昆虫飛翔挙動監視のための早期変成挿入技術

こんにちは、Dr.Albert Bos研究室のAlex Derberです。私はノースカロライナ州立大学の電気工学科に所属しています。今日は、初期の変態段階でマニカ性に電極を埋め込むための新しい外科的処置を実演します。

この手順は、Early Metamorphic Insertion Technologyと呼ばれ、埋め込まれた電極は、瞳孔変成期に昆虫の組織に組み込まれます。この手順の主な利点は、神経筋組織との機械的に安定し、電気的に信頼性の高い結合をもたらし、昆虫の飛行神経生理学の研究を可能にすることです。成体期では、IC Mensaは約40日間続く変成ライフサイクルを経ます。

Mensaは卵の段階でそのライフサイクルを開始します。7〜10日後、幼虫は孵化し、3番目の星の幼虫の段階に達します。星の幼虫には全部で5つの段階があり、それぞれの段階で幼虫はエネルギー収穫と成長を遂

5回目の設置幼虫期から5〜6日後、昆虫は初期の瞳孔期に入ります。瞳孔期には、広範なプログラムの変性とそれに続く昆虫組織の再生があります。成虫の蛾としての出現に備えて、昆虫は17〜19日を費やします。

瞳孔初期では、後期瞳孔期に入る前、後期瞳孔期に、瞳孔の背側胸部に導電性電極を外科的に挿入します。組織は埋め込まれた電極の周囲に発達し、昆虫の体への付着を固定します。数日の間に、瞳孔の胸部に挿入された電極は、最終的な成虫期に昆虫の体の一部として蛾として出現し、昆虫の組織系全体の再構築を利用します。

変成発達中、電極は胸部の間接飛行筋に埋め込まれます。翼の動きに間接的に関与しているこれらの筋肉群は、背側腹側筋と背側縦筋です。ここでは、翼のアップストロークを間接的に担う背側腹側筋への電極挿入を実演します。

この挿入により、運動中の背側腹側筋からの筋電図をワイヤレスで記録します。昆虫はLEDアリーナ内の電磁的に浮遊するプラットフォームによって吊り下げられるため、動きが刺激されます。早期変態挿入技術の手順は、挿入された電極と記録機器との間のインターフェースとして使用されるプリント回路基板の構築から始まります。

ワイヤー電極はプリント回路基板にはんだ付けされ、プリント回路基板はフラットで柔軟なケーブルコネクタに接続されています。測定を開始し、細い先端、油性マーカー、および同じ細い先端、油性マーカーを使用して0.5 x 5センチメートル四方の銅張積層板をカットし、はさみと同じ細い先端、油性マーカーを使用します。0.1×5cm四方のパッドを3枚、エッチングマスクパターンとして描きます。

定規などの直定規を使用して、銅ラミネートの切り欠きの全長に沿ってマーキングを行います。マーキングが太字で、互いに重ならないようにしてください。マークラインが重なると、電極がショートします。

フラットでフレキシブルなケーブルコネクタに接続する場合は、ボードを役に立たなくし、銅ラミネートの切り欠きを換気された領域に引き継ぎ、できれば銅ラミネートにマーキングをエッチングするためのヒュームフードを使用します。プリント基板のエッチングは有毒ですので、取り扱いには注意してください。摂取または飲み込んだ場合、接触すると皮膚を刺激する可能性がある場合は、長さに沿って約1センチメートル覆う銅ラミネートカットアウトの一方の端にテフロンテープを置きます。.

次に、銅ラミネートストリップの半分がエッチングに沈むように、スコッチテープを使用して目盛り付きビーカーの内側に銅ラミネートカットアウトを取り付けます。ビーカーを回転プラットフォームに20分間置きます。エッチングされた銅ラミネートをビーカーから取り外し、水で満たされたビーカーに10分間置きます。

残留物をすすぐには、イソプロピルアルコールを繊細なワイプティッシュに塗布し、マーキングを拭いて、エッチングされていない銅パッドを露出させます。油性マーカーの痕跡をすべて削除します。プリント回路基板を約1cmの長さの小さな正方形にカットします。

プリント基板にエッチングができたので、電極を取り付けるための準備をする必要があります。これらの手順は、顕微鏡の視覚補助を使用して実行することをお勧めします。コーティングされた、0.11インチの直径のひざまずいたステンレス鋼線を鋭利な刃を使用して裸にし、鋭利な刃を使用して、それぞれ3センチメートルの2つの長さ

これらのステンレス鋼線は、昆虫の胸部に挿入されるアクティブ電極です。かみそりの刃を使用して、各ワイヤーの両端から4〜5ミリメートルのプラスチックコーティングを取り除きます。次に、カットします。

0.7センチメートルの絶縁ステンレス鋼線1本で、接地電極の先端延長を作成します。前の手順で行ったように、かみそりの刃でコーティングをそっと取り除くか、はんだごての熱で溶かします。次に、リティッツワイヤーを1本4.5センチの長さにカットします。

このはんだにはインダクター線も使用できます。事前に準備した0.7センチメートルのステンレス鋼片をリティッツアース接続線に先端します。露出したステンレス鋼の先端は、アース接続の端にある必要があります。

エッチングされた回路基板をテフロンテープを使用してはんだ付けワークスペースにテープで固定します。パッドの1〜2ミリメートルが電極を基板にはんだ付けできるように、テープを回路基板の上に置きます。パッドのマスクされたはんだフリー端がFCCコネクタに挿入されます。

3本の電極線をテフロンテープで位置合わせし、それぞれの一端を電極ボードの対応するパッドにはんだ付けできるようにします。2つのアクティブ電極は、ボードの端近くのパッドにはんだ付けする必要があります。点灯した接地電極は、センターパッドにはんだ付けする必要があります。

電極パッド全体にステンレス鋼のフラックスを塗布して、はんだ付けを容易にします。はんだを塗りすぎてパッド接続がショートしないように注意してください。電極をアセトンにそれぞれ10分間イソプロピルアルコールに浸します。

はんだの残渣をきれいにするため。溶液は別々の皿やビーカーに注ぐことができます 洗浄性能を向上させるために、電極を超音波浴に入れることができます 浸漬 そして 洗浄液。昆虫は、昼と夜の間の移行中に最も活発になります。

したがって、人工的な昼夜サイクルは、自動出口タイマーを使用して昆虫室内で確立する必要があります。これらは、7 時間の暗闇と 17 時間の光のサイクルをシミュレートするように設定する必要があります。適切な挿入時間を決定するために、毎日マンドゥカセックスアイpuアイを調べてください。

puアイは、翼の約1日後に挿入の準備が整います。展示のダークスポットの挿入は、ここで閉じる7〜4日前に実行すると最も成功します。底面の濃いpuは、puiを麻酔するための電極の外科的挿入の準備ができています。

°Cの冷蔵庫に約6時間入れます。次に、ワークスペースの挿入を準備します。ワークスペースには、イソプロピルアルコール、30ゲージの皮下注射針に鋭利なピンセットブレードが含まれている必要があります。

オプションとして、シアノアクリレート接着剤を使用して、電極の固定を強化し、針ピンセットと電極をイソプロピルアルコールに浸すか、またはイソプロピルアルコールで拭くことにより滅菌することができます。6時間後に瞳孔を冷蔵庫から取り出し、ワークスペースに移します。目的の筋肉群に対応する背側胸部の位置を決定します。

ここでは、翼の上向きの動きに関与する背側腹側筋に興味があります。鋭利な刃または皮下注射針を使用して、エクソキューティクル層を通して1センチメートル四方の長方形を1つずつそっと引っ掻きます。ピンセットを使って、これらのピースをゆっくりと剥がします。

ピンセットを使用して、胸部の露出した領域から翼の毛を取り除きます。オプションで掃除機を使用して、洗浄プロセスを支援することができます。挿入された電極に干渉しないように、できるだけ多くの髪の毛を取り除くことが重要です。

翼が胸部に付着しているメソタックスに針を約5mmゆっくりと挿入して、筋肉群を標的とする2つの挿入点を作成します。穴を開ける場所は、紛失すると見つけるのが難しくなる可能性があるため、覚えておいてください。蛹をテーブル上で安定させ、ピンセットを使用して2つの記録電極を2つの挿入ポイントに誘導し、機械的耐久性を向上させるオプションとして使用します。

電極の周りの髪の毛をすべてきれいにし、ワイヤーアプリケーターで胸部の各挿入点の周りにシアノアコレート接着剤をたっぷりと塗ります。ELO用のケージは、昆虫が登る可能性のある壁や天井を覆うざらざらした質感の素材で準備します。出現時には、穴あき段ボール箱または包装紙を使用してもよい。

しっかりと固定します。長さ約6センチ、直径2ミリメートルで固執します。このスティックを、突き出たプロの下の穴に慎重にスライドさせます。

プラスチックが攪拌します。このステップには、綿棒または金属線を使用できます。スティックの両側をケージの表面に固定して、蛹が転がらないようにします。

メソタックスが上を向くように、蛹をケージの内側に配置します。無理な動きをすると、電極が損傷したり、ヘリが失われたり、挿入が役に立たなくなったりする可能性があります。接地電極は、腹部または胸部の遠位部分に挿入する必要があります。

シグナルの結合を避けるために、ジシンの挿入は、瞳孔の発達の後期段階または昆虫が出現した後に行うことができます。接地電極挿入部位は、瞳孔期の挿入または成人期の挿入のいずれかのために、この瞳孔期に準備する必要があります。ここでは、成人期の接地電極の挿入が実証されています。

それらを蛾を摂氏4度の冷蔵庫に6時間置きます。冷間治療の固定化には、イソプロピルアルコール、鋭利なピンセット、30ゲージの皮下注射針シアン、クレオール接着剤、接着剤を塗布するためのワイヤー、オプションの歯科用ワックススティックに入ったオプションのサーマル焼灼器を含む挿入ワークスペースを準備します。前回と同様に、皮下注射針をイソプロピルアルコールに浸して、後腹部に沿って記録電極から約1〜2センチメートル離れた挿入点にある蛾と接触させ、ゆっくりと針を挿入して腹部に穴を開け、挿入側を提供します。

針は4ミリメートル以上貫通してはいけません。挿入側に血リンパ液が出てきた場合は、針を刺しすぎたため、施術が成功する可能性が低くなっています。ピンセットを使用して、接地電極を挿入部位に慎重に挿入し、深さ3〜4ミリメートルになるまで圧力を加えます。

電極を所定の位置に保持し、ワイヤーを使用して挿入部位の周りに接着剤を塗布します オプションのステップとして。挿入の機械的強度をさらに高めるには、サーマル焼灼器を使用し、先端に2〜3ミリメートルの小さなワックスビートを収集します。先端を挿入部位に近づけ、ワックスが電極を包み込み、電極をしっかりと固定するように熱を加えます。

冷却後、実験を行う前に、昆虫が挿入から回復するのを待ちます。昆虫の電極ボードを三角形のバイオシステムズ国際ヘッドステージユニットに接続するために必要なフラットフレキシブルケーブルコネクタを備えたアダプターボード。アダプタボードはエッチングされた銅ラミネートボードを使用しており、はんだ付けステーションで電極ボードにエッジを準備するために前に示した手順に従って準備する必要があります、準備されたボードの一端にフラットフレキシブルケーブルコネクタをはんだ付けします。

10ピンフラットフレキシブルケーブルコネクタは、コネクタの端にある2組のピンと中央のピンペアを3つの銅パッドに接触させてボードにはんだ付けできます。次に、3つのパッドに3本の30アメリカンワイヤーゲージフックアップワイヤーをはんだ付けします。ボードのもう一方の端では、説明されているようにオシロスコープを読み取るために、アダプターボードの3つのパッドに3つのミニコネクタを屠殺します。

次の段階では、2つのコネクタをボードの端に対して垂直に配置します。中央のコネクタは、これらの3本のワイヤのもう一方の端をヘッドステージコネクタに屠殺するボードの平面から少し上に角度を付ける必要があります。Triangle Biosystems Internationalによって提供されます。

次に、ヘッドステージ回路基板を浮上フレームの上に固定して、電極の信頼性を高め、信号対雑音比を観察する必要があります。テザードオシロスコープの録音を取得できます。ワイヤレス録音システムを実装する前に、オシロスコープをマルチチャンネルACニューロレコーディングアンプに接続してください。

アンプのパラメータを、ハイパスカットオフ周波数を1ヘルツ、ローパスカットオフ周波数を20キロヘルツ、ゲインを100に設定します。アダプタボードの各メスミニワイヤコネクタをに接続します amplifier入力チャンネル。埋め込み電極板で昆虫をケージから取り出します。

それが活動状態にあるとき、測定が行われる前に、ピンセットを使用して測定が行われる前に、組織片を蛾の下に置くことができ、電極ボードをアダプターボード上のフラットフレキシブルケーブル接続受容体にスライドさせます。昆虫の下の組織を切除し、筋電図のスパイクの生成を観察します。昆虫が羽ばたくと、その翼はオシロスコープにデータをキャプチャして保存します。

この図は、翼の羽ばたき前と羽ばたきの最中にオシロスコープで筋肉の1つから取得した筋電位信号を示しています。信号は、100倍の増幅と1ヘルツのハイパスフィルター、20キロヘルツのローパスフィルター、および静止期間で処理されました。筋電位は観察されません。

翼の羽ばたき中の筋電位は約15〜20ヘルツで発生します。オシロスコープの測定値が収集および検証されたら、ワイヤレスEMG信号を収集する必要があります。電磁浮上プラットフォームは、マヌス・セックス・トゥ・フライト中にEMG信号を無線で記録するために構築することができます。

浮上プラットフォームは、テザリング機構のバランスをとるように設計されたフレームで構成されています。自由に浮かぶ浮遊はフレームを可能にし、したがって昆虫をyaに。テザリングワイヤの制約を受けずに試験中、熱溶解積層法モデリングマシンを使用してフレームを迅速に試作することができます。

この磁石を装填したフレームは、ベースプラットフォーム内の一連の電磁石によって浮上します。この浮遊プラットフォームは、5 x 7 の個別の LED の配列で構成された 60 枚のパネルを使用して構築された LED アリーナの内部にあります。アリーナはAPIC 18 F 45 20マイクロコントローラによって制御され、時計回りと反時計回りの両方の回転のシミュレーションと、回転速度の制御が可能です。

TBSIワイヤレス録音システムを設定します。TBSIヘッドステージを浮上プラットフォームのアダプターボードコネクタに接続することにより。昆虫が活動しているとき、できれば夜明けの時間にケージから昆虫を取り除きます。

ピンセットを使用。電極ボードを浮遊フレームの平らなフレキシブルケーブルレセプターに慎重に挿入し、昆虫がセットアップ内にしっかりと吊り下げられるようにします。磁気ワンドをヘッドステージの磁気スイッチの近くに配置して、ワイヤレスデータ伝送をアクティブにします。

ヘッドステージがアクティブで録音の準備ができていることを示す青いライトが点灯します。部屋の照明を消して完全な暗闇にし、コンピューターでTBSIニューロアウェアソフトウェアを開きます。赤いランプを使用して、部屋に照明を追加できます。

適切な設定ファイルを選択します。この手順で使用する設定ファイルは、デフォルトの W 5 設定です。次に、初期インターフェースの左上隅にあるスタートデッキボタンをクリックします。

信号の表示を開始するには、TBSI記録システムでEMG信号を観察するためのすべてのチャネルウィンドウタブを選択します。信頼性の高いワイヤレス接続と電極動作を確保するには、すべてのLEDアリーナコンポーネント、安定化DC電源、およびマイクロコントローラをオンにします。アリーナ内の浮遊プラットフォームのバランスをゆっくりと取ります。

Nor Aware インターフェイスの左側のパネルにある [バイナリに記録] タブを選択します。録音時間とファイルの保存先を指定します。データを保存するための適切な出力設定を選択します。

スタートボタンをクリックして、TBSI録画ソフトウェア内で録画セッションを開始します。これにより、ファイルは次のファイルとして保存され、一般的に使用されるデータ処理プログラムにインポートできます。

LEDの動きに対応する方向に昆虫が飛ぶのを観察します。LEDの向きを逆にして、虫が向きを逆にすることを確認しますこれを必要な回数だけ実行します。表示されている矢印は、LEDパターンの回転方向を示しています。

矢印が黄色に変わります。昆虫が反時計回りに回転すると、昆虫が時計回りに回転すると矢印が青色になります。表示される映画の再生音声は、通常よりも50%高速です。

この図は、静止期間中の翼の羽ばたき前と羽ばたき中の1つの筋肉について、無線計測器から取得した筋電位信号を示しています。筋電位は観察されません。翼の羽ばたき中の筋電位は約15〜20ヘルツで発生します。

ここでは、1チャンネルの録音を示しています。ただし、このセットアップで撮影されたマルチチャンネル録画は、飛行操作中の複数の筋肉群間の調整を観察するために使用できます。私たちはちょうど蛹に男性の性に初期の変成段階の電極挿入を実行する方法を示しました。

瞳孔期の早すぎたり遅すぎたりしないように、挿入のタイミングを瞳孔後期にすることが重要です。そうしないと、信頼性の高い電極セットアップを得るのに問題が発生する可能性があります。また、昆虫がLEDアリーナで浮遊している間に、間接飛行筋からのEMGデータのワイヤレス記録を実行するために必要な電気部品を組み立てる方法も示しました。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。