可逆小分子またはバイオセンサー応用のためのマルチコンポーネント構造を固定化するために、マイクロ流体オンチップキャプチャ - 環化反応

次の実験の全体的な目標は、センサーチップの表面に低分子と官能基化されたナノ粒子を可逆的に固定化するための迅速で一般化可能な戦略を実証することです。これは、まず抗GST抗体をセンサー表面に固定化することで達成されます。GST抗原の捕捉の第2ステップとして。

トランスシクロ基、オクチン基、またはテトラジン基で官能基化することで、低分子テットサイン誘導体またはナノ粒子トレンドシクロオクタン結合体とのその後のシクロエディション反応に反応性表面を提供し、その後、低分子テットサイン誘導体で官能基化されます。次に、官能基化された表面を、所望の可溶化ターゲットとの相互作用分析に用いることができる。最後のステップでは、表面が再生され、その後の捕捉サイクロエディションサイクルの結合結果が船舶の生体直交反応で示され、固定化された低分子の能力を維持するか、または2つの官能化ナノ粒子がFK BP 12ターゲットと相互作用する能力を維持し、このアプローチがSPRのアプリケーションの範囲をどのように拡大できるかを示します。

このオンチップキャプチャサイクルエディション技術の主な利点は、配向とI動員密度を制御しながら、低分子の迅速な可逆化と動員を可能にすることです。典型的には、キャプチャサイクル編集プロセスは、手順を実証し、大幅に表面処理時間を短縮し、数分以内に実行することができ、ジェイソンサンドラー、私たちの研究室からの学生になります この手順を開始するには、DMSO中の50ミリモルT-C-O-N-H-S溶液の8マイクロリットルからPBS中の1ミリグラムあたり1ミリグラムのGST溶液の100マイクロリットルまで。室温で1時間振とうした後、Zebaスピン脱塩カラムを用いて余分な試薬を除去します。

次に、DMF中の25ミリモルテトラNHSエステル溶液6マイクロリットルを、PBS中のGSTの1ミリリットルあたり1ミリグラム溶液の75マイクロリットルに加え、1時間後に室温で混合物を振とうします。反応混合物を25マイクロリットルのPBSで希釈し、スピン脱塩カラムを使用して精製します。次に、50ミリモルのT-C-O-N-H-S溶液100マイクロリットルを放出ナノ粒子溶液150マイクロリットルに加え、前と同じように混合物を振とうします。

混合後、NAP 10カラムを用いたゲルろ過により余分な試薬を除去します。PBSバッファで言及されています。NPTCO製品を含む色付きのバンドを収集します。

精製したサンプルを、分子量カットオフが100, 000の遠心フィルター装置を含む遠心分離管に移します。次に、遠心分離後、サンプルを約150マイクロリットルの最終容量に濃縮します。DMSO中の50マイクロリットルの0.1モルの無水物皮肉溶液をNPT-C-O溶液に加えます。

混合物を室温で 1 時間振とうした後、共鳴装置の表面プラズマを使用して PBS で逃がす NAP 10 カラムを使用して N-P-T-C-O 製品を精製し、AM 固定化ウィザードテンプレートでフローセル 1 と 2 に固定化を選択します。0.4 mol EDC と 0.1 mol NHS の 1 対 1 の溶液を 480 秒間注入することにより、表面のカルボン酸基を活性化するように Amin 法を変更します。毎分10マイクロリットルの流量で、エタノールアミンの注入を設定して、残りの活性化エステルを急冷し、毎分10マイクロリットルの流量で422回目の接触時間に設定します。

リガンド名anti GSTを入力し、毎分10マイクロリットルの流量で420秒の接触時間で注入するように設定します。次に、前に調製した溶液バイアルを試薬ラック2に置きます。ファイル名とデータの保存先を割り当てた後、位置がコンテンツリストと一致していることを確認してください。

固定化を開始します。固定化ウィザードを編集して、GSTリガンド溶液の1ミリリットルあたり20マイクログラムのみを、参照フローセル1に対して毎分5マイクロリットルで420秒間注入します。G-S-T-T-T-C-O-Aをあらかじめ調製した10マイクロモルのTERRAZオレイン溶液と再生溶液が入ったバイアルを試薬ラック2に置きます。

手動実行方法を選択し、流量を毎分5マイクロリットルに設定し、フローパスをフローセル2に設定します。G-S-T-T-C-O溶液を420秒間注入し、続いてテラズベンツラミン溶液を600秒間注入します。これに続いて、再生溶液の2回の32回目の注入で表面を再生します。

GST TERAZのzine、N-P-T-C-O、teraz Belamineおよびregeneration solution vialsを試薬ラック2に置いた後、装置の手動実行方法を選択し、流量を毎分5マイクロリットルに設定し、フローパスをフローセル2に設定します。GST Tetra zine の溶液を 60 秒間注入し、続いて N-P-T-C-O の溶液を 60 秒間注入します。最後に、テトラスジンベラミンの溶液を60秒間注入します。

終了したら、以前と同じ方法でサーフェスを再生成します。次に、新しい方法を選択し、データ収集、速度検出、サンプルコンパートメント、温度、濃度単位、バッファー設定などの一般的なパラメーターを入力します。assay steps パネルで、新しいステップを作成し、sample という名前を付けます。

次に、サイクルタイプパネルで目的と接続ベースの設定をサンプルに設定し、新しいサイクルステップを作成して、次のコマンドを挿入します。サンプル再生1と再生2をキャプチャします。キャプチャーコマンドを選択し、リガンドとしてG-S-T-T-C-Oを入力します。

接触時間を120秒、流量を毎分5マイクロリットルと指定します。そして、流路をセカンドに設定します。次に、サンプルコマンドを選択し、182番目の接触時間、62番目の解離時間、毎分30マイクロリットルの流量を入力し、流路を両方に設定します。

この後、regeneration oneコマンドを選択し、再生ソリューションを入力します。毎分30マイクロリットルで32回目の接触時間を指定し、流路を秒に設定します。再生についても同じ手順を繰り返します。

2 つのコマンドで set、run、および flow path を two dash 1 に設定します。[次へ] を選択し、サンプルリストにテトラ Belamine 分析種溶液と 1.5 〜 20 マイクロモルの濃度シリーズを 1 〜 2 希釈で充填します。次に、ラック位置パネルの横を選択します。

溶液バイアルを試薬ラック2にセットした後、希釈シリーズを置きます。96ウェルプレート入り。位置がコンテンツリストと一致していることを確認してください。

メソッドテンプレートを保存し、結合アッセイを開始します。たとえば、新しいメソッドと一般的なパラメーターを選択したら、アッセイステップパネルでキャプチャサンプルと再生ステップを作成し、名前を付けます。これに続いて、対応する目的を選択し、ベース設定を接続します。

次に、サイクルタイプパネルを選択し、3つのサイクルステップを作成します。キャプチャ、サンプリング、再生。キャプチャ サイクルの下に capture コマンドを 2 回挿入します。

Capture Oneパネルにステップインします。キャプチャ ソリューションを変数として選択します。次に、毎分5マイクロリットルの流量で接触時間を300秒に設定し、キャプチャ2パネルで流路を2番目に設定します。

キャプチャ ソリューションを変数として選択します。毎分5マイクロリットルの流量で接触時間を250秒に設定し、流路を秒に設定します。次に、サンプル・サイクル・ステップの下にサンプル・コマンドを挿入します。

サンプルパネルを選択し、接触時間を60秒に設定します。解離時間は毎分30マイクロリットルの流量で200秒にし、流路を両方に設定します。再生サイクルステップの下に再生コマンドを2回挿入し、再生1つのパネルを選択して、再生ソリューションを入力します。

毎分30マイクロリットルで30秒の接触時間を指定し、流路を秒に設定します。再生についても同じ手順を繰り返します。2つのパネル選択、セットアップ、実行し、流路を2ダッシュ1つ選択次へに設定し、G-S-T-T-C-OとテラズAP1、497コンジュゲートをキャプチャソリューション名としてFKBP 12をサンプル名として、1.5〜96ナノモルを1〜2希釈で濃度シリーズとして設定します。

溶液バイアルを試薬ラック2に、希釈シリーズを96ウェルプレートに入れた後、メソッドテンプレートを保存し、結合アッセイを開始します。生物活性小分子の効率的な可逆的固定化と配向と密度の制御は、新しいバイオセンサーアプリケーションの開発において重要な役割を果たします。ここに示されているのは、テラズジンベンゾインの固定化のリアルタイムモニタリングです。

G-S-T-T-C-Oの溶液を事前に固定化されたアンチGST表面に注入すると、約400 R RUの上昇が得られます。これに対して、Teraz zine「Benzo Lamine」を2回目に注射すると、応答が15RUと急速に上昇します。ランニングバッファーに切り替えた後、dert抗原の解離は観察されず、構造の安定性の証拠を提供しました。

サーフェスは、サイクルの最後のステップで再生成され、複数のキャプチャサイクロエディションサイクルが可能になりました。この手順を使用して、テトラジン、ベンジルラミン部分をテラズジンAP1、497コンジュゲートに置き換えると、生理活性表面が生成され、ターゲットとの相互作用研究に使用されます。FK BP 12による抗体抗原相互作用の破壊により、抗GST表面が再生され、新たな分子集合体の構築が可能になります。

この場合、GST TERAZジン注入に続いてN-P-T-C-O注入を行い、ナノ粒子をセンサー表面に効果的に固定化します。ナノ粒子上の未反応のTCO基は、テラズジンベンゾラミンを注入したシクロ版に利用できます。あるいは、TET INE AP 1,497コンジュゲートを使用して、官能基化ナノ粒子FK BP 12の相互作用をモニターします。

多成分構造の解離は観察されず、構造の安定性と生物活性の証拠を提供し、リアルタイムの固定化反応モニタリングと表面再生の能力を備えています。関連付け率KAの簡単な特性評価は、ここに示すように達成されます。反応速度論の知識は、固定化密度を制御するためのガイドラインと、バイオセンサーアッセイの重要なパラメーターを提供します。

G-S-T-T-C-OまたはGSTテラズジン表面上にテラズベラミンまたはN-P-T-C-Oの濃度をそれぞれ重複して注入すると、結合データが生成されます。同じ表面上の同じ濃度の 2 つの逐次分析種サンプルの結合データは、抗体結合容量の損失が最小限に抑えられていることを反映して、ほぼ超インポーザブルです。キャプチャサイクロエディションと再生の複数のサイクルにより、評価ソフトウェアはサイクロエディションの反応速度に最適な速度論的解析を提供します。

私たちは、抗体抗原捕捉とテラズジンとトランスサイクリンの間の迅速で特異性の高いシクロエディション反応を利用するアプローチを開発し、低分子の迅速な可逆的固定化を可能にしました。SPRチップベースの研究では、キャプチャサイクルエディション法では、低分子リガンドの濃度が10マイクロモル未満で短い接触時間が必要です。このビデオを見れば、キャプチャサイクロエディション法を使用してセンサー表面に小分子や多成分構造を固定化する方法についてよく理解できるはずです。

これを達成するためには、標識反応に良質の試薬を使用し、SPR装置でアッセイパラメータを適切に設定することが重要です。