FIBS対応の非侵襲メタボリック·プロファイリング

この手順の全体的な目標は、遺伝的にコードされたタンパク質ベースのバイオセンサーを使用して、細胞内グルコースまたはグルタミンのレベルを非侵襲的に監視することです。これは、まず、プラスミドを含むバイオセンサー遺伝子で目的の細胞をトランスセクトし、バイオセンサーを発現する細胞を選択することによって達成されます。第2ステップでは、バッチ培養または供給されたバッチ培養物から細胞培養サンプルを採取し、それらのフレト比を測定します。

その後、サンプルの細胞内グルコースまたはグルタミン濃度は、独立したアッセイによって決定できます。最終的には、サンプルのフレト比を使用して、グルコースまたはグルタミンの細胞内濃度を非侵襲的かつリアルタイムで計算できます。この手法は、オンラインの最適化と制御に使用できるリアルタイムの代謝情報を取得するための信頼性の高い方法であるため、バイオプロセスの改善にまで及びます。

この方法は、バイオプロセシングに関する洞察を提供するために使用できますが、疾患マーカーのセンシングなど、他のシステムでも使用できます。CHO細胞を9ミリリットルの完全増殖培地で復活させることから始めます。次に、細胞をスピンダウンし、ペレットを10ミリリットルの新鮮な増殖培地に再懸濁し、青色ダイ排除の胃袋で細胞をカウントします。

次に、125ミリリットル中5細胞/ミリリットルの3倍10の播種密度で培養を開始する。シェーカーフラスコは、軌道振とうプラットフォーム上で摂氏37度、CO2の5%でフラスコを動かします。125 RPMの回転で、細胞トランスフェクションのために、細胞トランスフェクションのために1ミリリットルあたり10から5番目の細胞の2倍の座席密度で、完全な増殖培地で3〜4日ごとに細胞を継代培養します。

トランスフェクションの12〜24時間前に細胞を摂氏37度、CO25%に維持し、細胞が活発に分裂していることを確認します。次に、プラスミドDNAを調製した後、トライプおよびブルーダイ排除法で細胞をカウントし、細胞を20ミリリットルの細胞培養培地の作業量に希釈します。125ミリリットルで、フラスコを1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞の1倍の濃度で振とうします。

使用している細胞株に適したトランスフェクションキット(少なくとも1つのネガティブコントロールウェルを含むが、DNAを含まないものを含む)を使用してください。トランスフェクションした細胞を静止モードで4日間インキュベートします。次に、プラスミド選択に適した抗生物質を、キルカーブで決定される適切な濃度まで追加します。

例えば、この研究では、トランスフェクションされた細胞を選択するために、ジンを最終濃度400グラム/ミリリットルに添加し、その後、125 RPMで回転する振とうプラットフォームに培養物を移しました。細胞株の適切な時間間隔で培地を交換し、コントロールウェル内の細胞が死滅するまで毎回抗生物質を添加します。最も合流する井戸を使用して、揺れる文化に進みます。

次に、1ミリリットルの凍結混合物に1倍から7番目の生存細胞を1回含む極低温バイアルで細胞を凍結して、バッチおよび供給バッチ成長曲線を生成します。まず、トランスフェクションしたCHO細胞の細胞培養を、作業容量が50ミリリットルの250ミリリットルシェイクフラスコで確立します。次に、加湿された細胞インキュベーターに培養物を置き、24時間間隔で各成長培養物から4.1ミリリットルのサンプルを取り出します Fedバッチ培養の場合、6日目に細胞に適切な量のグルコースまたはグルタミンを補給して、濃度を初期値に戻します。

対照培養物に同量の純水を供給して、1日4.2から4.1ミリリットルのサンプルを100マイクロリットル使用して、生存細胞濃度がゼロになるまでトリップおよびブルーダイ排除によって細胞をカウントします。フレット比を決定するには 測定、毎日のサンプルの2ミリリットルを遠心分離し、ペレットを氷冷PBSの2ミリリットルに再懸濁し、細胞懸濁液の半分を6ウェルプレートに移し、細胞を含まないブランクサンプルを1つに加えます。次に、励起波長430、帯域幅35ナノメートル、ミッション波長465、帯域幅35ナノメートル、ミッション波長520、

検出された黄色の蛍光と青色の蛍光の比率を決定することにより、フレット比を計算します。次に、毎日のサンプルの最後の2ミリリットルをスピンダウンし、2回目の洗浄後にペレットを氷冷PBSで2回洗浄します。サンプルを3分間、毎回15秒オンと15秒オフのパルスで5回超音波処理します。

最後に、製造元の指示に従って代謝物アッセイを実施し、得られた標準曲線を使用して、必要に応じて細胞内グルコースまたはグルタミンレベルを計算します。この代表的な実験では、2つの細胞株のバッチ生い茂った培養物を、各フィブのin vivoキャリブレーションに使用した毎日のサンプルで示したように維持しました。このグラフでは、2つの細胞株の代表的な生細胞増殖プロファイルを、その細胞内グルコースまたはグルタミンレベルに関連づけて示し、酵素アッセイによって決定された対応するfret測定値と細胞内代謝物濃度をこの表に示します。

培養の最初の4日間に存在する細胞数が少ないことが、信頼性の低いフレットシグナルにつながると判断されました。同様に、培養8日目以降に存在する高レベルの細胞溶解物は、大量の光散乱を引き起こしました。したがって、4日目から8日目のデータのみを使用して、グルコースおよびグルタミンフィブの検量線を作成します。

この結果は、FIBシグナルが、グルコースの1〜5ミリモル、グルタミンの0.3〜2ミリモルの細胞内濃度と信頼性の高い相関を示すことを示しています。fibsの所見を検証するために、2つの細胞株の肥大した培養物をブンブスで行いました。細胞培養の6日目に高濃度の基質を含む飼料を補充して、基質の細胞外濃度を上昇させました。

グラフトが描くように、毎日のフレット比は摂食に対して明確な反応を示します。この傾向を逆転させることで、彼らは6日目まで追跡しました。例えば、グルコースを供給培養した細胞外グルコース濃度は、36ミリモルまで上昇しました。

グルタミンを供給された培養物では、グルタミン濃度は4ミリモルに増加しました。グルコース実験では、グルコースフィブスが選択した細胞株のフレット比は、グルコースの添加に応答して7日目に減少しました。グルコースフィブは構成上のAPOに従うため。

同様に、グルタミン実験では、グルタミンフィブのフレット比は、APOオフセンサーの原理に沿って、グルタミンの添加に応答して増加した細胞株を選択しました。これらのフレット測定値は、最終的に、前述の検量線に基づいて対応する細胞内グルコースおよびグルタミン濃度を計算するために使用されました。それらは、グルコースおよびグルタミン酵素アッセイで決定されたこれらの基質の実際の細胞内濃度と比較され、その開発後に適切な一致を示します。

この技術は、この分野の研究者が、タンパク質の生産性に対するさまざまな培地製剤の影響を調査するための道を開きます。このビデオを見れば、遺伝子コードされたバイオセンサーを使用して細胞内代謝物濃度をモニタリングする方法を十分に理解できるはずです。