バキュロウイルス発現系を用いた新規H7N9インフルエンザウイルス由来の機能組換えヘマグルチニンとノイラミニダーゼタンパク質の発現

この手順の全体的な目標は、免疫学的アッセイおよびワクチン接種実験のために、正しく折りたたまれた精製インフルエンザ、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ表面糖タンパク質を生成することです。これは、まずインフルエンザ遺伝子を運ぶ組換えBMidをクローニングし、続いて組換えバウラウイルスを作製することによって達成されます。第2のステップは、これらの組換えバウラウイルスを使用して、昆虫細胞でヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼタンパク質を発現させることです。

次に、アフィニティークロマトグラフィーを用いて細胞培養上清から組換えタンパク質を精製します。最後のステップは、これらのタンパク質を特性評価して、良好な品質と生物学的機能を確保することです。最終的に、組換えタンパク質は、インフルエンザウイルス表面の糖タンパク質に対する免疫応答を調べるために使用されます。

この技術の主な利点は、例えば、HAの細菌発現のような既存の方法よりも、免疫学的アッセイに全ウイルス調製物を使用するのではなく、精製された抗原が修正的に折り畳まれ、生物学的にも活性なままであることです。これらの試薬は、ヘマグルチニンおよび非ノイラミニダーゼタンパク質に対する免疫応答を測定することができます。層流フードプレート、SF 9昆虫細胞、6ウェルプレート、200、000細胞/平方センチメートルの密度で無菌的に働くテキストプロトコルに記載されているように、組換えバウラウイルスの生成からこのプロトコルを開始するだけです。

そして、CO2を含まない摂氏28度のインキュベーターに20分間座ってみましょう。次に、2マイクログラムの組換えバックミッドと100マイクロリットルのトリコレイア膝用培地製剤HINKまたはTNM fhを混合します。次に、6マイクロリットルのトランスフェクション剤と100マイクロリットルのTNM FH昆虫培地を混合します。

2つの容量を静かに混合し、トランスフェクション混合物を20分間放置します。室温で、トランスフェクション試薬を含むがDNAを含まない1つの模擬トランスフェクションをコントロールとして含めます。めっきしたSF nine細胞からSNATを取り出し、1%ペニシリンストレプトマイシン溶液を含む2ミリリットルの無血清TNM FH培地と交換します。.

トランスフェクション混合物の全量を細胞に加え、6ウェルプレートを5秒間慎重に揺さぶります。28°CのインキュベーターでCO2を含まない6時間インキュベートします。培地を新鮮なフルTNM FH培地と交換してから、プレートを同じ条件下で6日間インキュベートします。

時々顕微鏡で細胞を確認してください。通常、感染した細胞は大きく見えます。丸みを帯びた原子核が肥大し、剥離し始めます。

トランスフェクションの6日後に、2000 Gで室温で5分間遠心分離することにより、細胞を回収します。上清には組換えバウラウイルスが含まれており、すぐにワーキングストックを生成するために使用されるか、摂氏4度で何年も保存することができます。SDSページおよびウェスタンブロットでタンパク質発現を確認し、テキストプロトコールに記載されているようにワーキングストックを調製します。

SFナイン細胞は黄斑ウイルスの増殖を非常によくサポートします。しかし、大量の組換えタンパク質を分泌する能力は限られています。そこで、別の昆虫細胞株を使用します。

分泌された組換えタンパク質の発現のためのハイファイブ細胞。これらの細胞は、バロウイルスの高力価への増殖をサポートしませんが、非常に高い分泌能力を持っています。SFX昆虫細胞培養培地で、1日おきにT175平方センチメートルフラスコの通路でハイファイブ細胞を増殖させます。

それらを1対3の比率で分割します。5つのコンフルエントフラスコを育てて、200ミリリットルの発現培養物を採取し、ハイファイブ細胞に感染させます。まず、フラスコを軽くたたいてハイタッチセル

細胞懸濁液を回収し、50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。チューブを1200Gで室温で7分間回転させます。デカンテーションによって上清を取り除き、ペレットをresusによって結合し、15ミリリットルのP 3ストックに懸濁します。

細胞をフローフードに15分間置いておきます。200ミリリットルのハイクローンSFX培養培地を清潔な無菌1000ミリリットルのシェーカーフラスコに移します。次に、P 3セル懸濁液を滅菌アルミホイルでシェーカーフラスコシールに移し、70 RPMおよび摂氏28度で72〜96時間振とうします。

感染後72〜96時間でハイファイブ細胞発現上清から組換えタンパク質を採取すること。培養上清を500ミリリットルの遠心分離バケットに移します。5, 500 Gで4°Cで20分間回転させます。

その間に、シェーカーフラスコを二重蒸留水で3回すすいでください。次にピペット。3ミリリットルのニッケル樹脂スラリーを50ミリリットルのチューブに入れ、培養物200ミリリットルあたり45ミリリットルのPBSを入れます。

遠心分離後、3000 Gおよび室温で10分間遠心する前に、よく振とうします。PBSをデカントし、ペレットを保持します。昆虫細胞の上清をニッケル樹脂ペレットと混合し、すすぎ済みのシェーカーフラスコに移します。

4°Cで振とうしながら2〜4時間インキュベートします。次に、10ミリリットルのポリプロピレン製コラムをクランプに取り付けてサポートスタンドに取り付けます。両方のキャップを取り外し、カラムの下にビーカーを置いて、流れを集めます。

シェーカーフラスコのインキュベーション後、上清スラリー混合物をカラムに移し始めます。ニッケル樹脂を保持し、上澄み液のみが流れます。ボリューム全体を列に通します。

15ミリリットルの洗浄バッファーで樹脂を4回洗浄します。洗浄バッファーをカラムから排出し、キャップで下側を閉じます。2ミリリットルのエルシアンバッファーを追加し、5分間座ってみましょう。

カラムを開いてeitを回収し、可能な限り濡れた氷の上に置いておきます。これをさらに3回繰り返します。高濃度のタンパク質を含むEITは、通常、バッファーを交換してタンパク質を濃縮するために振とうすると泡を示します、最初にPBSを3000Gおよび摂氏4度で20分間フリースピンする15ミリリットル超ろ過遠心分離ユニット

スルーフローを破棄し、EITをスピンカラムにロードします。カラムに5ミリリットルの滅菌氷冷PBSを入れてから、同じ条件下で60分間回転します。流れを再び排出し、15ミリリットルの氷冷PBSを補充し、さらに60分間回転させます。

この手順をもう一度繰り返してから、高濃度の組換えタンパク質を表すバッファー交換濃縮物を回収します。濃縮物は常に氷の上に置いてください。スピンカラムを400マイクロリットルの滅菌氷冷PBSですすぎ、これを濃縮物に加えます。

次いで、タンパク質は、テキストプロトコールに記載されているように特徴付けることができます。ENUE株と上海株で発現したHAタンパク質とNAタンパク質は、上海で採取されたインフルエンザAの0.2ミリグラム/リットルからインフルエンザの0.7ミリグラム/リットルまで、中程度の発現レベルを示しました。エヌエで採取されたA、ノイラミニダーゼまたはNA分子は、上海で採取されたインフルエンザAの0.2ミリグラム/リットルの培養から、エヌエで採取されたインフルエンザAの0.7ミリグラム/リットルまで、中程度の発現レベルを示しました。

4種類のタンパク質調製物すべてに不純物がほとんどまたはまったく含まれておらず、haはnasよりも純度が高く、これは発現レベルによって説明できます。上海HAで採取したインフルエンザAを、ELI SAと広範囲中和茎反応性ヒトモノクローナル抗体CR9 1 1 4を用いてさらに分析した。このモノクローナル抗体は、青色で示されているように、ストックドメインの感度の高い確認エピトープに結合し、このドメインを正しくフォールディングするためのプローブとして使用されます。

この抗体は、490ナノメートルでの吸光度の増加からも明らかなように良好な結合を示しており、HAが実際に正しく折り畳まれているという確信が持てます。第2に、サブタイプ7の抗ヘマグルチニンマウスポリクローナル血清を用いたイライザを行なったところ、得られたタンパク質がサブタイプ7由来のヘマグルチニンとして同一性を確認できた。このビデオを見れば、研究室で組換えインフルエンザウイルス、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼタンパク質を発現する方法を十分に理解することができます。

このプロセスは、他のウイルスまたは細胞膜タンパク質の発現にも有用である可能性があります。あなたの実験が頑張られることを願っています。