Name: 大人のゼブラフィッシュにおける網膜再生研究で使用するための新規な光ダメージパラダイム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-24T15:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学ぶ大人のゼブラフィッシュにおける網膜光ダメージ法。UV光とハロゲンランプを組み合わせて桿体と錐体の両方の光受容体を損傷させ、網膜再生メカニズムの研究に有用な新規パラダイムを確立する方法です。

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著者は、優れた魚の飼育と技術サポートのため西夏羅に感謝したいと思います。この作品は、健康補助R21EY019401（RT）とP30EY04068（RT）の国立研究所によって資金を供給し、ウェイン州立大学、眼科部門に失明を防止するための研究から無制限の助成金を含め、RTに資金を立ち上げました。 JTは、ウェイン州立大学大学院で提供されるトマスC.ランブルフェローシップによってサポートされていました。

このプロトコルで説明されているすべての手順は、医学のウェイン州立大学で動物使用委員会によって承認された。 1。暗順応<ol><li>転送〜ダークエンクロージャに通常の住宅システムから10成体アルビノまたは着色された魚。可能であれば、タンクを通じて通常の水の流れを可能にゼブラフィッシュ住宅モジュールに組み込まれている暗い筐体を使用しています。 （そのようなシステムが利用できない場合には、酸素と魚を通気することを確認し、完全に暗いエンクロージャ内に水槽を配置）。 </li><li> 10日間暗闇の中で魚を保管してください。動物を餌または暗箱に新しい魚を追加する場合は、光の長い期間に魚をさらす避けるためにできるだけ早く移動してください。 </li></ol> 2。 UV露光<ol><li> UV源の電源がOFFになっていることを確認してください。蛍光実体顕微鏡からの紫外線フィラメントを取り外します。 <ol><li>反転を使用してくださいUVフィラメント用のスタンドとして直径15cmのガラスシャーレ（または類似した2センチメートルの高さのようなもの）。実験台にシャーレテープ。 </li><li>反転したペトリ皿の上部にテープ紫外線フィラメント。フィラメント張り出し月末〜2ミリメートルペトリ皿になるよう配置します。 </li></ol></li><li> 250mlのガラスビーカーを取得します。背面アルミホイルでビーカーのカバー下部の½、側面、そして、箔の &quot;光沢のある&quot;側がビーカーの内側に面していることを確認する。ビーカーを卒業されている場合は、露出したビーカーの明確な半分を残して、ホイルでビーカーの文言の半分をカバーしています。 </li><li>魚施設システムから100mlの水で250mlのビーカーを埋める。 </li><li> 4リットルのビーカーに250mlのビーカーを置きます。水位が250mlのビーカーに100mlの水ラインと偶数​​になるまで水を4リットルのビーカーを埋める。 </li><li> 250mlのビーカーに10暗処置動物の最大値を追加します。アルミニウムの小片で250mlのビーカーをカバー箔。 </li><li> UVフィラメントに隣接全体ビーカー装置を置きます。フィラメントは、4 Lのビーカーの外側に触れると250ミリリットルのビーカーの露出部分に直面しなければならない。 250mlのビーカーを4 Lのビーカーの底の中心にいることを確認してください。 </li><li>露出する動物のためにできるように、しかし、UVフィラメントの先端を見てから、任意のラボ要員を防止、4Lビーカー背後に大規模な、不透明な画面を配置します。警告：この障壁はUV源の電源を入れる前に所定の位置にあることを確認してください。 </li><li> UV電源をオンにします。 30分のタイマーを設定します。どんな必要な警告ラベルは、その無防備なラボの担当者が誤って紫外線に自分自身を公開しないように置きます。 </li><li> 30分後、UV電源を遮断する。魚と250mlのビーカーを取り外します。注：UV暴露の複数回が必要な場合、露出プロトコルを繰り返す前（〜20分）電源がクールダウンしましょう​​。 Tを交換することを確認してください彼は各露光のために新鮮なシステム水で100mlの水。 4リットルのビーカー中の水を交換する必要はない。 </li></ol> 3。ハロゲンランプ露光<ol><li> 1.8 L明確なアクリルの魚飼育用の水槽に250mlのビーカーから魚を移す。オーバーフローマークに給油して下さい。 </li><li>ハロゲンランプ光処理領域を設定する。地元の金物屋からの4つの250 Wのハロゲンランプユーティリティを入手します。同じ方向に2つのランプに面しており、中央には別に29センチメートルを手配。同様の方法で、他の2つのランプを配置します。 <ol><li>彼らは、ランプの2つのセットの間の内〜73センチメートルを残して、ランプの第1のセットを対向されるようにランプの第2のセットを配置する。これは29×73センチメートルの長方形状の光治療領域を作成します。 </li></ol></li><li>地元の金物屋から小さなファンを得る。ちょうど光処理領域外、ランプの2つのセットの間の等距離のファンを配置します。 </li><li>の中心に水の完全な2 1.8 Lタンクを置きランプの2つのセットの間の等距離光処理領域。ランプ、タンクの外壁の間の距離は〜29 cmであるべきである。注：のみ1 1.8 Lタンクに10魚を治療する場合でも、このような構成を使用しています。両方のタンクは適切な範囲内で、各タンクの水の温度を維持するために必要とされる。 </li><li>各タンク内の酸素エアレーターを置きます。 </li><li>ファンに最も近い端で1〜2センチのギャップを残し、透明アクリル蓋と各タンクをカバーしています。それがこの隙間に空気を爆破するようにファンを配置します。タンクの一方または両方に温度計を配置する。 </li><li>ライト、ファン、エアレーターの電源をオンにします。最大4日間の光治療を維持する。これは動物に多くのストレスの水質と結果に影響を与えるような魚は、光治療中に供給されるべきではありません。 </li><li>日常的に温度と水位を監視します。 30-33で温度を維持℃に必要に応じて、ファンの回転速度および/またはタンク及びリチウムの間の距離を調整するghts。 <ol><li>必要に応じて、通常の毎日のシステム水で各タンクトップオフ。 </li><li>常に100％近くの生存率を維持するために、健康な成人ゼブラフィッシュ（通常生後6-9ヶ月）を使用します。魚は水槽で死体で発見された場合しかし、それをすぐに削除し、全体のタンク内の水を交換してください。 </li></ol></li></ol> 4。組織採取<ol><li>ハロゲンライト治療の発症後48時間は、治療エリアから魚を取り外す。 <ol><li>新鮮なエタノールホルムアルデヒド固定液（1部37％ホルムアルデヒド、9部100％エタノール）を準備。 </li><li> 2 - フェノキシエタノールの麻酔過剰投与（0.4 mg / Lで）とゼブラフィッシュを安楽死させる。 </li><li>ペーパータオルに安楽死させたゼブラフィッシュを転送します。湾曲したピンセットを使って目を摘出。 </li><li> 4℃で固定し、店O / Nで除核の目を置き</li></ol></li><li>目をCryoprotect。 <ol><li>室温で30分間、5％スクロースを1×PBSで目を洗い、その後に置き換える2時間のために新鮮な5％蔗糖1X PBS。次に、4℃で30％のショ糖1X PBS O / Nで目を洗う4℃で組織凍結培地、30％ショ糖1X PBS O / Nの1:1（等分）で目を洗う</li></ol></li><li> -80℃で100％の組織凍結培地や店舗で目を埋め込む℃にオリエント組織の凍結切片を腹/背軸上で実行されるように、目。 </li><li>スライドガラス上の凍結切片組織と場所。 55℃で2時間のためのウォームスライド-80°Cまたは直後にストアスライドは、標準的な免疫組織化学を行う。 </li><li>蛍光顕微鏡40,51と切片の組織および画像上の標準的な免疫組織化学を実行します。 </li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここでは、広範な光受容体の損失や堅牢な再生レスポンスの継続明るい光露光結果と短い紫外線照射を組み合わせることを示している。個人LIRDの方法と比較して、この結合方法は、また、網膜の両方の半分にロッドとコーンの両方を損傷するための最も効果的なプロトコルです。重要なことに、この処置は、着色された動物と同様に、 アルビノ動物において効果的である。 我々はより広範囲かつ一貫性のある損傷を合わせプロトコルの結果は個々のLIRD方法と比較しているという証拠を提供しますが、科学的な考察はLIRDパラダイムを選択する前に議論されるべきである。我々のデータは、全体の網膜組織（ すなわちプロテオミクス、リアルタイムPCR）分析のために収集されたときに合成法が利用されるべきことを示唆している。私達は結合された方法は、ハロゲン暴露が続く最大の病変の大きさ、そして最後にUV照射を持っていたことが分かった。我々は提案します示差桿体と錐体の再生を行うことができる遺伝子または経路を調査する際に組み合わせる方法を用いることもできる。これは実用的な理由のために可能でない場合、我々の...

光誘起網膜変性（LIRD）は、一般的にげっ歯類および損傷ロッドと錐体光受容体にゼブラフィッシュの両方で使用されています。成体ゼブラフィッシュでは、光受容体の変性は、細胞周期を再入力し、過渡増幅前駆細胞を生成するためにミュラーグリア細胞をトリガします。これらの前駆細胞は、彼らが最終的に新たな光受容体を生じさせる損傷領域への移行として増殖し続けています。現在、二広く使用されLIRDパラダイム、各々の再生応じて感光体の損失と対応する差異の程度の差が生じる。がある多くの遺伝的および薬理学的ツールは、再生時のその他の個々の遺伝子の役割をテストすることが可能であるので、堅牢なLIRDパラダイムを開発する必要がある。ここで我々は2以前に確立LIRD技術の使用を組み合わせているロッドとコーン光受容体の両方の広範かつ一貫性のある損失の結果そのLIRDプロトコルを記述します。さらにこのプロトコルはLIRD研究のためのアルビノ背景に関心のあるトランスジェニック系統を維持する必要がなくなり着色された動物における使用のために拡張することができる。

<table><tbody><tr><td>UV光源</td><td>ライカ</td><td>EL600</td><td></td></tr><tr><td>ガラスシャーレ (150×20mm)</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS3160152BO</td><td></td></tr><tr><td>250ml ガラスビーカー</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS1000250</td><td></td></tr><tr><td>4Lガラスビーカー</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS10004L</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイ</td><td>ル Fisher</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>250W ハロゲンランプ</td><td>ワークフォース</td><td>265-669</td><td></td></tr><tr><td>1.8 L 透明アクリルタンク</td><td>アクアニアリング</td><td>ZT180T</td><td></td></tr><tr><td>1.8 L 透明アクリルタンク蓋</td><td>アクアニアリング</td><td>ZT180LCL</td><td></td></tr><tr><td>ファン</td><td>ハネウェル</td><td>HT-900</td><td></td></tr><tr><td>エアレーター</td><td>テトラ</td><td>77853-900</td><td></td></tr><tr><td>温度計</td><td>コールパーマー</td><td>YO-08008-58</td><td></td></tr><tr><td>ベント鉗子 (5/45)</td><td>ワールド精密機器</td><td>504155</td><td></td></tr></tbody></table>

大人のゼブラフィッシュにおける網膜再生研究で使用するための新規な光ダメージパラダイム

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

光誘起網膜変性（LIRD）は、一般的にげっ歯類および損傷ロッドと錐体光受容体にゼブラフィッシュの両方で使用されています。成体ゼブラフィッシュでは、光受容体の変性は、細胞周期を再入力し、過渡増幅前駆細胞を生成するためにミュラーグリア細胞をトリガします。これらの前駆細胞は、彼らが最終的に新たな光受容体を生じさせる損傷領域への移行として増殖し続けています。現在、二広く使用されLIRDパラダイム、各々の再生応じて感光体の損失と対応する差異の程度の差が生じる。がある多くの遺伝的および薬理学的ツールは、再生時のその他の個々の遺伝子の役割をテストすることが可能であるので、堅牢なLIRDパラダイムを開発する必要がある。ここで我々は2以前に確立LIRD技術の使用を組み合わせているロッドとコーン光受容体の両方の広範かつ一貫性のある損失の結果そのLIRDプロトコルを記述します。さらにこのプロトコルはLIRD研究のためのアルビノ背景に関心のあるトランスジェニック系統を維持する必要がなくなり着色された動物における使用のために拡張することができる。

上述光治療プロトコルはLIRDの個々の方法と比較した。暗い処置成体動物のアルビノ （ 図3-5）において、個々の光治療が重要なロッドの損失（ 図3）とコーン（ 図4）感光体が得られた。ただし、両方の個々の治療は、主に比較的軽い治療（ 図3及び図4）から保護腹側網膜を残して、網膜の背側半分に感光体が損傷している。また、ハロゲンライトの治療と比較して、紫外線治療は、網膜の背側半分（それぞれ、Cと図4Bを比較）より錐体が破損。 UVおよびハロゲン光トリートメントを組み合わせることで、主にn個を排除し、網膜全体の桿体と錐体光受容体の両方に有意に大きな損失をもたらした網膜の腹側（ 図3および図4）のeuroprotection。合成光治療プロトコルを用いた場合、個々のLIRDの方法と比較し、増殖の増加に対応するも、腹側網膜におい...

多重光損傷プロトコルが損傷光受容体に記述され、その結果、成体ゼブラフィッシュ網膜再生の応答を誘導しています。このプロトコルは、着色された動物は、その損害賠償の全体にわたる網膜桿体と錐体光受容体の大部分を使用することができる改良された方法を説明します。

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

この手順の全体的な目的は、以前に報告された2つの光誘発性網膜変性プロトコルを組み合わせることで、網膜全体の桿体および錐体光受容体の両方を損傷させることです。まず、暗順応させた成魚のゼブラフィッシュに30分間UV光を照射します。次に、UV処理した魚を、4つの250 Wハロゲンランプに囲まれた水槽に直ちに移動させ、最大4日間連続光に曝露させます。最終ステップとして、魚を安楽死させ、さらなる解析のために眼球から核を採取します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いて、網膜全体で桿体および錐体光受容体の両方が一貫して消失していることを示します。UV光照射やハロゲンランプ照射のような既存の手法に対する本手法の主な利点は、これら2つの方法を組み合わせることで、網膜全体の桿体および錐体光受容体の両方を切除できる点にあります。光受容体への損傷は広範な増殖反応を誘導し、最終的に失われた光受容体の再生をもたらします。この手法の実演は、私の研究室の大学院生であるJennifer Thomasが行います。まず、スタンドとして使用するために直径15 centimeterのガラス製ペトリ皿を逆さまに置き、UV光照射のために実験台にテープで固定します。蛍光立体顕微鏡からUVライトフィラメントを取り出します。次に、倒立させたペトリ皿の上にUVライトフィラメントをテープで固定し、フィラメントの端がペトリ皿から約2 mm はみ出すようにします。その後、250 mL ガラスビーカーの底面、側面、および背面の半分をアルミホイルで覆い、ホイルの光沢面がビーカーの内側を向くようにしてください。次に、ビーカーに魚類飼育施設システムからの水を100 milliliters入れます。このビーカーを4 literのビーカーの中に配置します。その後、250 milliliterビーカーの100 milliliterの水位線と揃うまで、4 literビーカーに水を満たします。最大10匹の暗処処理した魚を250 milliliterビーカーに入れ、250 milliliterビーカーを小さなアルミホイルで覆います。次に、ビーカー装置全体をUVフィラメントの直近に配置します。フィラメントは4 literビーカーの外側に接触させ、250 milliliterビーカーの露出部分に向けます。250 mLビーカーが4 Lビーカーの底面の中央に配置されていることを確認します。その後、4 Lビーカーの後方に大きな不透明のスクリーンを設置し、動物に光が当たる状態を維持しつつ、実験担当者がUVフィラメントの先端を見ないようにします。次に、UV電源をオンにします。タイマーを30分に設定し、不注意な研究者が誤ってUV放射線に曝露されないよう、必要な警告ラベルを掲示します。30分後、UV電源を切ります。その後、魚が入った250 millilite

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条件付きで大人のゼブラフィッシュの網膜での標的タンパク質の発現をノックダウンする方法は、硝子体内アンチセンスモルフォを注入して網膜にそれらをelectroporating含まれ、説明されています。得られたタンパク質を再生成または無傷の網膜におけるタンパク質の役割をテストできるようになる、数日間ノックダウンされている。...

アダルトゼブラフィッシュ網膜にモルフォの in vivoエレクトロポレーションに

このビデオは、レーザー損傷を使用して成魚の網膜変性を誘発する手順を示しています。レーザーは網膜の光受容体細胞を標的とし、細胞死と変性プロセスを引き起こします。この損傷により、ミュラーグリア(MG)細胞が活性化され、網膜再生を助ける幹細胞前駆細胞への脱分化が起こります。...

局所レーザー損傷を用いたゼブラフィッシュの網膜変性および再生のモデル化

私たちは、成体のゼブラフィッシュの網膜神経節細胞(RGC)を逆行させる効率的な方法を紹介します。...

蛍光色素で大人のゼブラフィッシュの網膜神経節細胞の逆行性標識

神経学的および非神経疾患の多くのゼブラフィッシュモデルは成魚ではなく、胚/幼虫で研究されているため、我々は大人のゼブラフィッシュの疾患モデルに適用することができ、定量的側線再生アッセイを開発しました。アッセイは、1）感丘および2）個々の有毛細胞レベルでの解像度を含んだ。...

アダルトゼブラフィッシュ側線再生のためのアッセイ

ここで私たちは、網膜変性および再生及び成人のゼブラフィッシュにおけるN -メチル- N個の -nitrosoureaを使用して視覚機能への影響の定量化を実証する。視力の喪失や減少感光番号が内顆粒層での増殖が行われました。完全な形態学的および機能的な再生は、30日、最初の治療後に発生した。...

組織学的および機能的特性：メチルニトロソ尿素（MNU）は、網膜変性·再生ゼブラフィッシュでの誘発

ゼブラフィッシュ網膜再生は、主に固定した網膜を用いて研究されています。しかしながら、このようなinterkinetic核移行などの動的プロセスは、再生反応時に発生し、根底にあるメカニズムを調べるために生細胞イメージングを必要とします。ここでは、多光子顕微鏡を用いてリアルタイムにInterkinetic原子力移行（INM）を監視するために文化や撮影条件を説明します。...

多光子顕微鏡によるライブセルイメージングのための大人のトランスジェニックゼブラフィッシュ網膜外植片の文化

ゼブラフィッシュは、脊椎動物の網膜変性・再生のメカニズムを勉強する人気動物モデルです。このプロトコルでは、ローカライズされた外傷の内側の網膜に最小の被害で網膜の外側を中断することを誘導する方法について説明します。その後、我々 は生体内で網膜の形態と網膜再生を通してミュラー...

ゼブラフィッシュの再生モデルと網膜変性のレーザー誘起のミュラー グリア細胞の活性化

成体ゼブラフィッシュの機械的脳損傷モデルを用いて、ゼブラフィッシュの高い再生能力を調節する分子機構を調べることが記載されている。この方法は、蛍光免疫染色を用いて再生応答を評価するために、複数の種の小魚の視蓋に刺創損傷を作り出すことを説明している。...

ゼブラフィッシュとメダカを用いた成体視神経筋の刺創損傷モデルによる再生能力の比較解析

本プロトコールは、幼虫処理のための自動化されたマイクロ流体プラットフォームと組み合わせたレーザー病変システムを用いて、ゼブラフィッシュ幼虫において組織特異的かつ再現性の高い傷害を誘発する方法を記載する。...

ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄再生を研究するための制御された半自動レーザー誘発傷害

この記事では、網膜入力が視蓋の成長と発達にどのように影響するかを調査するための第一歩として、生きているゼブラフィッシュの幼虫から外科的に目を取り除く方法について説明します。さらに、この記事では、幼虫の麻酔、固定、および脳解剖に関する情報を提供し、続いて免疫組織化学および共焦点イメージングを行う。...

生きているゼブラフィッシュ幼虫の眼球除去による神経支配依存性の成長と視覚系の発達を調べる

このプロトコルは、トランスジェニックゼブラフィッシュモデルを用いて網膜色素上皮(RPE)を遺伝的にアブレーションする方法論を記載している。薬理学的化合物を用いたシグナル伝達経路調節を組み込むようにプロトコルを適応させることは、広範囲に詳述されている。色素沈着に基づいてRPE再生を定量化するためのMATLABプラットフォームが開発され、提示され、議論される。...

ニトロレダクターゼ/メトロニダゾール媒介アブレーションとゼブラフィッシュ網膜色素上皮の再生を研究するためのMATLABプラットフォーム(RpEGEN)

学ぶ大人のゼブラフィッシュにおける網膜光ダメージ法。UV光とハロゲンランプを組み合わせて桿体と錐体の両方の光受容体を損傷させ、網膜再生メカニズムの研究に有用な新規パラダイムを確立する方法です。

大人のゼブラフィッシュにおける網膜再生研究で使用するための新規な光ダメージパラダイム

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