Name: ヒト骨格筋からの血管由来の多能前駆体の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 学ぶヒト骨格筋由来の血管多能前駆細胞単離法。コラゲナーゼ消化とFACSを用いて筋原性内皮細胞、周皮細胞、外膜細胞を同時に精製し、再生医療研究への応用可能性を示す。

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著者らは、フローサイトメトリーとの彼女の優れた技術支援のためのアリソンロガールに感謝したい。この作品は、カザフスタン共和国（AS）の国防総省（JH）、ヘンリー·J·マンキン寄附（JH）、および文部科学省科学からの助成金によってサポートされていました。 CWCは、米国心臓協会の博士号を取得する前のフェローシップ（11PRE7490001）によって部分的にサポートされていました。 M.Corselliは再生医療の訓練助成金のためのカリフォルニア工科大学（TG2-01169）によってサポートされていました。

1筋生検の処理<ol><li>ダルベッコ改変イーグル培地、5％ウシ胎児血清（FBS）を補足し（DMEM）中で、氷上で、ヒト骨格筋生検を維持する1％ペニシリン - ストレプトマイシン輸送時（P / S）。 </li><li>筋生検の受領後、輸送容器から検体を除去し、無菌条件下で、2％抗生物質 - 抗真菌溶液（A / A）を添加したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で二回洗浄する。 </li><li> 2％A / Aを添加したDMEM中の無菌のハサミとピンセットで付属脂肪および結合組織を除去します。 </li><li>解剖顕微鏡下で大血管を削除し、その後に小さな断片に筋肉標本をカット（&lt;サイズが1cm 2）。 </li><li> 20ミリリットル保存培地におけるカット筋片（&lt;5グラム）を維持（PMを、DMEM、10％FBSおよび1％P / Sを補充した）、5日間まで4℃で。 </li></ol> 2マッスルDissociatイオンと細胞単離<ol><li>細胞単離の日に、PMから筋肉片を除去し、PBSで2回洗って、2％P / Sを補充した。消化溶液を作るために、新鮮に、PMにI型、II型、及びIV型コラゲナーゼ（100 mg / mlの）を追加します。 </li><li>細かくみじん切りにし、機械的に解決策のない凝固で10mlの血清学的ピペットを通過するまで、PM少量のペトリ皿中の滅菌ハサミや鉗子で筋肉の部分をミンチ。このプロセスの間に残留脂肪および結合組織を除去します。大人の筋肉の少なくとも8〜10グラムまたは各細胞を単離するための胎児の筋肉の2グラムを使用してください。 </li><li> 10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて消化溶液ofthe（10ミリリットル中にまたはミンチ胎児筋の2グラム）20mlに刻んだ大人の筋肉4-5グラムの転送します。 80rpmで - 70のオービタルシェーカー上で37℃で60分間 - 50のためのダイジェスト。それに応じて量に基づいて、消化時間および/または撹拌速度を調整することにより、細胞収量および表面抗原の保存を最適化組織の。濁りがほぼ透明になるまで消化の状態ごとに15〜20分を観察します。 </li><li>激しく消化された組織を10ミリリットルの血清学的ピペットで3〜5回ピペット。反応を停止した後、4分間400×gで遠心分離するPMの等しい量を追加します。 </li><li>注意深く上清を除去し;洗浄するために10ミリリットルのPMでペレットを再懸濁した後、100μmのセルストレーナーで濾過した。 </li><li> 4分間400×gで遠心分離し、上清を注意深く取り除きます。赤血球溶解緩衝液（155 mMの塩化アンモニウム、10mMのKHCO 3、0,1mM EDTA）に再懸濁ペレットを、単一細胞懸濁液を得るために、70μmのセルストレーナーでろ過した後、室温で10分間インキュベートする。いずれの沈殿が観察された場合には、再度70-mセルストレーナーを通して濾過する。 </li><li> 4分間400×gで遠心し、0.5 mlのPBS中に細胞ペレットを再懸濁します。セルの数をカウントします。細胞選別のために少なくとも5万個の細胞の総数を取得します。 SINGLを希釈染色のためPBSで1mlあたり5未満百万個の細胞に電子細胞懸濁液。対照染色（非染色コントロール、ネガティブコントロール、および単一色陽性対照）のための11のチューブに細胞懸濁液とスプリットの50〜100μLを取り出します。 </li></ol> 3細胞標識およびソート<ol><li>必要に応じて目的を阻止するためのマウス血清（PBS中に希釈1:10）での4℃で10分間の単一細胞懸濁液をインキュベートする。 </li><li>単一細胞懸濁液にし、4℃で20分間インキュベート：CD34-APC、CD45-APC-Cy7で、CD56-PE-Cy7で、CD144-PE、およびCD146-FITC（100すべて1）を追加します。ネガティブコントロールのために、APC-、APC-Cy7-、PE-Cy7-、PE-およびFITC結合アイソタイプのIgG抗体の同等の濃度を追加し、4℃で20分間インキュベートする。単色陽性対照のために、個別に各チューブに、CD34-APC、CD45-APC-Cy7で、CD56-PE-Cy7で、CD144-PE、およびCD146-FITCと同等の濃度を追加し、4℃で20分間インキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、4分間400×gで遠心分離器は、洗浄する。 5％FBSおよび1％P / Sを補充した2mlのDMEM中1 - で細胞ペレットを再懸濁する。細胞懸濁液の最終濃度は、1ml当たり5未満万細胞であるべきである。 7-AAD（1：100）を追加し、死細胞の排除のために室温で15分間インキュベートする。陰性対照および単一色陽性対照のために0.5mlのDMEMで再懸濁した細胞ペレットを、5％FBSおよび1％P / Sを補充した。 </li><li>試験管フローサイトメトリーの丸底ポリスチレンフローにすべての細胞懸濁液を転送します。細胞収集チューブを準備し（：ACSの交流媒体のMECのためのMPM; EGM-2 PC用それぞれのチューブは、適切な培養液500μlで予め充填されている）。セルソーターに氷上で細胞懸濁液を輸送する。 </li><li>非染色対照、陰性対照、単一色の陽性対照、および主細胞懸濁液の順にセルソーター上で実行細胞懸濁液セルpを最大にするために厳密にゲーティングレーザー強度、チャネル補償、および細胞集団を調整しながらurity（フローサイトメトリーの詳細についてはJoveの及びその他の学術誌によって発表された論文を参照してください）​​。 </li><li>適切な採血管において所望の細胞集団を収集します。 4℃で保存収集された細胞はすぐに播種されていない場合。 </li></ol> 4。後の仕分け細胞培養<ol><li> I型コラーゲンでプレコートしたプレート上にMPMイン/ cm 2で&lt;10,000細胞たてのソートのMEC（P0）をシード。のMECのその後の継代のために、3,500シード-でプレコーティングプレート/フラスコ上にMPMに4,000細胞/ cm 2の I型コラーゲン。 </li><li>たて0.2％ゼラチンでコーティングしたプレート上にEGM-2の&lt;20,000細胞/ cm 2でのたてソートのPC（P0）をシード。 PC培地中で3比P2まで定期的なポリスチレン培養プレート上に（20％のFBSおよび1％P / Sを補充したDMEM）：パソコンのその後の継代のために、1で細胞を分割する。 P3から以降は、種子細胞における6,500 -正規ポリスチレン培養プレート/フラスコ上にPC培地中7,000細胞/ cm 2。 </li><li>定期的なポリスチレン培養プレート上に（20％のFBSおよび1％P / Sを補充したDMEM）AC培地中で&lt;20,000細胞/ cm 2で新たにソートのAC（P0）をシードする。定期的なポリスチレン培養プレート/フラスコの上にAC培地中7,000細胞/ cm 2 - 6,500で、後続のACの継代、種子細胞について。 </li></ol>

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</ol>

J.H.は、上記の調査が実施された期間中に、コンサルティングサービスおよび技術ライセンスから受け取ったロイヤリティに対して、Cook MyoSite, Inc.から報酬を受け取りました。他のすべての著者には、開示すべき利益相反はありません。

hBVSC亜集団の同定および精製は、MSC個体発生の理解における大きな進歩を表している。 MSCの血管周囲起源および組織特異的前駆細胞および血管22-25の間の関連性を示す証拠が増えている。また、hBVSCsの均質な亜集団を単離するための能力は、さらに、MSCの不均一性および血管細胞生物学26の理解を助ける。 過去数年間で、のMEC、PC、およびACSは、個別に独立した研究での明確なプロトコルを使用して同定され、単離されている。しかし、試みは組織解離手順と全くのMEC、PC、およびACSを特定する選択的な細胞系統マーカーの組み合わせを最適化することにより、困難にヒト骨格筋から同時に3つのすべてのhBVSCサブセットを精製するなされていない。ここでは、同時purifを可能にする新しい細胞単離プロトコルを説明した組織解離プロセスを変更し、選択的な細胞表面マーカー（ 図1）の新たな組み合わせを適用することによって、単一のヒト筋生検からのMEC、PCなどのACのication。最高の成果のために、追加の注意を必...

ヒト骨格筋の幹/前駆細胞の臨床的に魅力的な供給源と考えられてきた。骨格筋は、コミットされた筋原前駆細胞、骨格筋芽細胞だけでなく、衛星細胞や筋肉由来幹細胞（MDSCを）1を含むプリミティブ筋原幹細胞だけでなく、含まれています。ヒト筋肉由来の幹/前駆細胞、自己または同種異系の使用は、再生医療において広範に前臨床動物モデルおよび臨床試験で検討されている。筋肉幹細胞/前駆細胞の再生アプリケーションは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）患者におけるジストロフィー再生筋肉から心臓発作の患者で負傷心臓を修復するまでの範囲である。 骨髄由来多能性成体前駆細胞（MAPCを）および脂肪由来幹細胞（ADSCの）、成体幹/を含む間葉系幹/間質細胞（MSC）と他の多能性前駆細胞集団の発見以来、前駆細胞は、広範囲の日付1-9に研究されてきた。それにもかかわらず、 その場での母国のアイデンティティと局在は遡及的単離法によって隠されています。最近では、蛍光活性化細胞選別（FACS）を使用して、私たちは他のグループは、将来に向かって特定されてきた血液ヒト骨格筋内の血管や他のいくつかの器官から精製された3多能前駆細胞集団：筋原内皮細胞（のMEC）、周皮細胞（パソコン）、および外膜細胞（ACS）10。内膜、中膜、および外膜：ヒト血液·血管由来幹細胞（hBVSCs）これらの3つの亜集団は、それぞれの血管の3の構造層で見つけることができます。 ACSは、より大きな動脈および静脈の外膜層に局在しながらより具体的には、のMECとPCは、微小血管および毛細血管で検出される。のMEC（C：各前駆細胞サブセットは、細胞表面抗原の独特な組合せを表すD34 + / 56 + / 144 + / 45 - ）、パソコン（CD146 + / 34 - / 45 - / 56 - ）、およびACS（CD34 + / 31 - / 45 - / 56 - / 146 - ）。 これらhBVSCサブセットのさらなる特徴付けは、すべての3つの前駆細胞集団は、骨格筋、骨、軟骨、および脂肪生成を含む典型的なMSCは、中胚葉に類似発達ポテンシャルを有することが明らかになった。すべてhBVSCサブセットはまた、CD44、CD73、CD90、およびCD105、たてや文化などの古典的なMSCのマーカーを呈する。集合的証拠のこれらの作品は、MSCの血管起源を支持した。また、のMEC、パソコン、およびACSの治療能力は、最近独立した研究で実証されている。成人の筋肉生検から選別のMECは、負傷したとジストロフィー骨格筋や修理負傷した心筋よりも効率的に骨格筋芽細胞と血管エンドを再生成することが示されたthelial細胞（EC）。異なるヒト器官から精製されたパソコンにも/修復し、損傷したとジストロフィー骨格筋を再生し、衛星細胞プール13-16に寄与することが示されている。ごく最近、私たちはヒト骨格筋から得られたPCを効果的に間接的なパラクリン作用と直接的な細胞間相互作用17を介して梗塞心筋を修復することを実証した。 ACSは、一方で、直接外植された血管から単離されているかまたはヒト脂肪組織および骨格筋からFACSによって精製した。のACの顕著な血管新生促進効果は、マウス後肢虚血モデル19で実証された。また、ACSはまた、虚血性組織修復20で、ACSの堅牢な治療の可能性を示して、より効率的に、従来のMSCより梗塞心筋を修復することが示されている。 同時現在の精製プロトコルの助成金、のMECの将来の精製、PC、および単一のヒト骨格筋生検の血管系からのAC。これは、私たちは勉強し、および/または個別の治療目的のための最適なhBVSC亜集団を選択することができます。さらに、この新しい手法は、更に、その再生医療のための多能性前駆細胞の理想的な供給源作り、ヒト骨格筋に由来することができる幹細胞/前駆細胞のレパートリーを拡大する。

<table><tbody><tr><td>コラゲナーゼ1型</td><td>Sigma</td><td>C5894</td><td>滅菌バイアル</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ2型</td><td>Sigma</td><td>C1764</td><td>滅菌バイアル</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ4型</td><td>Sigma</td><td>C1889</td><td>滅菌バイアル</td></tr><tr><td>抗ヒト CD34 APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>555824</td><td>無菌状態を保つ</td></tr><tr><td>抗ヒトCD45 APC-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557833</td><td>無菌</td></tr><tr>状態を保つ<td>反ヒトCD56 PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>557747</td><td>無菌状態を保つ</td></tr><tr><td>抗ヒト CD144 PE</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A07481</td> 無<td>菌状態を保つ</td></tr><tr><td>抗ヒト CD146 FITC</td><td>AbD セロテック</td><td>MCA2141F</td><td>無菌状態を保つ</td></tr><tr><td>FACS Aria II Flow Cytometer</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 完全培地</td><td>ロンザ</td><td>CC-3162</td><td>PCの培養用(P0のみ)</td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース (1X)、液体、L-グルタミン含有、ピルビン酸ナトリウムなし</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td>PC培養用</td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース (1X)、液体、L-グルタミン含有、ピルビン酸ナトリウム含有</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td>MECおよびACの培養用</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>熱不活化ウマ血清</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌薬 (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA 0.5% (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'カルシウムおよびマグネシウムのないPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>ひよこ胚抽出物</td><td>正確な化学</td><td>CE650T-10</td><td>使用前のフィルター</td></tr></tbody></table>

ヒト骨格筋からの血管由来の多能前駆体の単離

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

間葉系幹/間質細胞（MSC）の発見以来、ネイティブのアイデンティティおよびMSCの局在は、培養中の彼らの回顧分離によって隠されています。最近では、蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて、われわれおよび他の研究者が前向きにヒト骨格筋の血管系に関連付けられた多能性前駆細胞の三亜集団を同定および精製された。これらの3つの細胞集団：内膜、メディア、および外膜：筋原内皮細胞（のMEC）、周皮細胞（パソコン）、および外膜細胞（ACS）は、血管の3の構造層のそれぞれに局在​​している。すべてのこれらのヒト血管由来幹細胞（hBVSC）集団は古典のMSCマーカーを発現するだけでなく、典型的なのMSCに類似した中胚葉の発達ポテンシャルを有していないだけの。以前は、のMEC、PC、およびACSは別個のプロトコルを使用して単離され、その後独立した研究で特徴づけられている。現在の分離PROTocol、選択的な細胞表面マーカーの分離プロセスへの修正や調整を通じて、私たちは同時に単一のヒト筋生検からFACSによる3つのすべてのhBVSC亜集団を精製することができます。この新しい方法は、複数のBVSC亜集団の単離を効率化するだけでなく、明確な治療目的のためのhBVSCsの将来の臨床応用が容易になるだけでなく、。

FACSパラメータは、最初の未染色対照、陰性対照、及び単色陽性対照から得られたデータに基づいて補正される。死細胞を除外した後、蛍光標識された細胞懸濁液は、負および正の細胞表面マーカーの一連の選択に供される。まず、CD45 +細胞は、CD56 +前にゲートされており、CD56 -フラクション-細胞がCD45から分離される。 CD56 +画分は、さらに、CD34-CD144の選択に供した場合のみ、CD34 + / CD144 +（デュアル陽性）細胞のMECとしてマークされている（CD34 + / 56 + / 144 + / 45 - ）、続いて収集された（ 図1）。同様に、CD56 -画分は、さらに、CD34-CD146の選択に供した場合のみ、CD34 - / CD146 +のPCとしてマークされてい...

ヒト骨格筋内の血管は、再生アプリケーションに最適ですいくつかの多系列前駆体集団を保有する。内膜から筋原内皮細胞、培地から周皮細胞、および外膜から外膜細胞：この分離法は、血管の三つの構造層からそれぞれ3多能性前駆細胞集団の同時精製を可能にする。

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

本手順の全体的な目的は、単一の骨格筋生検検体からヒト血管由来多能性前駆細胞のサブセットを単離および精製することです。まず、筋生検検体を分散させ、コラゲナーゼタイプ1、2、および4の組み合わせを用いて消化します。次に、選択した細胞表面マーカーの組み合わせを認識する蛍光標識抗体を用いて、単一細胞懸濁液を標識します。その後、フローサイトメトリーによる蛍光活性化細胞分取（FACS）を行います。最適な細胞密度で、特定の培養条件下における分級後の細胞サブタイプを確認し、拡張させます。最終的に、精製された細胞の分級後解析、および培養された細胞サブセットのその後のフローサイトメトリーおよびR-T-P-C-R解析を用いて、これらの均質なBVSEサブセットの純度を証明します。この手法により、これらのラクダ間葉系幹細胞の起源を明らかにすることができます。多くの研究者がさまざまな組織から異なる種類の幹細胞を発見しています。そのため、本手法はそれら幹細胞の起源を明らかにできるだけでなく、血管周囲細胞やその他の血管由来細胞が組織の再生および修復において果たす役割を解明できると考えています。筋生検において、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。解離の手順を習得するのは困難な場合があります。コラゲナーゼ消化の技術的な詳細と最適化は、標的細胞の回収率と精製において非常に重要です。ヒト骨格筋生検試料は氷上で搬送してください。5% FBSおよび1%ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したDM Mを用い、無菌条件下で操作を行う。検体を2%抗生物質・抗真菌剤含有PBSで2回洗浄した後、2% aaを添加したdmsで洗浄する。付着している脂肪組織および結合組織を除去する。また、解剖顕微鏡下で太い血管を除去します。次に、筋肉標本を小さく切断します。サンプルを20 millilitersの保存液に移し、4 °Cで最大5日間保存します。細胞分離当日。筋肉片を取り出し、2% pen stripを含むPBSで2回洗浄する。次に、消化液を調製するため、type one、type two、およびtype fourコラゲナーゼをそれぞれ100 mg/mLずつPMに加える。最後に、筋肉片を少量のpmとともに細かく刻み、機械的にすり潰します。溶液を10 mLのセロロジカルピペットに通し、凝固がないことを確認してください。この過程で、残存する脂肪組織および結合組織を取り除きます。次に、成人のサンプルの半分を20 millilitersの消化液に、または胎児のサンプル全量を10 millilitersの消化液に移します。オービタルシェーカーを用いて70〜80 RPM、37 °Cで50〜60分間、サンプルを消化させます。15〜20分ごとに消化状態を確認してください。組織量に応じて消化時間または撹拌速度を適切に調整し、細胞回収率と表面抗原の保持を最適化してください。濁度がほぼ消失した時点で、消化した組織を3〜5回激しくピペッティングします。反応を停止させるため、同量のPMを加え、400 Gsで4分間遠心分離します。上清を慎重に取り除き、ペレットを洗浄するために10 mLのPMで再懸濁します。100 µmのセルストレーナーでろ過し、400 Gsで4分間遠心分離した後、上清を慎重に取り除いてください。次に、ペレットを赤血球溶血バッファーで再懸濁し、70 µmのセルストレーナーでろ過して単一細胞懸濁液を得ます。室温で10分間インキュベートした後、懸濁液を70 µmのセルストレーナーでろ過します。沈殿が観察される場合は、遠心分離によって細胞をペレット化し、再懸濁してください。0.5 mLのPBSに懸濁し、染色用の細胞数をカウントします。単一細胞懸濁液をPBSで希釈し、細胞濃度を1 mLあたり500万個未満にします。細胞懸濁液を50〜100 µLずつ分注し、未染色コントロール、ネガティブコントロール、およびシングルカラーポジティブコントロール用の計11本のチューブに分けます。必要に応じて、マウス血清を用いて4 °Cで10分間、単一細胞懸濁液をブロッキングします。実験計画に従って抗体溶液を添加し、4 °Cで20分間インキュベートする。遠心分離により細胞をペレット化し、死細胞除去のため、7-AADを1:100に希釈したPMで、最終細胞濃度が5 million cells/mLとなるように各サンプルペレットを1回洗浄し、ネガティブコントロールおよびシングルカラーポジティブコントロールについては室温で15分間インキュベートする。細胞ペレットを0.5 mLの希釈PMで再懸濁する。すべての細胞懸濁液を丸底ポリスチレン製フローサイトメトリーチューブに移します。次に、適切な回収用培地を500 µL入れた細胞回収チューブを準備します。細胞懸濁液を氷上で細胞まで運搬します。未染色コントロール、ネガティブコントロール、シングルカラーポジティブコントロール、そしてメインの細胞懸濁液の順にセルソーターで分取を行います。その際、細胞純度を最大化させるため、レーザー強度、チャンネル補正、および細胞集団のゲーティングを厳密に調整してください。目的の細胞集団を適切な回収チューブに回収し、回収した細胞は4 °Cで保存します。すぐに播種しない場合は、分取直後の細胞を使用してください。MPM含有培地を用いて、Type one collagenで事前コーティングしたプレートに筋原性内皮細胞を播種し、その後にECS seedをパッケージングします。タイプIコラーゲンでプレコートしたプレートまたはフラスコに、MPMを用いて1平方センチメートルあたり3,500〜4,000個の細胞を播種します。第1および第2継代では、0.2%ゼラチンを freshly コートしたプレートに、 freshly ソートした寄生虫をe gm twoで播種します。PC培地を用いて、細胞を1:3の比率で通常のポリスチレン培養皿に分割します。P3以降のプレートについて。PC培地を用い、通常のポリスチレン培養プレートに1平方センチメートルあたり6,500〜7,000個の細胞で播種します。フラスコについては、後続のACSシード細胞のパッキングのため、新鮮にソートされた冒険組織細胞をAC培地を用い、通常のポリスチレン培養プレートに1平方センチメートルあたり6,000〜7,000個の細胞で播種します。死細胞を除去した後、無染色コントロール、ネガティブコントロール、および単色ポジティブコントロールから得られたデータに基づいてフラスコのファクトパラメータを補正し、蛍光標識した細胞懸濁液に対して一連のネガティブおよびポジティブの細胞表面マーカー選択を行います。まず、CD 45陽性細胞をゲートアウトします。次に、CD 45陰性分画からCD 56陽性細胞とCD 56陰性細胞を分離します。CD 56陽性分画に対し、さらにCD 34およびCD 1 44による選択を行い、二重陽性細胞のみを筋原性内皮細胞として標識し、回収します。同様に、CD 56陰性分画に対し、さらにCD 34およびCD 1 46による選択を行い、CD 34陰性かつCD 1 46陽性の細胞のみを寄生虫として標識し、回収します。また、CD 34陽性かつCD 1 46陰性の分画に対し、内皮細胞を除去するためにさらにCD 31による陰性選択を行い、CD 34陽性かつCD 31陰性のサブセットのみをadv細胞として標識し、回収します。なお、内皮細胞の除去には、CD 31の代わりにCD 1 44を使用することも可能です。これらのH-P-V-S-Cサブセットは、単一ドナーの筋肉生検から精製されました。一般的な不均一な筋肉幹細胞とは異なり、ヒト血管由来幹細胞サブセットの培養物は、長期的に拡大させた後でも均一な状態を維持します。ご存知のように、研究者が当研究室で報告したこれらの血管由来幹細胞を単離するために、同じ手法を用いることは非常に重要であると考えています。このように、本手法を並行して提示することで、他の方が当社の結果を再現し、チーム間での結果を真に比較することが可能になると考えています。新鮮なヒト組織の取り扱いは非常に危険であることに十分ご注意ください。本手順を行う際は、ニトリル手袋の着用や保護メガネの装着などの予防措置を講じてください。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

フラスコに細胞の付着の速度に基づいて、筋骨格系の軟部組織から成体幹細胞を単離する。...

ソフト筋骨格組織から幹細胞を単離する

酵素的解離、線維/脂肪細胞とマウス骨格筋からの筋原性前駆細胞のフローサイトメトリーによる表面標識および精製方法。...

骨格筋からの前駆体の精製

誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の筋原性前駆細胞は、筋ジストロフィーを治療するための細胞治療戦略の有望な候補である。このプロトコルは、急性および慢性筋肉再生のマウスモデルにおけるiPSC由来メソアンジオ芽細胞(筋前駆体の一種)の生着および分化を評価するために必要な移植および機能的測定について記述する。...

筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植

体外培養系では 、脊椎動物の筋形成の理解に不可欠であることが分かっている。しかし、多くの、特に基底の分類群において、非哺乳動物の骨格筋の発達と成長について学んだことを残る。この組織を、筋原性前駆細胞（MPCは）の成体幹細胞を単離すること、及び初代培養の設定におけるそれらの自己再生、増殖、および分化を維持するための効率的かつ堅牢なプロトコルは、全体にわたって保存された発散の調節機構の同定を可能脊椎動物の系統。...

基礎脊椎動物の系統からの一次筋原前駆細胞/筋芽細胞培養液の調製

ここでは、ヒトの骨髄(hBM)から中胚葉前駆細胞（MPCs）を単離するための最適化された、再現性の高いプロトコルについて説明します。MPCは、フローサイトメトリーおよびネスチン発現によって特徴付けられました。その結果、血管新生能を保持しながら、指数関数的に増殖するMSC様細胞培養を生じさせる能力が示されました。...

ヒト骨髄から単離することMesangiogenic前駆細胞（MPCは）

人間の心臓組織は、心筋再生のために適切であり得る多能血管周囲の前駆細胞集団を保有します。ここに記載された技術は、ネイティブの血管に関連する2つの多能ストローマ細胞集団の同時単離および精製を可能にする、すなわち CD146 + CD34 -周皮細胞およびCD34 + CD146 -外膜細胞、ヒト心筋から。...

ヒト心臓組織からの血管周囲多能前駆細胞集団の単離

骨格筋 (MMEC) の微小血管内皮細胞筋毛細血管の内壁の形状し、両方を規制する流体/分子と筋肉組織と血液の間 (免疫) 細胞の移行の交換。前述のように、プライマリ マウス MMEC の分離により「myovascular...

プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

骨格筋生検組織から得られたヒト原発性筋前駆細胞(hMpAc)を分離、培養、特徴付け、分化する技術を提示する。これらの方法によって得られ、特徴付けられたhMpPCは、その後、ヒトの筋形成および骨格筋再生に関連する研究の質問に対処するために使用することができる。...

骨格筋生検手順からのヒト筋前駆細胞の単離、培養、特徴付け、分化

ヒト臍帯組織から間葉系幹細胞を単離し、骨格筋系統に分化させるためのプロトコルについて説明する。...

ヒト臍帯組織からの間葉系幹細胞の生成と骨格筋系統への分化

このプロトコルは、マウスの個々の骨格筋からの筋幹細胞および線維脂肪原性前駆細胞の単離について説明しています。このプロトコルには、単一筋解剖、蛍光活性化細胞選別による幹細胞の単離、免疫蛍光染色による純度評価、および5-エチニル-2'-デオキシウリジン取り込みアッセイによるS期侵入の定量的測定が含まれます。...

個々の骨格筋からの静止幹細胞集団の分離

このプロトコルは、組織解離、逐次ろ過、プレプレート処理、定義された培養条件を通じて、成体および新生マウスの骨格筋から一次筋芽細胞を単離・濃集する標準化された方法を提供し、衛星細胞由来の筋肉芽細胞培養の確立と維持を可能にし、下流の実験応用を可能にします。...

In vitro 筋形成研究のための骨格筋サテライト細胞の単離

学ぶヒト骨格筋由来の血管多能前駆細胞単離法。コラゲナーゼ消化とFACSを用いて筋原性内皮細胞、周皮細胞、外膜細胞を同時に精製し、再生医療研究への応用可能性を示す。

ヒト骨格筋からの血管由来の多能前駆体の単離

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