期のヒット曲の確認私、私たちは3 ppmの内の私達の治療化合物ロテノン（ <stron...

非標的メタボロミクスは、代謝プロファイルのスナップショットを生成する仮説を提供します。このプロトコルは、細胞、血清、または組織からの代謝物の抽出と分析を紹介します。代謝物の範囲は、液 - 液相抽出、差分解析ソフトウェアに結合されたマイクロウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー/高分解能質量分析法（UPLC-HRMS）を用いて調査している。

ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

本実験の全体的な目的は、異なる生物学的試料群の代謝プロファイルのスナップショットを比較することです。これは、液液抽出を用いて有機分子と極性分子を分離させることで達成されます。第二のステップとして、分子を液体クロマトグラフィーでさらに分離し、高分解能質量分析計で分析します。これにより、さらなる解析に必要な保持時間、質量電荷比、および強度のデータが得られます。次に、液体クロマトグラフィーのランをアライメントし、特徴量を検出、定量、およびソートします。これにより、群間で変動している特徴量を同定します。結果は、液体クロマトグラフィーおよび高分解能質量分析で検出された分析物の変動量に基づいた、処理条件間における特徴量の違いを示します。この手法は細胞代謝の研究に使用できるだけでなく、バイオマーカーの探索やゼノバイオティクス代謝に関する知見を得るためにも活用できます。接着系細胞株の場合、10 cmプレート内の細胞に培地1.5 mLを加えます。プレートを氷上に置き、穏やかにスクレイピングして細胞を回収します。回収した1.5 millilitersの細胞懸濁液を、あらかじめラベルを貼った10 milliliterガラス製遠心チューブに移します。次に、サンプルが入った各10 milliliterガラスチューブに、2:1のクロロホルム・メタノールを6 milliliters加えます。サンプルを低速で30分間振盪します。振盪後、加速・減速設定を低くして、4 degrees Celsiusで1,935 ×g、10分間遠心分離し、ロングステムパステールピペットを用いて相を完全に分離させます。有機相を、あらかじめラベルを貼った新しい10 milliliterガラス製遠心チューブに移します。次に、水相を清潔なプラスチック製の2 milliliterエッペンドルフチューブに移します。この時点で、有機相および水相のサンプルを窒素ガス下で蒸発させます。乾燥させたサンプルを、目的のUPLCメソッドに使用する開始溶液50～100 µLで再構成します。ピペッティングを穏やかに行い、分析物の溶解を促進させます。その後、各サンプルを0.22 micronのナイロンチューブフィルターに移し、サンプルが完全にフィルターを通過するまで、14,000 ×gで約5分間遠心分離します。サンプルを確認し、目に見える沈殿物が残っていないことを確かめます。ろ過したサンプルの上澄みを、ラベルを貼ったUPLCバイアルに移し、インサートキャップで密閉します。その後、バイアルの底から気泡を取り除くために軽く弾いてください。サンプルを冷却オートサンプラーに設置します。次に、液体クロマトグラフの制御ソフトウェアを使用して、有機サンプルのランを作成します。続いて、最適化したUPLC条件に基づいた有機サンプルのランを作成します。最適化されたUPLC条件を用いて、水相用のメソッドも同様に作成します。特定のターゲット分析物のセットに高い関心がある場合は、これらの化合物の重標識アナログを用いてUPLC条件を最適化し、メソッドを生成してください。これらの条件を用いて、UPLCを十分に平衡化させます。カラムを取り付ける前に、溶媒による十分なプライミングを行ってください。また、新品カラムの平衡化量について製造元の指示に従い、高分解能質量分析計の制御ソフトウェアを用いて初期バックプレッシャーのログを記録し、将来的な問題の診断に役立ててください。正イオンモードのメソッドを作成します。次に、同じ条件で負イオンモードのメソッドを作成してください。装置の洗浄および校正を行います。分光計への安定したスプレーを確立させ、校正溶液が光源および光学系から十分に消失するまで時間を置きます。許容されるスプレーの安定性は、使用するlcメソッドと同じ流量で校正溶液を注入し、少なくとも100回のスキャンにおいて強度の相対標準偏差が3〜5%以内であることとします。乱数生成器とキーを使用して、分析によって導入されるバッチ効果を避けるため、サンプルをランダムな順序で設定します。すべてのサンプルのシーケンスを設定してください。適切な注入量を設定し、最初のサンプルの前にブランクを測定します。サンプル間のキャリーオーバーやマトリックス効果が疑われる場合は、十分なブランクまたは洗浄を行い、シーケンスを開始して、圧力変動やラン全体を通じた信号強度の低下などの問題がないか定期的に監視してください。重大な問題が検出された場合は、ランを停止し、装置の洗浄および校正を行ってください。分光計への安定したスプレーを確立し、ソースおよび光学系からキャリブレーション溶液が十分に消失するまで時間を置きます。差分分析を開始する前に、全イオン強度をマニュアルで確認するか、サンプル中の既知化合物についてフィルター後のクロマトグラムを確認してください。すべてのサンプルを通じて、ラン、注入/UPLC/スプレーの安定性と再現性を確保するため、質量分析計からsieveがインストールされているワークステーションのハードドライブにRAWデータファイルを転送します。sieveを開きます。新しい実験を開始し、適切なファイルをsieveにロードします。比較グループを割り当て、リファレンスファイルを1つ選択して、SIE Vに解析パラメータを生成させます。プロンプトに従い、個別の実験要件に合わせてパラメータを調整します。パラメータ設定で、ポジティブモードまたはネガティブモードに対応する正しいアドダクトリストをロードしてください。解析が完了したら、画面上にフレームのリストが表示されていることを確認します。lcアライメントがランドマークピークに重なっていることを確認してください。アライメントされていないlcランのいずれかでランドマークピークに大きな偏差が見られる場合、サンプルに問題がある可能性があります。同様のサンプル集団内での変動係数に従ってデータをプロットします。希望する形質に基づいてリストをソートしてください。次に、各ピークについて、群間で適切にピークアライメントが行われているかを確認します。ピーク積分、ガウス関数、ピーク形状の信号強度、同位体およびアダクトの同定を行います。必要に応じてデータをエクスポートし、さらなる解析を行うか、確認およびMS/MS実験のためのターゲット質量リストを作成します。使用した2つのプログラムにより多数のヒットが同定されました。緑色の点は対照群でより豊富に存在する特徴量であり、赤色の点は処理群でより豊富に存在する特徴量を示しています。ドットのサイズが大きいほど、グループ間の倍率変化（fold change）の大きさが大きいことを示し、色の強度は、彩度が高くなるほどP値が低下することを表しています。ここでは、有機相のポジティブイオンモードUPLC MS分析を示すクロマトグラムを示します。ウィンドウAは、S Civ 2.0の全イオン電流（TIC）を示しています。ウィンドウBには、XCMSによってD panethと同定されたフィーチャーの抽出イオンクロマトグラムが表示されています。ウィンドウCは、sveから既知のrotと同定されたフィーチャーの抽出イオンクロマトグラムを示しています。ウィンドウDは、全イオン電流で正規化した、rot knownとして同定された特徴量の抽出イオンクロマトグラムを示しています。rot known処理群で減少した、発現量に差のある特徴量が、高精度質量データベース検索によってd panadineであると暫定的に同定されました。この分析物の同一性は、U-P-L-C-H-Rタンデム質量分析によって確認されました。ここでは、サンプルと純粋な化合物のクロマトグラムおよびマススペクトルの比較を示しています。クロロホルムの取り扱いは極めて危険であるため、十分に換気されたドラフトチャンバーの使用など、適切な予防措置を講じることを忘れないでください。

untargeted-metabolomics-from-biological-sources-using

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

超高速液体クロマトグラフィーと質量分析(UPLC-MS)を組み合わせたノンターゲット代謝物プロファイリングは、代謝を調査するための強力な技術です。...

超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析（UPLC-MS）による血清中の大規模非標的メタボロームプロファイリング

代謝物プロファイリングは、健康と病気における代謝の研究に貴重な資産となっている。極性切り替えと迅速なデューティサイクルの高分解能質量分析に連結された正常相化液体クロマトグラフィーを利用して、我々は、高感度、精度、および解像度を有する生物学的物質の極性代謝物を分析するためのプロトコルを記載している。...

敏感な、大規模定量的メタボロームのための戦略

1つのサンプルを用いて生物学的組織からの脂質、代謝産物およびタンパク質を包括的に抽出するためのプロトコルを提示する。...

単一サンプルからの代謝産物、脂質およびタンパク質の包括的分析のための単純分別抽出法

正確に高分解能質量分析計を接続した液体クロマトグラフィーによる定圧ラベリング、広範な分別、バイオインフォマティクス...

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

タンパク質とタンパク質代謝の相互作用は携帯電話のすべての機能のために重要です。ここで、選択の蛋白質のこれらの相互作用の平行分析を可能にするプロトコルについて述べる。私達のプロトコルは、植物細胞培養用に最適化されたし、質量分析を用いたタンパク質と代謝物の検出と親和性の浄化を結合します。...

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

小麦粒代謝物および脂質の非標的分析法を紹介する。このプロトコルは、アセトニトリル代謝産物抽出法と逆相液体クロマトグラフィー質量分析法法を含み、正および負のエレクトロスプレーイオン化モードでの取得を伴う。...

無標的液体クロマトグラフィー-質量分析法ベースの小麦粒のメタボロミクス分析

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッ カロミセス・セレビシエ の定量的メタボロミクス

このプロトコルの目的は、半標的クロマトグラフィー質量分析法を使用して血漿中のフェノール代謝産物を検出することです。...

高齢者の血漿中のフェノール代謝産物の質量分析に組み合わせた半標的超高速クロマトグラフィー

XY-MetaとmetaXを統合した非標的メタボロミクスワークフローを構築しました。このプロトコルでは、XY-Metaを使用してオープンアクセススペクトルリファレンスからデコイスペクトルライブラリを生成する方法を示し、FDR制御を行い、メタボロミクススペクトルを同定した後、metaXを使用して代謝産物を定量しました。...

FDR制御ベースの非標的メタボロームにおける同定と定量化の統合ワークフロー

ここでは、希少な細胞タイプの代謝物を正確かつ確実に測定するためのプロトコルを紹介します。細胞選別用の改良シース液や関連するブランクサンプルの生成などの技術的改善により、サンプルあたりわずか5000細胞のインプットで代謝物の包括的な定量が可能になりました。...

希少初代細胞のターゲットメタボロミクス

学ぶUPLC-HRMSを用いた非標的メタボロミクス手法で、生物試料からの代謝物抽出と高分解能質量分析による包括的プロファイリングを行い、処理条件間の差異的豊富な代謝物を同定する方法です。

ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

さらに動画を探す