器官型脳スライスと癌細胞の3Dスフェロイドとの共培養システム

この手順の全体的な目標は、脳転移形成中のグリア相互作用を直接視覚化することです。これは、最初にマウスから器官型脳スライスを調製することによって達成されます。次に、器官型脳切片を癌腫細胞と共培養します。

次に、間質細胞を特定のマーカーで蛍光染色します。最後に、腫瘍浸潤のレベルを蛍光顕微鏡で評価します。最終的には、免疫蛍光標識とタイムラプス顕微鏡または共焦点顕微鏡法を通じて、グリアがん細胞の相互作用と共局在を示す結果を得ることができます。

この手法が癌細胞の脳内注射のような既存の方法よりも優れている点は、この方法が簡単な代替手段であり、腫瘍の進行中の細胞相互作用を観察するための優れたプラットフォームを提供することです。この技術の意味は、がん治療のための新規および選択的治療法の発見に向けて10です。外傷細胞は転移に重要な役割を果たし、癌治療の潜在的な標的でもあるため、この技術を実証するのは、ユージニアが私の研究室のポスドクを手渡すことです外科的処置の前に、0.2ミリモルのグルタミン、100ミリグラム/ミリリットルのストレプトマイシン、および4.5ミリグラム/ミリグラムのグルコースを補充した最小限の必須培地からなる解剖培地を準備します出生後6日目から出生後6日目からマウスの系統からマウスを斬首した後8。

無菌条件を迅速に使用して、頭蓋骨から脳を取り出し、解剖培地に移します。前頭極と小脳を脳から取り除きます。次に、クライオグルーと5%アグロスを使用して、大脳を構成する残りの脳組織を固定して安定させます。

ビブラムの水平スライスを使用したステージでは、マウスの種類や年齢にもよりますが、厚さ350ミクロンの切片が、1つの脳から4〜6個の全脳スライスを収集します。テキストプロトコルに従って培地を調製した後、6ウェルトランスウェルプレートの各下部ウェルに1ミリリットルを加えます。次に、各器官型脳スライスを0.4ミクロンのポリカーボネートトランズウェルメンブレンに置き、プレートのウェルに挿入します。

スライスを5%の二酸化炭素と摂氏37度の加湿雰囲気で一晩インキュベートします。翌日、15%RPMI培地と85%ECMゲルからなる20マイクロリットルのゲルマトリックスに、10〜5番目のGFPトランスフェクション腫瘍または他の細胞を埋め込みます。MCF 7ゲルマトリックスミックスを器官型脳スライスの皮質領域に直接隣接する滅菌金属スペーサーに入れ、インキュベーション後2時間インキュベートし、スペーサーを取り外して、3D腫瘍PHEを脳スライスと24〜96時間インキュベートします。

必要に応じて、一日おきに培地を交換してください。10倍倍の拡大物体を用いたタイムラプス顕微鏡を用いてライブイメージングを行い、脳切片の培養物を染色します。4%パラホルムアルデヒドで摂氏4度で8時間固定した後、PBSTでサンプルを5分間洗浄します。

次に、サンプルをブロックするために、通常のヤギ血清をPBSTで室温で1時間使用します。次に、共培養物を抗グリア線維性酸性タンパク質またはGFAPモノクローナル抗体と摂氏4度で36時間インキュベートしてアストロサイトを染色し、続いて室温で1時間ヤギ抗マウス染色します。サンプルをPBSTで3回、それぞれ5分間洗浄した後、ミクログリア細胞をI LB four LOR 647で室温で1時間染色し、その後、DPIで室温で3分間対比染色します。

蛍光封入剤を使用して共培養サンプルをマウントした後、25倍の倍率で蛍光顕微鏡を使用してサンプルをイメージングします。最後に、次のスコアリングシステムに基づいて腫瘍浸潤のグレードを評価します。これは、最初に腫瘍プラグとスライスとの間の接触部分の長さを測定し、次に浸潤細胞によって検出可能な接触の割合を測定します。

ここに示されているように、試験したすべてのがん細胞株は、器官型のマウス脳スライスに浸潤しており、浸潤過程が種に依存しないことを示唆しています。この動画は、グリア腫瘍細胞の直接的な相互作用をタイムラプスで記録したものです。間質細胞が細胞栓を含む腫瘍に浸潤し、がん細胞と相互作用することが観察されました。

長時間にわたるタイムラプスイメージングにより、脳スライスの生存率が確認され、3次元領域に侵入するミクログリア細胞や、脳スライスに侵入するがん細胞を可視化することができました。さらに、以前に示したように、ミクログリアはまだ謎めいたメカニズムによって癌細胞を輸送し、免疫蛍光標識を使用して癌細胞の浸潤を支援します。私たちは、脳組織と腫瘍細胞プラグの両方で腫瘍細胞と間質細胞の共局在を示し、浸潤過程におけるこれらの細胞間の緊密な相互作用を示唆しています。

ここで見られるように、マウスの脳切片をヒトまたは尿がん細胞と共培養した場合、同等の結果が得られ、さまざまな種、遺伝子型、株の細胞を研究するための幅広いアプリケーションを裏付けています。この技術は、がん転移の分野の研究者が、離れた場所での腫瘍コロニー形成中の微小環境の影響を調査する道を開きました。このビデオを見れば、直接生理学的に接触したシステムで細胞脳転移形成中のGLがん細胞の反応を視覚化する方法を十分に理解できるはずです。