ヒト骨格筋からの血管由来の多能前駆体の単離

本手順の全体的な目的は、単一の骨格筋生検検体からヒト血管由来多能性前駆細胞のサブセットを単離および精製することです。まず、筋生検検体を分散させ、コラゲナーゼタイプ1、2、および4の組み合わせを用いて消化します。次に、選択した細胞表面マーカーの組み合わせを認識する蛍光標識抗体を用いて、単一細胞懸濁液を標識します。その後、フローサイトメトリーによる蛍光活性化細胞分取（FACS）を行います。

最適な細胞密度で、特定の培養条件下における分級後の細胞サブタイプを確認し、拡張させます。最終的に、精製された細胞の分級後解析、および培養された細胞サブセットのその後のフローサイトメトリーおよびR-T-P-C-R解析を用いて、これらの均質なBVSEサブセットの純度を証明します。この手法により、これらのラクダ間葉系幹細胞の起源を明らかにすることができます。

多くの研究者がさまざまな組織から異なる種類の幹細胞を発見しています。そのため、本手法はそれら幹細胞の起源を明らかにできるだけでなく、血管周囲細胞やその他の血管由来細胞が組織の再生および修復において果たす役割を解明できると考えています。筋生検において、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。

解離の手順を習得するのは困難な場合があります。コラゲナーゼ消化の技術的な詳細と最適化は、標的細胞の回収率と精製において非常に重要です。ヒト骨格筋生検試料は氷上で搬送してください。

5% FBSおよび1%ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したDM Mを用い、無菌条件下で操作を行う。検体を2%抗生物質・抗真菌剤含有PBSで2回洗浄した後、2% aaを添加したdmsで洗浄する。付着している脂肪組織および結合組織を除去する。

また、解剖顕微鏡下で太い血管を除去します。次に、筋肉標本を小さく切断します。サンプルを20 millilitersの保存液に移し、4 °Cで最大5日間保存します。

細胞分離当日。筋肉片を取り出し、2% pen stripを含むPBSで2回洗浄する。次に、消化液を調製するため、type one、type two、およびtype fourコラゲナーゼをそれぞれ100 mg/mLずつPMに加える。

最後に、筋肉片を少量のpmとともに細かく刻み、機械的にすり潰します。溶液を10 mLのセロロジカルピペットに通し、凝固がないことを確認してください。この過程で、残存する脂肪組織および結合組織を取り除きます。

次に、成人のサンプルの半分を20 millilitersの消化液に、または胎児のサンプル全量を10 millilitersの消化液に移します。オービタルシェーカーを用いて70〜80 RPM、37 °Cで50〜60分間、サンプルを消化させます。15〜20分ごとに消化状態を確認してください。

組織量に応じて消化時間または撹拌速度を適切に調整し、細胞回収率と表面抗原の保持を最適化してください。濁度がほぼ消失した時点で、消化した組織を3〜5回激しくピペッティングします。反応を停止させるため、同量のPMを加え、400 Gsで4分間遠心分離します。上清を慎重に取り除き、ペレットを洗浄するために10 mLのPMで再懸濁します。100 µmのセルストレーナーでろ過し、400 Gsで4分間遠心分離した後、上清を慎重に取り除いてください。

次に、ペレットを赤血球溶血バッファーで再懸濁し、70 µmのセルストレーナーでろ過して単一細胞懸濁液を得ます。室温で10分間インキュベートした後、懸濁液を70 µmのセルストレーナーでろ過します。沈殿が観察される場合は、遠心分離によって細胞をペレット化し、再懸濁してください。

0.5 mLのPBSに懸濁し、染色用の細胞数をカウントします。単一細胞懸濁液をPBSで希釈し、細胞濃度を1 mLあたり500万個未満にします。細胞懸濁液を50〜100 µLずつ分注し、未染色コントロール、ネガティブコントロール、およびシングルカラーポジティブコントロール用の計11本のチューブに分けます。必要に応じて、マウス血清を用いて4 °Cで10分間、単一細胞懸濁液をブロッキングします。

実験計画に従って抗体溶液を添加し、4 °Cで20分間インキュベートする。遠心分離により細胞をペレット化し、死細胞除去のため、7-AADを1:100に希釈したPMで、最終細胞濃度が5 million cells/mLとなるように各サンプルペレットを1回洗浄し、ネガティブコントロールおよびシングルカラーポジティブコントロールについては室温で15分間インキュベートする。細胞ペレットを0.5 mLの希釈PMで再懸濁する。

すべての細胞懸濁液を丸底ポリスチレン製フローサイトメトリーチューブに移します。次に、適切な回収用培地を500 µL入れた細胞回収チューブを準備します。細胞懸濁液を氷上で細胞まで運搬します。

未染色コントロール、ネガティブコントロール、シングルカラーポジティブコントロール、そしてメインの細胞懸濁液の順にセルソーターで分取を行います。その際、細胞純度を最大化させるため、レーザー強度、チャンネル補正、および細胞集団のゲーティングを厳密に調整してください。目的の細胞集団を適切な回収チューブに回収し、回収した細胞は4 °Cで保存します。

すぐに播種しない場合は、分取直後の細胞を使用してください。MPM含有培地を用いて、Type one collagenで事前コーティングしたプレートに筋原性内皮細胞を播種し、その後にECS seedをパッケージングします。

タイプIコラーゲンでプレコートしたプレートまたはフラスコに、MPMを用いて1平方センチメートルあたり3,500〜4,000個の細胞を播種します。第1および第2継代では、0.2%ゼラチンを freshly コートしたプレートに、 freshly ソートした寄生虫をe gm twoで播種します。PC培地を用いて、細胞を1:3の比率で通常のポリスチレン培養皿に分割します。

P3以降のプレートについて。PC培地を用い、通常のポリスチレン培養プレートに1平方センチメートルあたり6,500〜7,000個の細胞で播種します。フラスコについては、後続のACSシード細胞のパッキングのため、新鮮にソートされた冒険組織細胞をAC培地を用い、通常のポリスチレン培養プレートに1平方センチメートルあたり6,000〜7,000個の細胞で播種します。

死細胞を除去した後、無染色コントロール、ネガティブコントロール、および単色ポジティブコントロールから得られたデータに基づいてフラスコのファクトパラメータを補正し、蛍光標識した細胞懸濁液に対して一連のネガティブおよびポジティブの細胞表面マーカー選択を行います。まず、CD 45陽性細胞をゲートアウトします。次に、CD 45陰性分画からCD 56陽性細胞とCD 56陰性細胞を分離します。

CD 56陽性分画に対し、さらにCD 34およびCD 1 44による選択を行い、二重陽性細胞のみを筋原性内皮細胞として標識し、回収します。同様に、CD 56陰性分画に対し、さらにCD 34およびCD 1 46による選択を行い、CD 34陰性かつCD 1 46陽性の細胞のみを寄生虫として標識し、回収します。また、CD 34陽性かつCD 1 46陰性の分画に対し、内皮細胞を除去するためにさらにCD 31による陰性選択を行い、CD 34陽性かつCD 31陰性のサブセットのみをadv細胞として標識し、回収します。なお、内皮細胞の除去には、CD 31の代わりにCD 1 44を使用することも可能です。

これらのH-P-V-S-Cサブセットは、単一ドナーの筋肉生検から精製されました。一般的な不均一な筋肉幹細胞とは異なり、ヒト血管由来幹細胞サブセットの培養物は、長期的に拡大させた後でも均一な状態を維持します。ご存知のように、研究者が当研究室で報告したこれらの血管由来幹細胞を単離するために、同じ手法を用いることは非常に重要であると考えています。

このように、本手法を並行して提示することで、他の方が当社の結果を再現し、チーム間での結果を真に比較することが可能になると考えています。新鮮なヒト組織の取り扱いは非常に危険であることに十分ご注意ください。本手順を行う際は、ニトリル手袋の着用や保護メガネの装着などの予防措置を講じてください。