Name: FIBS対応の非侵襲メタボリック·プロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-03T15:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶFIBSを用いた非侵襲的メタボリックプロファイリング手法。遺伝子組み換えタンパク質バイオセンサーで細胞内グルコースやグルタミン濃度をリアルタイムに測定し、バイオプロセスの最適化と制御に活用できます。

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私たちは親切親切にグルタミンを供給するためのグルコースのFRETプラスミド博士ウーヴェLudewig（ホーエンハイム大学）をご提供するために教授ウルフフロン（科学カーネギー研究所、スタンフォード大学）に感謝pUTKan植物発現ベクターに構築FRET。 ABはBBSRC目標と重点Studentshipsプログラムによって資金を供給される。 CKとKPの両方がバイオ医薬品の処理にRCUKフェローシップでサポートされています。 CKはまた彼らの財政支援のためにロンザ生物製剤に感謝したい。合成生物学とイノベーションのためのセンターは、寛大にEPSRCによってサポートされています。

1。細胞株リバイバルとメンテナンス<ol><li> 8mMのL-グルタミンおよび10ml / L 100×ヒポキサン​​チン/チミジンサプリメント（完全増殖培地）を補充9ミリリットルCD-CHO培地中でCHO細胞を復活させる。 </li><li> 5分間100×gで遠心分離する。 </li><li>新鮮な完全増殖培地10mlに細胞を再懸濁。 </li><li> 1ミリリットルのサンプルを取り出して、血球計数器でパンブルー色素排除法を用いて光学顕微鏡により生細胞濃度を決定する。 </li><li> 125ミリリットル中に3×10 5細胞/ mlの播種密度で培養を開始するには、振盪フラスコ。 </li><li> 120 rpmで回転する軌道揺れプラットフォーム上で、37℃、5％CO 2の加湿雰囲気のインキュベーター内の文化を維持している。 </li><li> 2×10 5細胞/ mlの播種密度で完全増殖培地中で3〜4日ごとに継代培養する。 </li></ol> 2。プラスミドとC細胞株のトランスフェクションバイオセンサー遺伝子をontaining <ol><li>大規模プラスミド精製キットを用いてプラスミドDNAを調製する。 </li><li>細胞が活発にトランスフェクションの際に分裂していることを確認するために、適切な条件（37℃、5％CO 2）トランスフェクション前に12から24時間で細胞を維持する。 </li><li>トリパンブルー色素排除法を用いて細胞をカウントし、次いで、1×10 6細胞/ mlの濃度で振盪フラスコ中で125ミリリットルの細胞培養物を20mlの作業容量を準備する。 </li><li>使用中の細胞株について適切なトランスフェクションキットを使用してください。トランスフェクション試薬の比のプラスミドDNAは、細胞株およびベクターに依存するであろう。これは、この前の最終のトランスフェクションを実施し、製造業者によって指定された範囲内の比率の範囲をテストすることによって最適化されていることをお勧めします。また、少なくとも1つの負の対照細胞を含有する培養限定なしDNAを維持する。 </li><li>静的モードで4日間インキュベートした後、シャキに転送NGプラットフォームは、125 rpmで回転する。 </li><li>キル曲線によって決定された適当な濃度にプラスミド選択のための適切な抗生物質を追加します。本研究では、ゼオシンをトランスフェクトされた細胞の選択のための400μg/ mlの終濃度に添加した。 </li><li>対照ウェル中の細胞が死ぬまでは、抗生物質のたびに追加し、細胞株のための適切な時間間隔でメディアを変更。 </li><li>文化を振っに進行することが最もコンフルエント井戸を使用してください。 </li><li>凍結混合物1ml中10 7生存細胞を含有するクライオバイアル中に細胞を凍結することにより細胞バンクを確立する。この研究では、これは92.5％の増殖培地および7.5％ジメチルスルホキシドからなる。 </li></ol> 3。バッチおよび流加細胞の成長曲線<ol><li> 50ミリリットルの作業容量で振盪フラスコ250ミリリットル中のトランスフェクトされたCHO細胞の三連細胞培養を確立するために、上記の細胞の維持のための指示に従ってください。 </li><li> cultuを維持125 rpmで回転する軌道揺れプラットフォーム上でのCO 2 5％で37℃、の加湿細胞インキュベーターでRES、および24時間の間隔で、各成長培養物から4.1ミリリットルのサンプルを削除します。 </li><li>トリパンブルー色素排除法で生細胞濃度と細胞生存率を測定するために試料100μlを使用してください。 </li><li>生細胞濃度がゼロになるまで繰り返します。 </li><li>流加細胞培養は、それぞれ、36及び4mmの初期値にそれらの濃度を回復するために、6日目にグルコースまたはグルタミンの適切な量の補給のために繰り返します。なお、純水の同じ体積（ここでは12ml）で供給されるべき、追加の対照培養もまた維持されることが推奨される。 </li></ol> 4。比測定をFRET <ol><li> 4℃で5分間100×gで、上記のステップ3.2および遠心機で取り除か毎日サンプルの2ミリリットルを取る</li><li> Resusp氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）2ml中の細胞ペレットを終えた。 6穴プレートにこれを転送し、1ウェルに細胞を含まないブランクサンプルを追加します。 </li><li>すぐに435分の465ナノメートル（青）と510分の520ナノメートル（黄色）の435分の430 nmの波長と発光波長の励起波長で、青と黄色の蛍光のレベルを測定する。 </li><li> FRET比（検出された青色蛍光にわたって検出黄色の蛍光の比率）を計算します。 </li></ol> 5。代謝物アッセイ<ol><li> 4℃で5分間100×gで、上記のステップ3.2および遠心機で取り除か毎日サンプルの2ミリリットルを取る上清を取り除きます。 </li><li> 5分間100×gで再び3ミリリットルの氷冷PBSと遠心機で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>上清を除去し、上記のように3ミリリットルの氷冷PBSで細胞ペレットを再懸濁します。 15秒、15秒オフのパルスで3分間ずつのサンプル5Xを超音波処理。この時点で、余分な細胞必要に応じて、CTSは凍結することができる。 </li><li> （材料の表を参照）、細胞内のグルコース濃度を決定するために、細胞抽出物試料について、製造業者の指示に従って、適切なグルコースアッセイキットを使用する。 注：標準曲線を構築するために適切な基準を使用してください。本研究では、基準の濃度は0〜100 mMの範囲であった。 </li><li>規格の測定値を使用して、標準曲線を構築し（この場合：yは1310.51x - yは吸光度の読み取りであり、xはグルコース濃度であり723.43）最良適合の直線式を見つける。 </li><li>標準曲線を使用して、アカウントへの希釈を取ってグルコース濃度を計算します。細胞内のグルコース濃度は、この式を用いて計算することができる。 <img alt="" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51200/book_bg.png" width="500" /> CHO細胞については、単一細胞体積は、12μM12の気泡径を算出した</SUP&gt;。 </li><li> （材料の表を参照）、細胞内グルタミン濃度を決定するために、細胞抽出物試料について、製造業者の指示に従って適切なグルタミンアッセイキットを使用する。 注：標準曲線を構築するために適切な基準を使用してください。本研究では、基準の濃度は0〜2 mMの範囲であった。 </li><li>上記5.5のように、検量線（この場合はy = 203.1x + yは吸光度の読み取りであり、xはグルコース濃度である17.1）を構築</li><li>標準曲線を用いて、希釈を考慮に入れて、サンプルのグルタミン濃度を算出する。細胞内グルタミン濃度は、上記の式1を用いて計算することができる。 </li></ol>

<ol><li>Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor+arrays+for+simultaneous+measurement+of+glucose%2C+lactate%2C+glutamate%2C+and+glutamine%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine.</a> Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

FIBS焼入れおよび抽出方法に起因する不確実性を取り除く、この場合、増殖制限栄養素で、 生体内で 、キー分子のその場での定量に有効。知見はFIBS信号及びグルタミングルコースおよび0.3-2 mMの1-5 100mMの範囲で細胞内濃度との間に良好な相関関係があることを示唆している。バッチCHO細胞培養において、これらの濃度は、指数関数、固定、および早期衰退段階で遭遇する。指数関数と固定相は、適切な給餌戦略の設計の点で最も重要である。細胞の代謝要求を推定するため、これらのバイオセンサーの使用は、工業的に適切である。流加実験の結果は、細胞内のグルコースおよびグルタミン濃度の推定値を提供することFIBS &#39;適合性を確認する。早い時点で展示偏差が低いため、生細胞のNumの生じている可能性グルコースFIBSの場合、およびグルタミンFIBSの場合は他のアミノ酸によってガラクトースなどにより 、および/ ​​またはあるため他の代謝物による干渉のBERは、。具体的には、FRET比で20％までの減少がアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、スレオニン、バリン、チロシン<su...

代謝産物監視は、プロセス開発、メディアおよび飼料設計、および代謝工学などのバイオプロセスにおける様々な用途を有する。種々の方法は、酵素1、化学2、又は3結合アッセイの使用を介して濃度測定に利用可能である。興味深いオプションは、タンパク質ベースのキー代謝物の細胞内濃度のレポーターとして、生体内の生物学的センサーでは 、蛍光の使用である。小型化は、実際に信号対雑音比の4,5を改善し、タンパク質ベースのセンサは、遺伝的に外因性試薬は代謝産物分析のために必要ではないという意味を符号化することができるように、超低容量アッセイにおいて、蛍光は便利なツールである。フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）バイオセンサーは、リガンド結合ドメインによって接続された2つの蛍光タンパク質からなる。 FRETは、アクセプター蛍光分子LOCATへの光励起ドナーからのエネルギーの非放射伝達で<html>すぐ近く（&lt;100）で編。リガンドまたは結合開裂は、順番に、発光スペクトルの変化によって測定されたFRET効率の変化をもたらす、フルオロフォアの近接性の変化を誘導し、センサのコンフォメーション変化を引き起こす。 FRET統合生物学的センサー（FIBSは）構成的に細胞株内で生産され、それらのスペクトル特性は、細胞内の代謝物質の濃度に基づいて変化する。 FIBSは動的モデル6用の測定を行うために最適です迅速な応答時間を有する。以前のアプリケーションでは、7月9日 、単一および複数の10代謝物をモニターし、時空間分布11上のデータを提供することを含む。リガンド結合は、エネルギー移動およびリガンド結合がより密着します（ 図1）に2発蛍光をもたらしたApo-ミンを下げるフルオロフォアの近接性を崩壊させるのApo-マックス、：FIBSは2つの構成で作成することができます。 本研究では_contentは&quot;&gt;、プロトコルはチャイニーズハムスター卵巣構成的代謝産物、グルコースまたはグルタミンFIBSを発現（CHO）細胞株を構築するために提示されている。方法論は、将来の定量を可能にするために、インビボでセンサの較正のために確立されている図2に示すように、細胞内代謝物濃度の測定を、これに基づいて、グルコースまたはグルタミンの細胞内濃度二つの栄養素をインプロセスで高濃度で添加したものに、流加培養CHO細胞培養物で決定することができる。結果それは非侵襲的で低コストであるため、独立した酵素アッセイによって確認されるようにFIBS、予め作成した検量線からの蛍光信号を用いて、細胞内濃度を正確に予測が可能であることを実証している。このメソッドは、現在の分析技術に対する実質的な利点を提供する共通とすることができるFIBSのリアルタイム信号を与えて、高速文化を通じてitored。

<table><tbody><tr><td>CHO-S Cells</td><td>Life Tecnologies</td><td>11619-012</td><td>細胞株は、研究の目標によって異なります</td></tr><tr><td>pCDNA4/TOベクター&nbsp;</td><td>Life Tecnologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TransIT-PRO トランスフェクション試薬</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 5700</td><td>トランスフェクションは、研究中の細胞株に適した任意の方法を使用して達成することができます</td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD-CHO培地</td><td>Life Technologies</td><td>10743-011</td><td>細胞増殖培地は、研究中の細胞に依存しています</td></tr><tr><td>100x HT サプリメント</td><td>ライフ技術</td><td>11067-030</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン 200 mM (100x)、リキッド</td><td>ライフ テクノロジー</td>ズ <td>25030032</td><td></td></tr><tr><td>InfinitePRO 200 プレートリーダー</td><td>Tecan</td><td>FLx800TBI</td><td>必要な波長にアクセスできる任意の 96 ウェル蛍光プレートリーダーを代用可能</td></tr><tr><td>プレートリーダー用フィルター</td><td>Tecan</td><td>30000463</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep プラスミド精製キット</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>任意の適切なキットを代用可能</td></tr><tr><td>Amplex Red グルコース/グルコースオキシダーゼアッセイキット</td><td>Invitrogen</td><td>A22189</td> 任意の<td>適切なキットを代用可能</td></tr><tr><td>EnzyChrom&nbsp;グルタミンアッセイキット</td><td>BioAssay Systems</td><td>EOAC-100</td><td>任意の適切なキットを代用可能</td></tr><tr><td>改良型ノイバウアー血球計算盤</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>MNK-420-010N</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター&nbsp;</td><td>ヌアイレ</td><td>NU-5510E</td><td></td></tr></tbody></table>

fibs対応の非侵襲メタボリック·プロファイリング

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

計算生物学の時代に、新しい高スループット実験系では、彼らは、予測の目的のために検証できるようにしたモデルを投入し、改良するために必要である。経時データを取得する場合に、理想的にはそのようなシステムは、破壊的サンプリングおよび分析を妨げる低容積、であろう。必要とされるのは、リアルタイムでかつ非侵襲的に必要な情報を報告することができ、その場で監視ツールである。興味深いオプションは、タンパク質ベースの細胞内濃度のレポーターとして、生体内の生物学的センサーでは 、蛍光の使用である。代謝産物の定量化における用途を発見したin vivoでのバイオセンサーの一つの特定のクラスは、リガンド結合ドメインによって接続された2つの蛍光タンパク質間のフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）に基づくものである。統合された生物学的センサー（FIBS）をFRETが構成的に細胞株内で生成され、それらは、速い応答時間およびそのスペクトルを有する茶細胞内の代謝物質の濃度に基づいて変更racteristics。本論文では、細胞内の代謝産物濃度の将来の定量化を可能にするために、構成的にグルコースおよびグルタミンFIBSを発現（CHO）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣を構築し、バッチ細胞培養におけるin vivoでの FIBSを較正するための方法が記載されている。フェドバッチCHO細胞培養からのデータはFIBSは細胞内濃度の結果として生じる変化を検出する各々の場合にできたことを示している。独立した酵素アッセイによって確認されるようにFIBS、予め作成した検量線からの蛍光シグナルを用いて、細胞内の濃度を正確に決定した。

方法論の概要を図2に示す。本明細書に提示される研究では、CHO細胞をFIBSベクターおよび安定な細胞株にトランスフェクトした400μg/ mlのゼオシン抗生物質の圧力で選択した。構成的にグルコースおよびグルタミンのセンサーを発現する二つの別々の安定な細胞株は、従って作成された。 図1は、本研究で使用される2つのバイオセンサーの構成を示す図である。グルコースセンサは、アポ - 最大原理に基づいており、対応するプラスミドをpRS​​ET-FLIPglu600μΔ11Aphroditeである。これは、E.のF16A変異体に対する増強 ​​シアン蛍光タンパク質（ECFP）、強化黄色蛍光タンパク質（EYFP）のアフロディテ変異体の融合である大腸菌グルコース/ガラクトース結合タンパク質をペリプラズム。 11個のアミノ酸残基は、FRET効率を向上させるために13リンカー領域から除去した。このベクターを用いてpCDNA4/TO uniqのベクターにクローニングしたサイトメガロウイルスプロモーターおよびSV4...

その場代謝プロファイリングで用フェルスター共鳴エネルギー移動統合生物学的センサー（FIBS）を校正する方法の説明が提示されている。 FIBSは、非侵襲的に代謝モデルおよびバイオプロセス条件のハイスループットスクリーニングの開発を補助する代謝物の細胞内レベルを測定するために使用することができる。

FIBS対応の非侵襲メタボリック·プロファイリング

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

この手順の全体的な目的は、遺伝子コード化タンパク質ベースのバイオセンサーを用いて、細胞内グルコースまたはグルタミンのレベルを非侵襲的にモニタリングすることです。まず、目的の細胞にバイオセンサー遺伝子を含むプラスミドを導入（トランスフェクション）し、バイオセンサーを発現している細胞を選別します。次に、バッチ培養またはフィードバッチ培養から細胞培養サンプルを採取し、そのFRET比を測定します。その後、独立したアッセイによってサンプルの細胞内グルコース濃度またはグルタミン濃度を決定することができます。最終的に、サンプルのFRET比を用いることで、細胞内のグルコースまたはグルタミン濃度を非侵襲的かつリアルタイムに算出することが可能です。この手法は、オンラインでの最適化および制御に利用可能なリアルタイムの代謝情報を取得するための信頼性の高い方法であるため、バイオプロセスの改善に寄与します。この手法はバイオプロセシングへの知見を得るために利用できるだけでなく、疾患マーカーのセンシングを含む他のシステムにも応用可能です。まず、CHO細胞を9 mLの完全増殖培地で回復させます。次に、細胞を遠心分離し、ペレットを10 mLの新鮮な増殖培地で再懸濁させ、トリパンブルー排除法で細胞数をカウントします。次に、125 mLのシェーカーフラスコを用い、播種密度3×10⁵ cells/mLで培養を開始します。37 °C、5% CO2の条件下で、オービタルシェーカーを用いて125 RPMで回転させます。細胞導入に向けて、3〜4日ごとに完全増殖培地を用いて、播種密度2×10⁵ cells/mLで細胞を継代してください。細胞が活発に分裂している状態にするため、トランスフェクションの12〜24時間前から、細胞を37 °C、5% CO2の条件下で維持します。その後、プラスミドDNAを調製し、トリパンブルー排除法により細胞数をカウントし、細胞を20 mLの細胞培養培地を用いて希釈します。125 mLの振盪フラスコを用い、濃度を1 × 10⁶ cells/mLに調整します。使用している細胞株に適したトランスフェクションキットを用い、DNAを含まず細胞のみを含むネガティブコントロールウェルを少なくとも1つ用意します。トランスフェクトした細胞を静置状態で4日間インキュベートします。その後、キルカーブによって決定した適切な濃度で、プラスミド選択用の適切な抗生物質を添加します。例えば本研究では、トランスフェクトした細胞を選択するためにzinを最終濃度400 grams per milliliterで添加し、その後、培養物を125 RPMで回転する振盪プラットフォームに移しました。細胞株に応じた適切な時間間隔で培地を交換し、コントロールウェルの細胞が死滅するまで毎回抗生物質を添加します。最もコンフルエントなウェルを使用して、振盪培養へと進めてください。次に、バッチおよびフェドバッチの増殖曲線を作成するため、1 mLの凍結保存液に1 × 10⁷個の生存細胞を含むクライオバイアルに入れて細胞を凍結させます。まず、トランスフェクトしたCHO細胞を、作動液量50 mLとして250 mLシェイキングフラスコを用いて3本の独立した細胞培養を行います。その後、振盪機能付きの加湿細胞インキュベーターに培養物を置き、増殖中の各培養物から24時間間隔で4.1 mLのサンプルを採取します。フェドバッチ培養については、6日目に適切な量のグルコースまたはグルタミンの補給を行い、それらの濃度を初期値まで回復させます。コントロール培養液には同量の純水を添加する。4.2で得られた4.1 mLのサンプルから毎日100 µLを分注し、生存細胞濃度がゼロになるまでトリパンブルー排除法により細胞数をカウントする。FRET比を測定するには、日次サンプルの2 mLを遠心分離し、ペレットを2 mLの氷冷PBSで再懸濁する。細胞懸濁液の半分を6ウェルプレートに移し、1つのウェルには細胞を含まないブランクサンプルを加える。その後直ちに、励起波長430 nm（バンド幅35 nm）、蛍光波長465 nm（バンド幅35 nm）および520 nm（バンド幅10 nm）を用いて、それぞれ青色および黄色蛍光のレベルを測定する。検出された黄色蛍光の青色蛍光に対する比を求めることで、FRET比を算出します。次に、日次サンプルの最後の2 mLを遠心分離し、氷冷PBSでペレットを2回洗浄します。2回目の洗浄後、15秒オン・15秒オフのパルス設定で、1回3分間の超音波処理を5回行います。最後に、製造元の指示に従って代謝物アッセイを行い、得られた標準曲線を用いて、必要に応じて細胞内のグルコースまたはグルタミンの濃度を算出します。この代表的な実験では、2つの細胞株のバッチ過剰増殖培養を前述の方法で維持し、採取した日次サンプルを用いて各FRETセンサーのin vivo校正を行いました。2つの細胞株の生存細胞増殖プロファイルと、それに対応する細胞内グルコースまたはグルタミン濃度の関係をこのグラフに示し、対応するFRET測定値および酵素アッセイによって決定された細胞内代謝物濃度をこの表に示します。培養開始から最初の4日間は細胞数が少なく、FRET信号の信頼性が低いことが判明しました。同様に、培養8日目以降は細胞溶解物が高レベルで存在し、多量の光散乱が生じました。したがって、グルコースおよびグルタミンのFIBの検量線作成には、4日目から8日目までのデータのみを使用しています。これらの結果は、FIB信号が、グルコースでは1～5 mM、グルタミンでは0.3～2 mMの細胞内濃度に対して信頼性の高い相関を示すことを示唆しています。FIBの知見を検証するため、2つの細胞株において過剰増殖させた培養物のフィードバッチ培養を実施しました。基質の細胞外濃度を上昇させるため、細胞培養の6日目に高濃度の基質を含むフィードを添加しました。グラフに示されているように、各日のフレット比は給餌に対して明確な反応を示しています。6日目までに辿った傾向が逆転しました。例えば、グルコースを給餌した培養物では、細胞外グルコース濃度が36 millimolarまで再び上昇しました。グルタミン添加培養では、グルタミンの濃度が 4 mM まで上昇しました。グルコースを用いた実験では、glucose fibs 選択細胞株の FRET 比が、グルコースの添加に応じて 7 日目に低下しました。これは glucose fibs が APO on 構成に従っているためです。同様に、グルタミン実験において、グルタミンFRETセンサー導入細胞株のFRET比は、APO offセンサーの原理に従い、グルタミンの添加に反応して上昇しました。これらのFRET測定値を用いて、前述の検量線に基づき、対応する細胞内グルコースおよびグルタミン濃度を最終的に算出しました。これらの値を、グルコースおよびグルタミンの酵素アッセイで決定した実際の細胞内基質濃度と比較したところ、開発後の結果として十分な一致が示されました。この手法は、異なる培地組成がタンパク質生産性に及ぼす影響を探索しようとする研究者に道を開くものです。このビデオを視聴することで、遺伝子コード型バイオセンサーを用いて細胞内の代謝物濃度をモニタリングする方法について、十分に理解できるはずです。

fibs-enabled-noninvasive-metabolic-profiling

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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FIBS対応の非侵襲メタボリック·プロファイリング

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