Name: 大人のゼブラフィッシュにおける網膜再生研究で使用するための新規な光ダメージパラダイム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-24T15:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学ぶ大人のゼブラフィッシュにおける網膜光ダメージ法。UV光とハロゲンランプを組み合わせて桿体と錐体の両方の光受容体を損傷させ、網膜再生メカニズムの研究に有用な新規パラダイムを確立する方法です。

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著者は、優れた魚の飼育と技術サポートのため西夏羅に感謝したいと思います。この作品は、健康補助R21EY019401（RT）とP30EY04068（RT）の国立研究所によって資金を供給し、ウェイン州立大学、眼科部門に失明を防止するための研究から無制限の助成金を含め、RTに資金を立ち上げました。 JTは、ウェイン州立大学大学院で提供されるトマスC.ランブルフェローシップによってサポートされていました。

このプロトコルで説明されているすべての手順は、医学のウェイン州立大学で動物使用委員会によって承認された。 1。暗順応<ol><li>転送〜ダークエンクロージャに通常の住宅システムから10成体アルビノまたは着色された魚。可能であれば、タンクを通じて通常の水の流れを可能にゼブラフィッシュ住宅モジュールに組み込まれている暗い筐体を使用しています。 （そのようなシステムが利用できない場合には、酸素と魚を通気することを確認し、完全に暗いエンクロージャ内に水槽を配置）。 </li><li> 10日間暗闇の中で魚を保管してください。動物を餌または暗箱に新しい魚を追加する場合は、光の長い期間に魚をさらす避けるためにできるだけ早く移動してください。 </li></ol> 2。 UV露光<ol><li> UV源の電源がOFFになっていることを確認してください。蛍光実体顕微鏡からの紫外線フィラメントを取り外します。 <ol><li>反転を使用してくださいUVフィラメント用のスタンドとして直径15cmのガラスシャーレ（または類似した2センチメートルの高さのようなもの）。実験台にシャーレテープ。 </li><li>反転したペトリ皿の上部にテープ紫外線フィラメント。フィラメント張り出し月末〜2ミリメートルペトリ皿になるよう配置します。 </li></ol></li><li> 250mlのガラスビーカーを取得します。背面アルミホイルでビーカーのカバー下部の½、側面、そして、箔の &quot;光沢のある&quot;側がビーカーの内側に面していることを確認する。ビーカーを卒業されている場合は、露出したビーカーの明確な半分を残して、ホイルでビーカーの文言の半分をカバーしています。 </li><li>魚施設システムから100mlの水で250mlのビーカーを埋める。 </li><li> 4リットルのビーカーに250mlのビーカーを置きます。水位が250mlのビーカーに100mlの水ラインと偶数​​になるまで水を4リットルのビーカーを埋める。 </li><li> 250mlのビーカーに10暗処置動物の最大値を追加します。アルミニウムの小片で250mlのビーカーをカバー箔。 </li><li> UVフィラメントに隣接全体ビーカー装置を置きます。フィラメントは、4 Lのビーカーの外側に触れると250ミリリットルのビーカーの露出部分に直面しなければならない。 250mlのビーカーを4 Lのビーカーの底の中心にいることを確認してください。 </li><li>露出する動物のためにできるように、しかし、UVフィラメントの先端を見てから、任意のラボ要員を防止、4Lビーカー背後に大規模な、不透明な画面を配置します。警告：この障壁はUV源の電源を入れる前に所定の位置にあることを確認してください。 </li><li> UV電源をオンにします。 30分のタイマーを設定します。どんな必要な警告ラベルは、その無防備なラボの担当者が誤って紫外線に自分自身を公開しないように置きます。 </li><li> 30分後、UV電源を遮断する。魚と250mlのビーカーを取り外します。注：UV暴露の複数回が必要な場合、露出プロトコルを繰り返す前（〜20分）電源がクールダウンしましょう​​。 Tを交換することを確認してください彼は各露光のために新鮮なシステム水で100mlの水。 4リットルのビーカー中の水を交換する必要はない。 </li></ol> 3。ハロゲンランプ露光<ol><li> 1.8 L明確なアクリルの魚飼育用の水槽に250mlのビーカーから魚を移す。オーバーフローマークに給油して下さい。 </li><li>ハロゲンランプ光処理領域を設定する。地元の金物屋からの4つの250 Wのハロゲンランプユーティリティを入手します。同じ方向に2つのランプに面しており、中央には別に29センチメートルを手配。同様の方法で、他の2つのランプを配置します。 <ol><li>彼らは、ランプの2つのセットの間の内〜73センチメートルを残して、ランプの第1のセットを対向されるようにランプの第2のセットを配置する。これは29×73センチメートルの長方形状の光治療領域を作成します。 </li></ol></li><li>地元の金物屋から小さなファンを得る。ちょうど光処理領域外、ランプの2つのセットの間の等距離のファンを配置します。 </li><li>の中心に水の完全な2 1.8 Lタンクを置きランプの2つのセットの間の等距離光処理領域。ランプ、タンクの外壁の間の距離は〜29 cmであるべきである。注：のみ1 1.8 Lタンクに10魚を治療する場合でも、このような構成を使用しています。両方のタンクは適切な範囲内で、各タンクの水の温度を維持するために必要とされる。 </li><li>各タンク内の酸素エアレーターを置きます。 </li><li>ファンに最も近い端で1〜2センチのギャップを残し、透明アクリル蓋と各タンクをカバーしています。それがこの隙間に空気を爆破するようにファンを配置します。タンクの一方または両方に温度計を配置する。 </li><li>ライト、ファン、エアレーターの電源をオンにします。最大4日間の光治療を維持する。これは動物に多くのストレスの水質と結果に影響を与えるような魚は、光治療中に供給されるべきではありません。 </li><li>日常的に温度と水位を監視します。 30-33で温度を維持℃に必要に応じて、ファンの回転速度および/またはタンク及びリチウムの間の距離を調整するghts。 <ol><li>必要に応じて、通常の毎日のシステム水で各タンクトップオフ。 </li><li>常に100％近くの生存率を維持するために、健康な成人ゼブラフィッシュ（通常生後6-9ヶ月）を使用します。魚は水槽で死体で発見された場合しかし、それをすぐに削除し、全体のタンク内の水を交換してください。 </li></ol></li></ol> 4。組織採取<ol><li>ハロゲンライト治療の発症後48時間は、治療エリアから魚を取り外す。 <ol><li>新鮮なエタノールホルムアルデヒド固定液（1部37％ホルムアルデヒド、9部100％エタノール）を準備。 </li><li> 2 - フェノキシエタノールの麻酔過剰投与（0.4 mg / Lで）とゼブラフィッシュを安楽死させる。 </li><li>ペーパータオルに安楽死させたゼブラフィッシュを転送します。湾曲したピンセットを使って目を摘出。 </li><li> 4℃で固定し、店O / Nで除核の目を置き</li></ol></li><li>目をCryoprotect。 <ol><li>室温で30分間、5％スクロースを1×PBSで目を洗い、その後に置き換える2時間のために新鮮な5％蔗糖1X PBS。次に、4℃で30％のショ糖1X PBS O / Nで目を洗う4℃で組織凍結培地、30％ショ糖1X PBS O / Nの1:1（等分）で目を洗う</li></ol></li><li> -80℃で100％の組織凍結培地や店舗で目を埋め込む℃にオリエント組織の凍結切片を腹/背軸上で実行されるように、目。 </li><li>スライドガラス上の凍結切片組織と場所。 55℃で2時間のためのウォームスライド-80°Cまたは直後にストアスライドは、標準的な免疫組織化学を行う。 </li><li>蛍光顕微鏡40,51と切片の組織および画像上の標準的な免疫組織化学を実行します。 </li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここでは、広範な光受容体の損失や堅牢な再生レスポンスの継続明るい光露光結果と短い紫外線照射を組み合わせることを示している。個人LIRDの方法と比較して、この結合方法は、また、網膜の両方の半分にロッドとコーンの両方を損傷するための最も効果的なプロトコルです。重要なことに、この処置は、着色された動物と同様に、 アルビノ動物において効果的である。 我々はより広範囲かつ一貫性のある損傷を合わせプロトコルの結果は個々のLIRD方法と比較しているという証拠を提供しますが、科学的な考察はLIRDパラダイムを選択する前に議論されるべきである。我々のデータは、全体の網膜組織（ すなわちプロテオミクス、リアルタイムPCR）分析のために収集されたときに合成法が利用されるべきことを示唆している。私達は結合された方法は、ハロゲン暴露が続く最大の病変の大きさ、そして最後にUV照射を持っていたことが分かった。我々は提案します示差桿体と錐体の再生を行うことができる遺伝子または経路を調査する際に組み合わせる方法を用いることもできる。これは実用的な理由のために可能でない場合、我々の...

光誘起網膜変性（LIRD）は、一般的にげっ歯類および損傷ロッドと錐体光受容体にゼブラフィッシュの両方で使用されています。成体ゼブラフィッシュでは、光受容体の変性は、細胞周期を再入力し、過渡増幅前駆細胞を生成するためにミュラーグリア細胞をトリガします。これらの前駆細胞は、彼らが最終的に新たな光受容体を生じさせる損傷領域への移行として増殖し続けています。現在、二広く使用されLIRDパラダイム、各々の再生応じて感光体の損失と対応する差異の程度の差が生じる。がある多くの遺伝的および薬理学的ツールは、再生時のその他の個々の遺伝子の役割をテストすることが可能であるので、堅牢なLIRDパラダイムを開発する必要がある。ここで我々は2以前に確立LIRD技術の使用を組み合わせているロッドとコーン光受容体の両方の広範かつ一貫性のある損失の結果そのLIRDプロトコルを記述します。さらにこのプロトコルはLIRD研究のためのアルビノ背景に関心のあるトランスジェニック系統を維持する必要がなくなり着色された動物における使用のために拡張することができる。

<table><tbody><tr><td>UV光源</td><td>ライカ</td><td>EL600</td><td></td></tr><tr><td>ガラスシャーレ (150×20mm)</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS3160152BO</td><td></td></tr><tr><td>250ml ガラスビーカー</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS1000250</td><td></td></tr><tr><td>4Lガラスビーカー</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS10004L</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイ</td><td>ル Fisher</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>250W ハロゲンランプ</td><td>ワークフォース</td><td>265-669</td><td></td></tr><tr><td>1.8 L 透明アクリルタンク</td><td>アクアニアリング</td><td>ZT180T</td><td></td></tr><tr><td>1.8 L 透明アクリルタンク蓋</td><td>アクアニアリング</td><td>ZT180LCL</td><td></td></tr><tr><td>ファン</td><td>ハネウェル</td><td>HT-900</td><td></td></tr><tr><td>エアレーター</td><td>テトラ</td><td>77853-900</td><td></td></tr><tr><td>温度計</td><td>コールパーマー</td><td>YO-08008-58</td><td></td></tr><tr><td>ベント鉗子 (5/45)</td><td>ワールド精密機器</td><td>504155</td><td></td></tr></tbody></table>

大人のゼブラフィッシュにおける網膜再生研究で使用するための新規な光ダメージパラダイム

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

光誘起網膜変性（LIRD）は、一般的にげっ歯類および損傷ロッドと錐体光受容体にゼブラフィッシュの両方で使用されています。成体ゼブラフィッシュでは、光受容体の変性は、細胞周期を再入力し、過渡増幅前駆細胞を生成するためにミュラーグリア細胞をトリガします。これらの前駆細胞は、彼らが最終的に新たな光受容体を生じさせる損傷領域への移行として増殖し続けています。現在、二広く使用されLIRDパラダイム、各々の再生応じて感光体の損失と対応する差異の程度の差が生じる。がある多くの遺伝的および薬理学的ツールは、再生時のその他の個々の遺伝子の役割をテストすることが可能であるので、堅牢なLIRDパラダイムを開発する必要がある。ここで我々は2以前に確立LIRD技術の使用を組み合わせているロッドとコーン光受容体の両方の広範かつ一貫性のある損失の結果そのLIRDプロトコルを記述します。さらにこのプロトコルはLIRD研究のためのアルビノ背景に関心のあるトランスジェニック系統を維持する必要がなくなり着色された動物における使用のために拡張することができる。

上述光治療プロトコルはLIRDの個々の方法と比較した。暗い処置成体動物のアルビノ （ 図3-5）において、個々の光治療が重要なロッドの損失（ 図3）とコーン（ 図4）感光体が得られた。ただし、両方の個々の治療は、主に比較的軽い治療（ 図3及び図4）から保護腹側網膜を残して、網膜の背側半分に感光体が損傷している。また、ハロゲンライトの治療と比較して、紫外線治療は、網膜の背側半分（それぞれ、Cと図4Bを比較）より錐体が破損。 UVおよびハロゲン光トリートメントを組み合わせることで、主にn個を排除し、網膜全体の桿体と錐体光受容体の両方に有意に大きな損失をもたらした網膜の腹側（ 図3および図4）のeuroprotection。合成光治療プロトコルを用いた場合、個々のLIRDの方法と比較し、増殖の増加に対応するも、腹側網膜におい...

多重光損傷プロトコルが損傷光受容体に記述され、その結果、成体ゼブラフィッシュ網膜再生の応答を誘導しています。このプロトコルは、着色された動物は、その損害賠償の全体にわたる網膜桿体と錐体光受容体の大部分を使用することができる改良された方法を説明します。

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

この手順の全体的な目的は、以前に報告された2つの光誘発性網膜変性プロトコルを組み合わせることで、網膜全体の桿体および錐体光受容体の両方を損傷させることです。まず、暗順応させた成魚のゼブラフィッシュに30分間UV光を照射します。次に、UV処理した魚を、4つの250 Wハロゲンランプに囲まれた水槽に直ちに移動させ、最大4日間連続光に曝露させます。最終ステップとして、魚を安楽死させ、さらなる解析のために眼球から核を採取します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いて、網膜全体で桿体および錐体光受容体の両方が一貫して消失していることを示します。UV光照射やハロゲンランプ照射のような既存の手法に対する本手法の主な利点は、これら2つの方法を組み合わせることで、網膜全体の桿体および錐体光受容体の両方を切除できる点にあります。光受容体への損傷は広範な増殖反応を誘導し、最終的に失われた光受容体の再生をもたらします。この手法の実演は、私の研究室の大学院生であるJennifer Thomasが行います。まず、スタンドとして使用するために直径15 centimeterのガラス製ペトリ皿を逆さまに置き、UV光照射のために実験台にテープで固定します。蛍光立体顕微鏡からUVライトフィラメントを取り出します。次に、倒立させたペトリ皿の上にUVライトフィラメントをテープで固定し、フィラメントの端がペトリ皿から約2 mm はみ出すようにします。その後、250 mL ガラスビーカーの底面、側面、および背面の半分をアルミホイルで覆い、ホイルの光沢面がビーカーの内側を向くようにしてください。次に、ビーカーに魚類飼育施設システムからの水を100 milliliters入れます。このビーカーを4 literのビーカーの中に配置します。その後、250 milliliterビーカーの100 milliliterの水位線と揃うまで、4 literビーカーに水を満たします。最大10匹の暗処処理した魚を250 milliliterビーカーに入れ、250 milliliterビーカーを小さなアルミホイルで覆います。次に、ビーカー装置全体をUVフィラメントの直近に配置します。フィラメントは4 literビーカーの外側に接触させ、250 milliliterビーカーの露出部分に向けます。250 mLビーカーが4 Lビーカーの底面の中央に配置されていることを確認します。その後、4 Lビーカーの後方に大きな不透明のスクリーンを設置し、動物に光が当たる状態を維持しつつ、実験担当者がUVフィラメントの先端を見ないようにします。次に、UV電源をオンにします。タイマーを30分に設定し、不注意な研究者が誤ってUV放射線に曝露されないよう、必要な警告ラベルを掲示します。30分後、UV電源を切ります。その後、魚が入った250 milliliterのビーカーを取り出します。この手順では、魚を250 milliliterのビーカーから1.8 literの透明アクリル製水槽に移動させます。次に、水槽のオーバーフローマークまで水を満たし、ハロゲンランプによる光照射エリアを設置します。250 Wのハロゲンユーティリティランプ2本を、水槽から29 centimeters離して同じ方向に向けて配置します。次に、同様の方法で反対側にも2つのランプを設置し、2組のランプの間隔を約73 cmに設定します。その後、光処理エリアのすぐ外側で、2組のランプの中間点に扇風機を配置します。続いて、光処理エリアの中心で、2組のランプから等距離の位置に、水を満たした1.8 Lタンク2個を設置します。次に、各タンクにエアレーション用の酸素供給装置を設置します。各タンクを透明なアクリル製の蓋で覆い、ファンに最も近い端に2 cmの隙間を空けます。この隙間に空気が吹き込むようにファンを配置し、1つまたは両方のタンクに温度計を設置します。次に、照明、ファン、およびエアレーションの電源を入れます。光照射処理を最大4日間維持してください。光照射中に魚に餌を与えないでください。餌を与えると水質に影響し、動物へのストレスが増大するためです。毎日、温度と水位を監視し、温度を30～33°Cに維持してください。必要に応じて、ファンの速度やタンクと照明の距離を調整します。また、毎日各タンクにシステム用水を補充してください。ハロゲン光照射を開始してから48時間後、魚を照射エリアから取り出します。次に、固定液として新鮮なエタノール固定液を準備し、トリオキセトール（Tricaine oxysulfate）を過剰投与してゼブラフィッシュを安楽死させます。その後、安楽死させたゼブラフィッシュをペーパータオルの上に移し、曲がったピンセットを用いて眼球を摘出します。核化された眼球と固定液を4°Cで一晩 cryo させておく。眼球を保護し、5% sucrose 含有 1x PBS で室温にて30分間洗浄する。その後、新鮮な5% sucrose含有1X PBSに交換し、眼球を2時間保持します。2時間後、眼球を30% sucrose含有1X PBSで4°Cにて一晩洗浄します。翌日、眼球を組織凍結保存液と30% sucrose含有1X PBSを1:1で混合した溶液にて、4°Cで一晩洗浄します。その後、眼球を背腹軸に合わせて100%組織凍結媒質に埋め込みます。次に、組織を凍結切片作成する前に、マイナス80°Cで少なくとも2時間保存します。これで組織を凍結切片にし、ガラススライドに貼付します。次に、スライドを55 °Cで2時間温めます。その後、スライドを-80 °Cで保存するか、直ちに標準的な免疫組織化学染色を行い、蛍光顕微鏡で撮影します。この図は、さまざまな光損傷パラダイム後の増殖応答の変化を示しています。これらは、成体アルビノゼブラフィッシュの網膜切片であり、PCNAで免疫標識して、異なる光損傷パラダイム後0時間における網膜の背側および腹側半分での細胞増殖（赤色で表示）を示しています。48 HLTでは、外顆粒層に増殖は見られませんでした。単一の前駆細胞が、背側網膜全体の内顆粒層（INL）および腹側網膜の一部に認められました。48 HPUVにおいて、背側網膜には前駆細胞のカラムが認められたが、腹側網膜のわずかな領域にのみ単一の前駆細胞が認められた。UVから48時間後には、背側および腹側網膜全体にわたって前駆細胞の大きなカラムが認められた。この図は、さまざまな光損傷パラダイム後の有色ゼブラフィッシュにおける桿体および錐体光受容体の消失を示しています。ここでは、各光損傷パラダイム後の網膜切片において、核を青色で示すためのPro threeによる染色、および桿体外節をマゼンタで示すためのzpr R three、または二重錐体をゴールドで示すためのzpr R oneによる免疫標識の結果を示しています。桿体光受容体核の有意な減少が、48 HLTでは背側網膜に、UV plus 48 HLTでは背側および腹側網膜に認められました。48 HPUVにおいて背側網膜の核に肥大が見られたが、48 HLTおよび48 HPUVではダブルコーン核の有意な減少は認められなかった。UBから8 H lt後には、背側および腹側網膜において核の有意な減少が認められた。本手順を、遺伝子特異的な薬理学的阻害剤やin vivoでのタンパク質ノックダウンなどの他の手法と組み合わせることで、個々の遺伝子が光受容体変性およびその後の再生反応に果たす役割を明らかにすることができる。

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局所レーザー損傷を用いたゼブラフィッシュの網膜変性および再生のモデル化

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