昆虫飛翔挙動監視のための早期変成挿入技術

こんにちは。Albert Bos博士の研究室のAlex Derberです。私はノースカロライナ州立大学電気工学科に所属しています。本日は、変態の初期段階にあるmanica sexへの電極植え込みのための新しい外科的手法を実演します。

Early Metamorphic insertion technologyと呼ばれるこの手法では、蛹の変態段階において、植え込まれた電極を昆虫の組織に統合させます。この手法の大きな利点は、神経筋組織との機械的に安定し、電気的に信頼性の高い結合が得られることであり、これにより昆虫の飛行神経生理学の研究が可能になります。成虫期において、IC Mensaは約40日間続く変態ライフサイクルを経ます。

Mensaは卵の段階からライフサイクルを開始します。7〜10日後、幼虫が孵化し、第3星形幼虫期に達します。星形幼虫期は全部で5段階あり、それぞれの段階で幼虫はエネルギー摂取と成長を行います。

5齢幼虫期の5〜6日後、昆虫は前蛹期に入ります。蛹期の間、昆虫の組織では広範なプログラムされた退行と、それに続く再生が起こります。成蛾として羽化する準備のため、昆虫はこの状態で17〜19日間を過ごします。

蛹の初期段階、あるいは後期段階への移行前、または後期段階において、蛹の背面胸部に導電性電極を外科的に挿入します。組織が植え込まれた電極の周囲で発達し、昆虫の体に電極が固定されます。数日かけて、蛹の胸部に挿入された電極は、最終的な成虫段階のガの体の一部として現れます。これにより、昆虫の組織系全体の再構築を利用することが可能になります。

変態の過程で、胸部の間接飛翔筋に電極を植え込みます。翅の動きを間接的に担うこれらの筋群は、背腹筋と背縦筋です。ここでは、翅の上昇運動を間接的に担う背腹筋への電極挿入法について実演します。

この挿入により、ya運動中の背腹筋から筋電図をワイヤレスで記録します。昆虫はLEDアリーナ内の電磁浮上プラットフォームによって吊り下げられ、それによって運動が刺激されます。初期変態挿入技術の手順は、挿入電極と記録機器とのインターフェースとして使用されるプリント回路基板の製作から始まります。

ワイヤ電極はプリント回路基板上に半田付けされ、フラットフレキシブルケーブルコネクタに接続されています。まず、細いチップの油性マジックとハサミを用いて、0.5 by 5 cm² の銅張積層板を測定し、切り出します。同様に細いチップの油性マジックを使用して、エッチングマスクパターンとして 0.1 by 5 cm² のパッドを3つ描きます。

定規などの直線的な器具を使用して、銅箔ラミネートの切り出し片の全長にわたってマーキングを行います。マーキングは太く描き、互いに重ならないようにしてください。マーク線が重なると、電極が短絡します。

フラットフレキシブルケーブルコネクタへの接続時に基板が使用不能になるのを防ぐため、銅箔ラミネートの切り出し部分を、できればドラフトチャンバーのある換気設備が整った場所へ移動させ、銅箔ラミネート上のマーキングをエッチングします。プリント基板のエッチング処理は毒性があるため、取り扱いに注意してください。誤って摂取したり飲み込んだりした場合や、接触により皮膚に刺激を与える可能性があるため、銅箔ラミネートの切り出し部分の端に、長手方向に約1cmかかるようにテフロンテープを貼付します。

次に、銅箔ラミネートの切り抜きを、銅箔ストリップの半分がエッチング液に浸かるように、セロハンテープでメスシリンダーの内側に貼り付けます。このビーカーを回転台の上に置き、20分間回転させます。エッチングされた銅箔ラミネートをビーカーから取り出し、水で満たしたビーカーの中で10分間浸漬させます。

残留物を洗い流すため、繊細なワイプティッシュにイソプロピルアルコールを浸し、エッチングされていない銅パッドを露出させるようにマーキング部分を拭き取ります。油性マジックの跡をすべて除去してください。プリント基板を約1cm角の小さな正方形に切り分けます。

プリント基板のエッチングが完了したら、電極を取り付ける準備を行います。これらの手順は、顕微鏡を用いて視覚的に確認しながら行うことが推奨されます。鋭利な刃物を使用して、被覆部分が0.11インチ、裸線部分が0.008インチの被覆付きニッケルステンレス鋼線を、3 cmの長さに2本切断します。

これらのステンレス鋼線は、昆虫の胸部に挿入される作用電極です。カミソリを用いて、各電極の両端から4〜5 mmのプラスチック被覆を取り除きます。次に、切断します。

接地電極のチップ延長部を作成するため、被覆付きステンレス電線を0.7 cm 1本用意します。前ステップと同様にカミソリで被覆を慎重に取り除くか、はんだごての熱で溶かして除去します。次に、リッツ線を4.5 cmの長さに1本切断します。

このはんだ付けには、インダクタ線も使用できます。あらかじめ準備しておいた0.7 centimeterのステンレス製チップを、lititz接地接続線に取り付けます。接地接続の末端に、ステンレス製チップが露出している状態にしてください。

テフロンテープを用いて、エッチング済みの回路基板をはんだ付けワークスペースに固定します。電極を基板にはんだ付けできるよう、パッドの1〜2 mmが露出するようにテープを回路基板に貼ってください。マスクされたはんだ付け不要なパッド端部は、FCCコネクタに挿入されます。

3本の電極線をテフロンテープで固定し、それぞれの端を電極ボードの対応するパッドにはんだ付けできるように配置します。2本の活性電極はボードの端に近いパッドにはんだ付けし、接地電極は中央のパッドにはんだ付けしてください。

はんだ付けを容易にするため、電極パッド全体にステンレス用フラックスを塗布します。はんだを付けすぎるとパッド間が短絡する恐れがあるため、注意してください。電極をアセトンおよびイソプロピルアルコールにそれぞれ10分間浸漬させます。

はんだ残渣を洗浄します。洗浄液は別々の皿またはビーカーに注いで使用してください。洗浄効果を高めるには、浸漬中に電極を超音波洗浄機に入れ、洗浄液で処理します。昆虫は、昼夜の切り替わり時に最も活発になります。

したがって、自動コンセントタイマーを使用して、昆虫飼育ケース内に人工的な明暗サイクルを設定する必要があります。これは、7時間の暗期と17時間の明期サイクルをシミュレートするように設定してください。manduka sex eye pu eyeを毎日観察し、適切な挿入時間を決定してください。

蛹の目は、翅の準備が整った約1日後に挿入可能になります。黒い点が見える状態の時に挿入を行うのが最も成功率が高く、その時期は化蛹（closure）の7日から4日前となります。下部のより色の濃い蛹は、電極の外科的挿入の準備が整っており、蛹を麻酔させる必要があります。

4 °Cの冷蔵庫に約6時間置いてください。次に、挿入手順のための作業スペースを準備します。作業スペースには、イソプロピルアルコール、鋭いピンセット、および30ゲージの皮下注射針を用意してください。

オプションとして、電極の固定を強化するためにシアノアクリレート系接着剤を使用することができます。針付きピンセットと電極をイソプロピルアルコールに浸すか、あるいは拭き取ることで滅菌してください。6時間後にピューピラリウスを冷蔵庫から取り出し、作業スペースに移動させます。背側胸部において、目的の筋肉群に対応する位置を特定します。

ここでは、翅の上向き運動を担う背腹筋に着目します。鋭利な刃物または皮下注射針を用いて、外クチクラ層に1 cm × 1 cmの正方形の切り込みをそっと入れます。ピンセットを使用して、これらの破片をゆっくりと剥ぎ取ります。

ピンセットを使用して、胸部の露出した領域から翅毛を除去します。クリーニング工程を補助するために、必要に応じて真空吸引機を使用しても構いません。挿入した電極への干渉を避けるため、可能な限り多くの毛を除去することが重要です。

針を胸中胸の翅が胸部に付着している部位に約5 mmゆっくりと刺入し、筋肉群を標的とした2つの刺入点を作成します。刺入位置を見失うと見つけるのが困難になるため、作成した穴の位置を覚えておいてください。蛹をテーブル上で固定し、機械的な耐久性を高めるためのオプションとして、ピンセットを用いて2本の記録電極を2つの刺入点に誘導します。

電極周囲の毛をすべて取り除き、ワイヤーアプリケーターを用いて胸部の各挿入点周囲にシアノアクリレート接着剤をたっぷりと塗布します。ELO用のケージを準備し、昆虫が登ることができるように、壁面と天井を粗く質感のある素材で覆います。羽化後は、穴あきの段ボール箱や梱包用緩衝材を使用しても構いません。

剛性固定材を準備します。長さ約6 cm、直径2 mmのスティックを用います。このスティックを、突出した部位の下にある穴に慎重に差し込みます。

プラスチック製撹拌棒を使用します。この工程では、綿棒や金属線を用いることも可能です。蛹が転がらないよう、棒の両端をケージの表面に固定してください。

中胸が上を向くようにして、蛹をケージ内に配置します。激しく動かすと、電極の損傷や血リンパの喪失を招いたり、挿入が無効になったりする可能性があります。接地電極は、腹部または胸部の遠位部に挿入してください。

信号のカップリングを避けるため、電極の挿入は蛹の発育後期の段階で行うか、または昆虫が羽化した後に行うことができます。蛹の段階での挿入または成虫になってからの挿入のいずれにおいても、この蛹の段階で接地電極の挿入部位を準備しておく必要があります。ここでは、成虫段階での接地電極の挿入について説明します。

蛾を4 °Cの冷蔵庫に6時間置きます。冷温処理による固定のため、イソプロピルアルコール、鋭利なピンセット、30ゲージの皮下注射針、シアノアクリル系接着剤、接着剤塗布用の針金、およびオプションで熱凝固器と歯科用ワックススティックを含む挿入作業スペースを準備します。前述と同様に、皮下注射針をイソプロピルアルコールに浸してから、後腹部の記録電極から約1〜2 cm離れた挿入点にある蛾に接触させます。ゆっくりと針を挿入して腹部を穿刺し、挿入部位を確保します。

針は4 mm以上刺入しないようにしてください。刺入部位から血リンパが流出した場合は、針を刺しすぎたことを意味し、手技の成功率が低下します。ピンセットを用いて、接地電極を刺入部位に慎重に挿入し、深さが3～4 mmになるまで圧をかけて固定してください。

電極を固定したまま、オプションの手順として、挿入部位の周囲にワイヤーを用いて接着剤を塗布します。挿入部の機械的強度をさらに高めるには、熱凝固器を使用して、先端に2〜3 mmの少量のワックスを付着させます。先端を挿入部位に近づけ、ワックスが電極を囲み、しっかりと固定されるように加熱します。

冷却後、実験を行う前に、昆虫を1日間休ませて挿入による負荷から回復させてください。昆虫上の電極ボードをTriangle Biosystems International社のヘッドステージユニットに接続するには、フラットフレキシブルケーブルコネクタを備えたアダプターボードが必要です。アダプターボードにはエッチングされた銅積層板を使用します。これは、前述の電極ボード作成手順に従って準備してください。はんだ付けステーションにて、準備したボードの一端にフラットフレキシブルケーブルコネクタをはんだ付けします。

10ピンのフラットフレキシブルケーブルコネクタを、コネクタ端にある2組のピンと中央のピン1組が3つの銅パッドに接触するようにボードに半田付けします。次に、3本の30 AWGフックアップワイヤを3つのパッドに半田付けします。ボードの反対側では、上述の通りオシロスコープで読み取りを行うため、アダプタボード上の3つのパッドに3つのミニコネクタを半田付けします。

次の段階では、2つのコネクタをボードの端に対して垂直に配置します。中央のコネクタは、ボードの平面からわずかに上向きに傾けてください。これら3本のワイヤのもう一方の端を、Triangle Biosystems International社製のヘッドステージコネクタに接続します。

電極の信頼性を向上させ、信号対雑音比を観察するために、ヘッドステージ回路基板をレビテーションフレームの上に固定してください。これにより、有線オシロスコープによる記録が可能になります。ワイヤレス記録システムを導入する前に、オシロスコープをマルチチャンネルAC神経記録アンプに接続してください。

アンプのパラメータを、ハイパス遮断周波数1 Hz、ローパス遮断周波数20 kHz、ゲイン100に設定します。アダプターボード上の各メス型ミニワイヤコネクタをアンプの入力チャネルに接続します。電極を植え込んだ昆虫をケージから取り出します。

活性状態にあるとき、ピンセットを用いて、測定前に蛾が静止するための組織片を蛾の下に配置します。次に、電極基板をアダプター基板上のフラットフレキシブルケーブル接続レセプターにスライドさせて挿入します。昆虫の下から組織を取り除き、筋電図スパイクの発生を観察します。昆虫が翅を羽ばたかせている間に、オシロスコープでデータをキャプチャし、保存します。

この図は、翅の羽ばたき前および羽ばたき中に、オシロスコープを用いてある筋肉から取得した筋電位信号を示しています。信号は100倍の増幅、1 Hzの高域通過フィルタおよび20 kHzの低域通過フィルタによる処理、そして静止期での処理が行われています。筋電位は観察されません。

翼の羽ばたき中の筋電位は約15から20 hertzで発生します。オシロスコープによる測定結果が収集および確認された後、ワイヤレスEMG信号を収集する必要があります。拘束されたManus sexの飛行中にEMG信号をワイヤレスで記録するために、電磁浮上プラットフォームを構築することが可能です。

浮上プラットフォームは、テザリング機構をバランスさせるように設計されたフレームで構成されています。自由浮上によるレビテーションにより、フレーム、ひいては昆虫がyaできるようになります。テザリングワイヤーによる拘束がない状態でのテストでは、熱溶解積層方式の3Dプリンターを用いてフレームをラピッドプロトタイピングすることが可能です。

この磁石を搭載したフレームは、ベースプラットフォームにある一連の電磁石によって浮上しています。この浮上プラットフォームはLEDアリーナの内部に配置されており、アリーナは5×7個の個別LEDの配列で構成される60枚のパネルを用いて構築されています。アリーナはAPIC 18 F 45 20マイクロコントローラによって制御されており、時計回りおよび反時計回りの回転のシミュレーションに加え、回転速度の制御が可能です。

TBSIワイヤレス記録システムをセットアップします。TBSIヘッドステージをレヴィテーションプラットフォーム上のアダプターボードコネクタに接続してください。昆虫が活動しているとき、できれば夜明けの時間帯に、ケージから取り出します。

ピンセットを使用します。電極ボードをレビテートフレーム上のフラットフレキシブルケーブルレセプターに慎重に挿入し、昆虫がセットアップ内でしっかりと吊り下げられた状態にします。ヘッドステージにある磁気スイッチの近くにマグネットワンドを配置し、ワイヤレスデータ転送を有効にします。

ヘッドステージがアクティブになり、記録準備が完了したことを示す青色のライトが点灯します。部屋の照明を消して完全に暗くし、コンピュータでTBSI neuro awareソフトウェアを開きます。室内の補助照明として赤色ランプを使用しても構いません。

適切な設定ファイルを選択してください。本手順で使用する設定ファイルは、デフォルトのW five設定です。次に、初期インターフェースの左上にあるスタートデッキボタンをクリックします。

信号の表示を開始するには、TBSI記録システムの全チャンネルウィンドウタブを選択してEMG信号を観察します。ワイヤレス接続と電極動作の信頼性を確保するため、すべてのLEDアリーナコンポーネント、調整済みDC電源、およびマイコンの電源を入れます。アリーナ内の浮上プラットフォームをゆっくりとバランス調整してください。

Neuropixelインターフェースの左パネルにある「record to binary」タブを選択します。記録時間とファイルの保存先を指定してください。データを保存するための適切な出力設定を選択します。

TBSI録画ソフトウェアの開始ボタンをクリックして、録画セッションを開始します。これにより、ファイルは.nextファイルとして保存され、一般的に使用されるデータ処理プログラムにインポートすることが可能です。

LEDの動きに対応した方向に昆虫が飛ぶ様子を観察します。LEDの方向を反転させ、昆虫が方向を変えることを確認してください。この操作を必要に応じて繰り返します。表示されている矢印は、LEDパターンの回転方向を示しています。

矢印が黄色になります。昆虫が反時計回りに回転すると、矢印が青くなります。時計回りに回転したときも同様に、矢印が青くなります。表示されている映像の音声は、通常よりも50%速くなっています。

この図は、静止期における羽ばたきの前および最中に、ワイヤレス計測装置を用いて1つの筋肉から取得した筋電位信号を示しています。静止時には筋電位は観察されません。羽ばたき中の筋電位は、約15～20 hertzで発生しています。

ここでは、単一チャンネルの記録のみを示しました。しかし、このセットアップを用いて多チャンネル記録を行うことで、飛行動作中の複数の筋肉群の間の協調性を観察することが可能です。以上で、変態初期段階にある蛹化直前のサナギへの電極挿入方法について説明しました。

瞳孔期の後半で挿入を行うタイミングを適切に合わせることが重要であり、早すぎたり遅すぎたりしないようにしてください。そうしないと、信頼性の高い電極セットアップの構築に支障をきたす可能性があります。また、昆虫がLEDアリーナ内でホバリングしている間に、間接飛翔筋からEMGデータを無線録音するために必要な電気部品の組み立て方法についても説明しました。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。