大人のゼブラフィッシュにおける網膜再生研究で使用するための新規な光ダメージパラダイム

この手順の全体的な目的は、以前に報告された2つの光誘発性網膜変性プロトコルを組み合わせることで、網膜全体の桿体および錐体光受容体の両方を損傷させることです。まず、暗順応させた成魚のゼブラフィッシュに30分間UV光を照射します。次に、UV処理した魚を、4つの250 Wハロゲンランプに囲まれた水槽に直ちに移動させ、最大4日間連続光に曝露させます。

最終ステップとして、魚を安楽死させ、さらなる解析のために眼球から核を採取します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いて、網膜全体で桿体および錐体光受容体の両方が一貫して消失していることを示します。UV光照射やハロゲンランプ照射のような既存の手法に対する本手法の主な利点は、これら2つの方法を組み合わせることで、網膜全体の桿体および錐体光受容体の両方を切除できる点にあります。

光受容体への損傷は広範な増殖反応を誘導し、最終的に失われた光受容体の再生をもたらします。この手法の実演は、私の研究室の大学院生であるJennifer Thomasが行います。まず、スタンドとして使用するために直径15 centimeterのガラス製ペトリ皿を逆さまに置き、UV光照射のために実験台にテープで固定します。

蛍光立体顕微鏡からUVライトフィラメントを取り出します。次に、倒立させたペトリ皿の上にUVライトフィラメントをテープで固定し、フィラメントの端がペトリ皿から約2 mm はみ出すようにします。その後、250 mL ガラスビーカーの底面、側面、および背面の半分をアルミホイルで覆い、ホイルの光沢面がビーカーの内側を向くようにしてください。

次に、ビーカーに魚類飼育施設システムからの水を100 milliliters入れます。このビーカーを4 literのビーカーの中に配置します。その後、250 milliliterビーカーの100 milliliterの水位線と揃うまで、4 literビーカーに水を満たします。

最大10匹の暗処処理した魚を250 milliliterビーカーに入れ、250 milliliterビーカーを小さなアルミホイルで覆います。次に、ビーカー装置全体をUVフィラメントの直近に配置します。フィラメントは4 literビーカーの外側に接触させ、250 milliliterビーカーの露出部分に向けます。

250 mLビーカーが4 Lビーカーの底面の中央に配置されていることを確認します。その後、4 Lビーカーの後方に大きな不透明のスクリーンを設置し、動物に光が当たる状態を維持しつつ、実験担当者がUVフィラメントの先端を見ないようにします。次に、UV電源をオンにします。

タイマーを30分に設定し、不注意な研究者が誤ってUV放射線に曝露されないよう、必要な警告ラベルを掲示します。30分後、UV電源を切ります。その後、魚が入った250 milliliterのビーカーを取り出します。

この手順では、魚を250 milliliterのビーカーから1.8 literの透明アクリル製水槽に移動させます。次に、水槽のオーバーフローマークまで水を満たし、ハロゲンランプによる光照射エリアを設置します。250 Wのハロゲンユーティリティランプ2本を、水槽から29 centimeters離して同じ方向に向けて配置します。

次に、同様の方法で反対側にも2つのランプを設置し、2組のランプの間隔を約73 cmに設定します。その後、光処理エリアのすぐ外側で、2組のランプの中間点に扇風機を配置します。続いて、光処理エリアの中心で、2組のランプから等距離の位置に、水を満たした1.8 Lタンク2個を設置します。

次に、各タンクにエアレーション用の酸素供給装置を設置します。各タンクを透明なアクリル製の蓋で覆い、ファンに最も近い端に2 cmの隙間を空けます。この隙間に空気が吹き込むようにファンを配置し、1つまたは両方のタンクに温度計を設置します。

次に、照明、ファン、およびエアレーションの電源を入れます。光照射処理を最大4日間維持してください。光照射中に魚に餌を与えないでください。餌を与えると水質に影響し、動物へのストレスが増大するためです。

毎日、温度と水位を監視し、温度を30～33°Cに維持してください。必要に応じて、ファンの速度やタンクと照明の距離を調整します。また、毎日各タンクにシステム用水を補充してください。

ハロゲン光照射を開始してから48時間後、魚を照射エリアから取り出します。次に、固定液として新鮮なエタノール固定液を準備し、トリオキセトール（Tricaine oxysulfate）を過剰投与してゼブラフィッシュを安楽死させます。その後、安楽死させたゼブラフィッシュをペーパータオルの上に移し、曲がったピンセットを用いて眼球を摘出します。

核化された眼球と固定液を4°Cで一晩 cryo させておく。眼球を保護し、5% sucrose 含有 1x PBS で室温にて30分間洗浄する。

その後、新鮮な5% sucrose含有1X PBSに交換し、眼球を2時間保持します。2時間後、眼球を30% sucrose含有1X PBSで4°Cにて一晩洗浄します。翌日、眼球を組織凍結保存液と30% sucrose含有1X PBSを1:1で混合した溶液にて、4°Cで一晩洗浄します。

その後、眼球を背腹軸に合わせて100%組織凍結媒質に埋め込みます。次に、組織を凍結切片作成する前に、マイナス80°Cで少なくとも2時間保存します。これで組織を凍結切片にし、ガラススライドに貼付します。

次に、スライドを55 °Cで2時間温めます。その後、スライドを-80 °Cで保存するか、直ちに標準的な免疫組織化学染色を行い、蛍光顕微鏡で撮影します。この図は、さまざまな光損傷パラダイム後の増殖応答の変化を示しています。

これらは、成体アルビノゼブラフィッシュの網膜切片であり、PCNAで免疫標識して、異なる光損傷パラダイム後0時間における網膜の背側および腹側半分での細胞増殖（赤色で表示）を示しています。48 HLTでは、外顆粒層に増殖は見られませんでした。単一の前駆細胞が、背側網膜全体の内顆粒層（INL）および腹側網膜の一部に認められました。

48 HPUVにおいて、背側網膜には前駆細胞のカラムが認められたが、腹側網膜のわずかな領域にのみ単一の前駆細胞が認められた。UVから48時間後には、背側および腹側網膜全体にわたって前駆細胞の大きなカラムが認められた。

この図は、さまざまな光損傷パラダイム後の有色ゼブラフィッシュにおける桿体および錐体光受容体の消失を示しています。ここでは、各光損傷パラダイム後の網膜切片において、核を青色で示すためのPro threeによる染色、および桿体外節をマゼンタで示すためのzpr R three、または二重錐体をゴールドで示すためのzpr R oneによる免疫標識の結果を示しています。桿体光受容体核の有意な減少が、48 HLTでは背側網膜に、UV plus 48 HLTでは背側および腹側網膜に認められました。

48 HPUVにおいて背側網膜の核に肥大が見られたが、48 HLTおよび48 HPUVではダブルコーン核の有意な減少は認められなかった。UBから8 H lt後には、背側および腹側網膜において核の有意な減少が認められた。本手順を、遺伝子特異的な薬理学的阻害剤やin vivoでのタンパク質ノックダウンなどの他の手法と組み合わせることで、個々の遺伝子が光受容体変性およびその後の再生反応に果たす役割を明らかにすることができる。