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我々は、NIHから（NHLBI契約番号HHSN268201000044C RW、SHおよびSYSに）資金を認めている。

1。 GSTおよびナノ粒子（NP）複合体の調製<ol><li> GST-TCOの調製： <ol><li> GST（PBS中1 mg / ml）を100μlにTCO-NHS溶液8μL（DMSO中50 mm）を追加し、室温で1時間混合物を振る。 </li><li>のZebaスピン脱塩カラムを使用して過剰の試薬を除去。 GST-TCOコンジュゲートを含有するろ液を回収し、使用前に4℃で保存する。 </li></ol></li><li> GST-TZの準備： <ol><li> GST（PBS中1 mg / ml）を75μlにTZ-NHS溶液6μL（DMF中25 mm）を追加し、室温で1時間混合物を振る。 </li><li> PBS25μlの反応混合物を希釈し、スピン脱塩カラムを用いて精製する。 GST-Tzのコンジュゲートを含有する濾液を、使用前に4℃で保存する。 </li></ol> 注：質量分析（MALDI-TOF）は、平均して約10 Tzのか、TCO分子は、GSTに結合させたことを示した。 </li><li> NP-TCOの調製： <ol><li> TCO-NHS溶液を100μl（DMSO中50 mM）をを追加アミノ化ナノ粒子を150μl（NP-NH 2、8.7mgの鉄/ PBS溶液で、3nmの鉄心〜8,000のFe / NP）と室温で1時間、混合物を振る。 </li><li> PBS緩衝液で溶出したNAP-10カラムを用いたゲル濾過によって過剰の試薬を除去する。 NP-TCOの生成物を含む色のバンドを収集します。 </li><li>遠心フィルター装置（100 K MWCO）を使用して〜150μlの最終容量をろ液を濃縮する。 </li><li> （無水物末端カルボン酸を形成するために、残りのアミンと反応し、これはデキストラン表面に非特異的な相互作用を防止する）、NP-TCO溶液（DMSO中0.1M）、無水コハク酸を50μlを加え、室温で1時間振とうする。 </li><li> PBSで溶出NAP-10カラムを用いてNP-TCO生成物を精製する。使用前に4℃でのNP-TCOの溶液を保管してください。 </li></ol></li></ol> 2。表面処理すべての表面プラズモン共鳴アッセイにおいてバイアコアT100計器（GE Healthcare）で実行される25°C、特に断りのない限り、ランニングバッファーとしてCM5センサーチップおよびPBS-Pを使用して。ビアコア制御および測定器に供給される評価ソフトウェアは、実験を設定し、データを分析するために使用される。二つの動作モード、アプリケーションウィザードと手動運転を表面処理し、監視、オンチップキャプチャ環のために使用されます。方法ビルダーモードは逆方向結合実験のセットアップおよび環化反応速度を測定するために使用される。データは、二重参照を差し引いおよび動力学分析は、1:1ラングミュア結合モデルを使用して実行されている。 <ol><li>フローセル上のアミン固定化ウィザードテンプレートを選択し、固定化1（参考）と2（検出）を使用します。 0.4 M EDCの1:1溶液を注入することにより、表面カルボキシル基を活性化アミンメソッドを修正する：480秒、0.1 M NHSを10μL/分の流速で。で420秒の接触時間に残りの活性化エステルをクエンチエタノールアミンの注入を設定するを10μl/分の流速。 </li><li>入力リガンド名、抗GST（酢酸緩衝液、pH5.0中の18μgの個​​/ ml）し、10μl/分の流速で420秒の接触時間のために注入するように設定。 </li><li>コンテンツリストとの位置を合わせるように注意しながら2試薬ラックに必要なソリューションバイアルを置きます。保存して、固定化を開始します。 注：〜14,000〜17,000 RUの範囲内の抗GST固定化レベルのこのよう結果に固定化ウィザードの実行。 </li><li>のみ参照フローセル1を介して5μL/分で420秒間（20μg/ ml）をソリューションを、GSTリガンドを注入するために固定化ウィザードを編集します。 </li></ol> 3。官能基化分子のオンチップキャプチャ環を監視<ol><li>オンチップリアルタイムでキャプチャ-環（ 図2）の監視。 <ol><li> GST-TCO（20μg/ ml）を、TZ-BnNH 2（10μM）と再生（10 mMグリシン、pH値= 2.0）試薬ラック2内の溶液バイアルを置きます。男を選択UALの実行方法は、5μlの/分に流量を設定し、セル2フローのパスを流れる。 </li><li> 420秒間、GST-TCOの溶液を注入する。 </li><li> 600秒間TZ-BnNH 2の溶液を注入する。 </li><li>再生溶液の2 30秒の注射で表面を再生。 </li></ol></li><li>リアルタイム（ 図3）の多成分構造のオンチップ·アセンブリを監視する。 <ol><li>場所GST-Tzを（20μg/ ml）を、NP-TCO（100μgの鉄/ ml）を、TZ-BnNH 2（10μM）および再生（10mMグリシン液、pH = 2.0）溶液バイアル試薬ラック2。測定器の取扱説明書の実行方法を選択し、セル2のフローに5μL/分の流路に流量を設定。 </li><li> 60秒間、GST-TZの溶液を注入する。 </li><li> 60秒間のNP-TCOの溶液を注入する。 </li><li> 60秒間TZ-BnNH 2の溶液を注入する。 </li><li>再生溶液の2 30秒の注射で表面を再生。 </li></ol></li></ol> 4。 M環化率の固定化密度と決意をonitoring <ol><li>小分子の付加環化反応速度の特徴付け（ 図4）。 <ol><li>新しい手法や入力一般的なパラメータを選択します。アッセイ工程パネルで新たな一歩と名前のサンプルを作成します。目的を設定し、サンプルするために基本設定を接続します。 </li><li>サイクルタイプパネルで新しいサイクルステップを作成し、次のコマンドを挿入して、キャプチャ、サンプル、再生1及び再生2。 </li><li> captureコマンドを選択すると、入力リガンド名（GST-TCO、20μg/ ml）を、5〜10μL/分と設定された流路での接触時間120秒：秒。サンプルコマンドを選択し、入力180秒の接触時間、60秒の解離時間、30μL/分の流速とに設定された流路：両方。再生1コマンドを選択し、入力された再生溶液名（10 mMのグリシン-HCl pHは2.0）、30μL/分に設定された流路で30秒の接触時間：セカンド。再生2コマンドのために同じことを繰り返します。&lt;/李&gt; <li> 2-1：に設定して実行し、設定された流路を選択します。次の選択し、検体溶液（TZ-BnNH 2）および一連の濃度（0.3〜μM、1:2希釈）でサンプルリストを埋める。ポジションパネルをラックに横に選択します。 96ウェルプレート内の試薬ラック2と希釈系列に置き液バイアルは、コンテンツリストとの位置を合わせるように注意しながら。メソッドテンプレートを保存し、結合アッセイを開始します。データバインディングおよび動力学的分析は、 図4に示されている。 </li></ol></li><li> NP付加環化反応速度の特徴付け（ 図4）。 <ol><li>上から保存されたメソッドのテンプレートを開き、次のパラメータを変更してください。キャプチャパネルを選択します。GST-TZ、20μg/ mlのへの変更リガンド名。サンプルパネルを選択し、120秒〜120秒の接触時間および解離時間への変更の接触時間を。 </li><li>サンプルリストを選択します。NP-TCOに変更検体および濃度シリーズ（7から224 nMで、1:2希釈）。試薬ラックに固定液バイアル2およびコンテンツリストとの位置を合わせるように注意しながら、96ウェルプレート内の希釈系列。メソッドテンプレートを保存し、結合アッセイを開始します。データバインディングおよび動力学的分析は、 図4に示されている。 </li></ol></li></ol> 5。固定化されたAP1497へのFKBP12の結合を測定する逆向きの結合研究は、固定化リガンドとして検体および化合物のAP1497（ 図5）のようなFKBP12を採用している。次のようにこのアッセイのための一般的な方法は、メソッドBuilderツールを使用して設定されます。 <ol><li>新しい手法や入力一般的なパラメータを選択します。アッセイ工程パネルで作成し、名前キャプチャ、サンプルおよび再生の手順。対応する目的を選択して、基本設定を接続します。 </li><li>サイクルタイプのパネルを選択し、3サイクル工程作成：キャプチャ、サンプルおよび再生を。 </li><li>キャプチャサイクルのステップの下二回captureコマンドを挿入します。ヴァリアブルとしてキャプチャ1のパネルを選択し、キャプチャソリューションを選択第二：電子、5μlの/分に設定した流路の流量で300秒の接触時間を設定する。第二：5〜10μL/分と設定された流路の流量で250秒の接触時間を設定する変数としてキャプチャ2のパネルを選択捕捉溶液を選択する。 </li><li>サンプルサイクルステップ下でのサンプルコマンドを挿入します。サンプルパネルを選択し、30μL/分に設定された流路の流速で200秒〜60秒とし、接触時間を、解離時間：両方。 </li><li>再生サイクルのステップの下二回生指令を挿入します。再生1パネルを選択し、入力された再生溶液名（10 mMのグリシン-HCl pHは2.0）、30μL/分に設定された流路で30秒の接触時間：セカンド。再生2パネルのために同じことを繰り返します。 </li><li> 2-1：に設定して実行し、設定された流路を選択します。次の入力キャプチャソリューション名（GST-TCOおよびAP1497-TZ）、サンプル名（FKBP12）、一連の濃度（0.020から5μg/ mlの1:2希釈）とMW（13000）を選択します。 R溶液バイアルを置きますコンテンツリストとの位置を合わせるように注意しながら96ウェルプレートに2および希釈シリーズラックeagent。メソッドテンプレートを保存し、結合アッセイを開始します。動力学的分析データを図5に示す。 </li></ol> 6。固定化のNPに添付AP1497にFKBP12の結合を測定するナノ粒子固定化、低分子誘導体化およびFKBP12結合アッセイのための一般的な方法は、セットアップされている方法Builderツールを使用して次のように<ol><li>上から保存されたメソッドのテンプレートを開き、変更します。キャプチャサイクルステップの下に追加のcaptureコマンドを挿入します。キャプチャ1のパネルを選択します。変数と名前のキャプチャソリューション1（GST-TZ）としてキャプチャソリューションの選択を解除します。 5μl/分の流速および第二のセットの流路で60秒に設定された接触時間。キャプチャ2のパネルを選択します。変数と名前のキャプチャソリューション2（NP-TCO）などのキャプチャソリューションの選択を解除します。設定された接触時間を5μl/分の流速で90秒、及び第二のセットの流路。キャプチャ3のパネルを選択します。変数と名前のキャプチャソリューション3（AP1497-TZ）としてキャプチャソリューションの選択を解除します。 5μl/分の流速および第二のセットの流路180秒に設定された接触時間。 </li><li> 2-1：に設定して実行し、設定された流路を選択します。二度横に選択します。 96ウェルプレート内の試薬ラック2と希釈系列に置き液バイアルは、コンテンツリストとの位置を合わせるように注意しながら。メソッドテンプレートを保存し、結合アッセイを開始します。動力学的分析データを図5に示す。 </li></ol>

<ol><li>Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+pretargeted+labeling+of+cancer+cells+through+a+tetrazine%2Ftrans-cyclooctene+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).</li>
<li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+trans-cyclooctenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes.</a> J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).</li>
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<li>Arkin, M. R., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions%3A+progressing+towards+the+dream%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).</li>
<li>Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+based+assay+for+the+detection+and+characterization+of+promiscuous+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors.</a> J Med Chem. 51, 574-580 (2008).</li>
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<li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biacore+Sensor+Surface+Handbook+BR-1005-71%22">Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71</a>. , Edition AB, (2005).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここで説明するキャプチャ付加環化の方法は、ラベルフリーチップベースの相互作用および動力学的研究のための修飾ナノ粒子および小分子を迅速に、可逆的な固定化を可能にします。固定化プロトコルは、&lt;小分子リガンドの10μMの濃度を必要数分で行うことができる。リガンド濃度と接触時間の固定化密度を調節することにより厳密に制御することができる。我々のデータは、オンチップバイオ直交反応がそれらの標的と相互作用するその場での官能化ナノ粒子又は固定化された小分子の能力を維持することを示している。また、低分子量の2小分子、（TCOとTzの）間の二分子付加環化率を特徴としている。我々は、類似のアッセイは、他の高速なバイオ直交反応の速度を測定し、比較するために行うことができることを想定する。 可逆、連続した流れのオンチップナノ粒子の固定化とその場で官能化PRovidesすべての精製、固定化およびスクリーニングのための別の手順が必要です従来のナノ粒子の合成と比較すると、同様の実験。13〜15でのスクリーニングとの相互作用解析のための修飾ナノ粒子の様々への迅速なアクセ...

効率的な結合反応は、バイオテクノロジーの様々なアプリケーションのために表面に生物活性分子を付着させるための貴重なツールです。最近では、非常に高速なバイオ直交トランスシクロオクテン（TCO）および1,2,4,5 -テトラジン（Tzの）間の[4 +2]環化反応は、細胞表面、細胞内構造、抗体およびナノ粒子を標識するために使用されてきた1。 - 7ここでは、表面プラズモン共鳴（SPR）相互作用分析のための多成分構造の可逆オンチップ合成のために、抗原/抗体捕捉（GST /抗GST）との組み合わせで、[4 +2]付加環化反応を使用してモニターリアルタイムでのプロセス（ 図1）。8,9特に、キャプチャ付加環化戦略が確立されたプロトコルを使用して表面の再生を可能にします。8結果として、新たなアッセイの様々なリガンドの向きや密度を制御して安定したセンサ面の集合体フォーマットが可能になりました。使い方この戦略は、我々は、TCO / TZ-誘導体化小分子の固定化を実証し、バッファの様々な条件で環化率を特徴づける。我々は、直接、固定化GST抗原に結合した場合、キャプチャ·環戦略がその標的と相互作用する低分子の能力を保持していることを確認するために、一例として、FKBP12 10-12結合しFKBP12分子AP1497の間のよく知られた相互作用を選びましたまたは固定化ナノ粒子（NPS）へ。 この方法は、いくつかの利点があります。まず、セ​​ンサーチップ上の小分子の可逆的な固定化が可能になりました。第二に、低分子のTCO / Tzの固定化にも標準的なSPRの研究の方向を逆転させるラベルフリー相互作用の研究を可能にし、結合相互作用の補完的なビューを提供することがあります。第三に、この方法は、標的化ナノ粒子のマイクロ流体合成、およびそれらのバインディンの即時評価を可能G特性。これは、標的化ナノ粒子の評価又はスクリーニングの効率を向上させ、また必要なナノ粒子の量を減少させることを約束する。13-15第四に、このアプローチは、連続流の下でリアルタイムにバイオ直交付加環化反応の反応速度を測定することができる。最後に、TCO / Tzの固定化化学は、血清の存在下でロバストである。一緒になって、我々は、この汎用性の高いアプローチが広くin vitroおよびin vivoの携帯アプリケーションでの関連性のマイクロ流体研究の多種多様な安定したセンサ面の構築を容易にすることを期待しています。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>センサーチップCM5</td><td>GEヘルスケア</td><td>BR-1005-30</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>アミンカップリングキット</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1000-50</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GSTキャプチャキット</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1002-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NAP-10カラム</td><td>GEヘルスケア</td><td>17-0854-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GST、1X PBS</td><td>Genscript</td><td>Z02039</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>rhFKBP12</td><td>R& で凍結乾燥Dシステムズ</td><td>3777-FK</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>界面活性剤 P-20</td><td>GE ヘルスケア</td><td>BR-1000-54</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>グリシン 2.0</td><td>GE ヘルスケア</td><td>BR-1003-55</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zebaスピン脱塩カラム</td><td>Thermo</td><td>89882</td><td>7 K MWCO</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4</td><td>Fisher</td><td>UFC810096</td><td>100 K 遠心フィルター</td></tr><tr><td>TCO-OH</td><td>Ref.8</td><td></td> 自社<td>合成</td></tr><tr><td>TCO-NHS</td><td>Ref.8</td><td></td><td>自社合成 ※Click Chemistry Tools #1016-25</td></tr><tr><td>Tz-BnNH2</td><td>Ref.8</td><td></td>より販売<td>自社合成</td></tr><tr><td>Tz-NHS</td><td>Ref.8</td><td>764701</td><td>自社合成 ※シグマアルドリッチ社より市販 #764701</td></tr><tr><td>NP-NH2 = CLIO-NH2</td><td>Ref.8</td><td></td><td>自社合成</td></tr><tr><td>AP1497, AP1497-Tz</td><td>Ref.8</td><td></td> 自社<td>合成</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</strong</td></tr><tr><td>>SPR バイオセンサー</td><td>GEヘルスケア</td><td>Biacore T100</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

可逆小分子またはバイオセンサー応用のためのマルチコンポーネント構造を固定化するために、マイクロ流体オンチップキャプチャ - 環化反応

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

配向および固定化密度を制御有する生物活性小分子の迅速な表面固定化のための方法は、バイオセンサー、マイクロアレイの用途に非常に望ましい。本研究では、TCO / TZ-誘導体化分子のマイクロ流体の固定化を可能にするために非常に効率的な共有結合性バイオ直交トランスシクロオクテン（TCO）の間[4 +2]環化反応および1,2,4,5 -テトラジン（Tzの）を使用する。我々は、表面プラズモン共鳴（SPR）を用いて連続流条件下で、リアルタイムでプロセスを監視する。可逆的な固定化を可能にし、センサ表面の実験範囲を拡張するために、我々は、付加環化反応と非共有結合抗原 - 抗体捕捉成分を結合する。交互にセンサ表面にTCOまたはTzの部分を提示することによって、複数の捕獲 - 環化のプロセスは、多成分構造体の様々なオンチップ·アセンブリとの相互作用の研究のために一つのセンサー表面上に今や可能である。私たちは、私バイオセンサーチップ上に2つの異なる固定化実験で、この方法をllustrate、小分子、FK506結合タンパク質12（FKBP12）に結合AP1497と同じ低分子固定化され、 その場官能化ナノ粒子中の一部として。

データおよび図は、参照8から適応されている。 向きや密度の制御付きの生理活性小分子の効率的な可逆的な固定化は、新しいバイオセンサーのアプリケーションの開発に重要な役割を果たしている。 TCOとTzの間の高速バイオ直交反応を用いて、我々は、生物学的活性を保持したリガンド面の段階的な組み立ておよび再生のための方法を記載している。 図2は、-TzをBnNH 2の固定化のリアルタイムモニタリングを示す。 GST-TCOの溶液応答して〜400 RUの上昇をもたらすプレ固定された抗GST表面上に注入される。 TZ-BnNH 2回目の注射は、応答の高速〜15 RUの上昇を示しています。誘導体化された抗原のいかなる解離は、構造安定性のための証拠を提供するランニングバッファーに切り替えた後に観察されない。表面は、複数のキャプチャ·環サイクルを可能にするために、サイクルの最後のステップで再生されている。私達この手順をINGとAP1497-TZ分子とTZ-BnNH 2部分を交換すると、そのターゲットFKB...

我々は、順次、オンチップバイオ直交環化学と抗体抗原取り込みを使用して、低分子の急速な可逆固定化および表面プラズモン共鳴（SPR）の研究のための官能化ナノ粒子集合体のための手法を提案する。

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

本実験の全体的な目的は、センサーチップの表面に低分子化合物および機能化ナノ粒子を可逆的に固定化するための、迅速かつ汎用性の高い戦略を実証することである。これは、まずセンサー表面に抗GST抗体を固定化し、次にGST抗原をキャプチャーすることによって達成される。trans-シクロオクチンまたはテトラジン基で機能化することで、低分子テトラジン誘導体や、さらに低分子テトラジン誘導体で機能化されたナノ粒子trans-シクロオクタン共役体とのその後の環化付加反応のための反応性表面が得られます。次に、この機能化された表面を用いて、目的の可溶化ターゲットとの相互作用解析を行うことができます。最後のステップで表面を再生させることにより、その後のキャプチャ環化付加サイクルの実施が可能になります。チップ上のバイオ直交反応による結合結果は、固定化された低分子またはその場で機能化されたナノ粒子がFKBP12ターゲットと相互作用する能力を保持していることを示しており、このアプローチがSPRの応用範囲をどのように拡大できるかを例証しています。このオンチップ・キャプチャー・サイクル・エディション技術の主な利点は、配向と固定密度を制御しながら、小分子の迅速な可逆的固定および動員を可能にすることです。通常、キャプチャー・サイクル・エディションのプロセスは数分以内に完了し、表面調製時間を大幅に短縮できます。本手順の実演は、当研究室の学生であるJason Sandlerが行います。まず、50 mMのTCONHS DMSO溶液 8 µLを、PBS中の1 mg/mL GST溶液 100 µLに加えます。室温で1時間振盪させた後、Zebaスピン脱塩カラムを用いて過剰な試薬を除去します。次に、25 millimolarのtetra NHS EsterのDMF溶液6 µLを、1 mg/mLのGSTのPBS溶液75 µLに加え、室温で1時間後に混合物を振とうします。反応混合物を25 µLのPBSで希釈し、スピン脱塩カラムを用いて精製します。その後、50 millimolarのT-C-O-N-H-S溶液100 µLを、エマネートナノ粒子溶液150 µLに加え、前述と同様の方法で混合物を振とうします。混合後、NAP 10カラムを用いたゲルろ過により過剰な試薬を除去します。この際、PBSバッファーで溶出させます。N-P-T-C-O生成物を含む有色バンドを回収してください。精製したサンプルを、分画分子量100,000の遠心フィルターデバイスが入った遠心チューブに移します。次に、遠心分離を行い、サンプルを最終容量約150 µLまで濃縮します。N-P-T-C-O溶液に、DMSOで調製した0.1 Mのシアニック酸無水物溶液を50 µL加えます。混合物を室温で1時間振とうした後、NAP 10カラムを用い、PBSで溶出してN-P-T-C-O産物を精製します。表面プラズモン共鳴（SPR）装置を用い、AM固定化ウィザードテンプレートでフローセル1および2への固定化を選択します。Amin法を変更し、0.4 molar EDCと0.1 molar NHSの1:1溶液を480秒間注入して、表面のカルボキシル基を活性化させます。流速10 microliters per minuteで、残りの活性エステルをクエンチするためのエタノールアミンの注入を、接触時間422秒、流速10 microliters per minuteに設定します。リガンド名に anti GST と入力し、接触時間 420 seconds、流速 10 microliters per minute で注入するように設定します。次に、あらかじめ調製した溶液バイアルを試薬ラック2に配置します。ファイル名とデータの保存先を指定した後、配置場所がコンテンツリストと一致していることを確認してください。固定化を開始します。固定化ウィザードを編集し、リファレンスフローセル1に対し、GSTリガンド溶液を20 micrograms per milliliterの濃度で、5 microliters per minuteの流速で420秒間注入するように設定します。あらかじめ調製した10 micromolarのTERAZ olaine溶液を含むG-S-T-T-C-O-Aのバイアルと、再生溶液を試薬ラック2にセットします。マニュアルラン法を選択し、流速を5 µL/minに、流路をフローセル2に設定します。G-S-T-T-C-O溶液を420秒間注入し、続いてTeraz Benz Lamine溶液を600秒間注入します。その後、再生溶液を32秒間、2回注入して表面を再生させます。GST TERAZ zine、N-P-T-C-O、teraz Belamine、および再生溶液のバイアルを試薬ラック2にセットし、装置のマニュアルランメソッドを選択して、流量を5 µL/minに、流路をフローセル2に設定します。GST Tetra zine溶液を60秒間注入し、続いてN-P-T-C-O溶液を60秒間注入します。最後に、tetras zine belamine溶液を60秒間注入します。完了後、前と同様の手順で表面を再生します。次に、新しいメソッドを選択し、データ収集、速度検出、サンプルコンパートメント、温度、濃度単位、およびバッファー設定を含む一般パラメータを入力します。アッセイステップパネルで新しいステップを作成し、「sample」と名前を付けます。次に、サイクルタイプパネルで目的とコネクトベースの設定をサンプルに設定し、新しいサイクルステップを作成して、以下のコマンドを挿入します。Capture、sample regeneration one、およびregeneration twoをキャプチャします。Captureコマンドを選択し、リガンドとしてG-S-T-T-C-Oを入力します。接触時間を120 seconds、流速を5 µL/minに設定します。次に、流路をsecondに設定してください。その後、サンプルコマンドを選択し、接触時間を182 seconds、解離時間を62 seconds、流速を30 µL/minに入力し、流路をbothに設定します。その後、再生コマンドを選択し、再生溶液を入力します。接触時間を32分、流速を30 µL/minに設定し、フローパスを2番目に設定します。再生について同様の手順を繰り返します。コマンドの「select set」を選択し、「run」を実行し、フローパスを「two dash one」に設定します。「next」を選択し、テトラベラミン分析物溶液と1.5から20 µMの濃度系列（1対2希釈）でサンプルリストを記入します。その後、「next」を選択してラックポジションパネルに移動します。溶液バイアルを試薬ラック2にセットした後、希釈系列を96ウェルプレートに配置します。その際、内容リストと位置が一致していることを確認してください。メソッドテンプレートを保存し、結合アッセイを開始します。新しいメソッドと一般パラメータを選択したら、アッセイステップパネルでキャプチャサンプルと再生ステップを作成し、名前を付けます。その後、対応する目的とベース設定を選択して接続します。次に、サイクルタイプパネルを選択し、「Capture」、「Sample」、「Regeneration」の3つのサイクルステップを作成します。Captureサイクルの下に、Captureコマンドを2回挿入します。キャプチャー1パネルのステップに進みます。変数としてキャプチャー溶液を選択してください。次に、流量を 5 µL/min に、接触時間を 300 seconds に設定し、キャプチャー2パネルで流路を「second」に設定します。キャプチャー溶液を変数として選択します。接触時間を250秒、流速を5 µL/minに設定し、流路を「second」に設定します。次に、サンプルサイクルステップの下にサンプルコマンドを挿入します。サンプルパネルを選択し、コンタクト時間を60秒に設定します。解離時間を200秒、流速を30 µL/minに設定し、フローパスを「both」に設定します。リジェネレーションサイクルのステップにリジェネレーションコマンドを2回挿入し、リジェネレーションパネル1を選択して、リジェネレーション溶液を入力します。接触時間を30秒、流速を30 µL/minに設定し、フローパスをsecondに設定します。再生（regeneration）についても同様の手順を繰り返します。2パネル選択セットアップを行い、実行してフローパスをtwo dash oneに設定し、nextを選択してG-S-T-T-C-Oおよびteraz AP 1, 497 conjugateをキャプチャー溶液名として入力し、FKBP 12をサンプル名として、1.5から96 nMの1:2希釈系列を濃度系列として入力します。溶液バイアルを試薬ラック2に、希釈系列を96ウェルプレートに配置した後、メソッドテンプレートを保存し、結合アッセイを開始します。配向と密度を制御した生物活性低分子の高効率で可逆的な固定化は、新しいバイオセンサアプリケーションの開発において重要な役割を果たします。ここでは、teraz zine Benzoin固定化のリアルタイムモニタリングを示します。G-S-T-T-C-O溶液を事前に固定化したanti GST表面に注入すると、約400 RUの上昇が認められます。これに対し、Teraz zine Benzo Lamineを2回目に注入すると、反応として15 RUの急速な上昇が見られます。ランニングバッファーに切り替えた後、dert抗原の解離は観察されず、構造の安定性が示されました。サイクルを複数回繰り返してキャプチャーすることを可能にするため、サイクルの最終ステップで表面の再生が行われました。この手順を用い、テトラジン・ベンジルアミン部位をテトラジン AP 1, 497 コンジュゲートに置き換えることで生物活性表面が生成され、これが標的との相互作用研究に使用されます。FK BP 12 による抗体抗原相互作用の解消によって anti GST 表面が再生され、新たな分子アセンブリの構築が可能になります。このケースでは、GST TERAZ zineを注入した後、N-P-T-C-Oを注入することで、ナノ粒子をセンサー表面に効果的に固定化します。ナノ粒子上の未反応のTCO基は、注入されたteraz zine benzo lamineとの環化付加反応に利用可能です。あるいは、機能化されたナノ粒子とFK BP 12の相互作用をモニタリングするために、TET INE AP 1, 497共役体が使用されます。多成分構造の解離は観察されず、構造の安定性と生物活性が裏付けられました。これにより、リアルタイムでの固定化反応のモニタリングおよび表面の再生が可能となります。ここでは、結合速度定数 KA の簡便なキャラクタリゼーション方法を示します。反応速度論に関する知見は、固定化密度の制御のための指針となり、バイオセンサーアッセイにおける重要なパラメータとなります。teraz BELAMINEまたはN-P-T-C-Oを、それぞれG-S-T-T-C-OまたはGST teraz zine表面に濃度を上げて2連で注入し、結合データを取得します。同一表面における同一濃度の2つの連続した分析物サンプルの結合データはほぼ完全に重なり、抗体の結合能の損失が最小限であることを示しています。キャプチャー、cyclo edition、および再生の複数サイクルが行われるため、評価ソフトウェアによってcyclo edition反応速度の最適なフィッティングによる速度論的解析が行われます。私たちは、抗体による抗原キャプチャーと、テトラジンとトランスシクリンとの間の高速かつ特異性の高いサイクロ付加反応を組み合わせることで、低分子化合物の迅速かつ可逆的な固定化を可能にする手法を開発しました。SPRチップを用いた研究において、このキャプチャー・サイクロ付加法は、10 µM 未満の濃度の低分子リガンドを用いて短時間の接触時間で実施可能です。このビデオを視聴することで、キャプチャー・サイクロ付加法を用いてセンサー表面に低分子化合物や多成分構造を固定化する方法について十分に理解できるはずです。これを達成するためには、コンジュゲーション反応に高品質な試薬を使用し、SPR装置のアッセイパラメータを適切に設定することが重要です。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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可逆小分子またはバイオセンサー応用のためのマルチコンポーネント構造を固定化するために、マイクロ流体オンチップキャプチャ - 環化反応

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