Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Akira Sassa; William A. Beard; David D. Shock; Samuel H. Wilson

doi:10.3791/50695

DNAグリコシラーゼ活性の定常状態、プレ定常状態、およびシングルターンオーバー速度論的測定

JoVE Journal
Chemistry

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Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

DNAグリコシラーゼ活性の定常状態、プレ定常状態、およびシングルターンオーバー速度論的測定

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14:27 min

August 19, 2013

DOI: 10.3791/50695-v

Akira Sassa¹, William A. Beard¹, David D. Shock¹, Samuel H. Wilson¹

¹Laboratory of Structural Biology,NIEHS, National Institutes of Health

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

8 - オキソグアニンDNAグリコシラーゼのグリコシラーゼ活性のための時間のコースには、製品の形成と線形定常段階のバーストを示す二相性である。クエンチフロー法を利用して、バースト定常状態速度は、それぞれ、製品のDNAグリコシラーゼからの8 - オキソグアニンおよび放出の切除に対応する、測定することができる。

次の実験の全体的な目標は、迅速速度論的手法を使用して、ヒト 8 OXO ギネ、DNA グリコシル酸塩に対する 8 OXO ギネの切除と製品放出の速度を決定することです。これは、最初に酵素濃度の低い定常状態の時間経過を測定し、最初のターンオーバー中に急速なフェーズが発生するかどうかを判断することによって達成されます。最初のターンオーバーが急速な場合、定常状態の時間経過はゼロに外挿されず、代わりに活性酵素濃度を第2ステップとして反映します。

予備定常状態での生成物形成速度は、より高い酵素濃度の急速混合および急冷技術によって測定でき、最初のターンオーバー中に大量の生成物を観察できます。次に、化学ステップは、基質が酵素で飽和している単一のターンオーバー条件下でも監視できます。触媒サイクリングを伴わずに酵素の活性部位での事象を単離するために、時間経過がゼロ時間で生成物をゼロに外挿しないという観察に基づいて、定常状態では酵素からの生成物放出が律速であることを示す結果が得られます。

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