DNBS / TNBS大腸炎モデル：食事脂肪の炎症性腸疾患への洞察とエフェクトを提供

この手順の全体的な目的は、DNBS（2,4-dinitrobenzene sulfonic acid）を用いて、炎症性腸疾患（IBD）を研究するための代替的な安価な手法を提供することです。まず、肛門から緩やかに挿入し、DNBSを直腸内に投与します。次に、大腸の組織切片を採取して組織学的スクリーニングを行い、DNBSで誘発された組織のミエロペルオキシダーゼ活性を評価します。最終的に、食事性オイルが体重減少および大腸炎に及ぼす影響を、肉眼的および顕微鏡的な手法の両方で評価することができます。

既存のデキストラン硫酸ナトリウム法に対する本手法の主な利点は、DNBS法が簡便で低コストであり、再現性が高いことです。この方法は、IBDの再発におけるストレスや抑うつの役割、あるいは腸管の損傷と修復の根底にあるメカニズムなど、IBD研究分野における重要な疑問への回答に寄与します。マウスへのDNBS直腸投与を行うには、まず1 mLシリンジに19ゲージの針を装着します。ポリエチレン50カテーテルを装着し、調製したばかりのDNBSをカテーテル内に吸引します。

次に、麻酔をかけたマウスにティアゲルを塗布し、指先で動物の後端を軽く圧迫して、遠位結腸にある便を除去します。次に、カテーテルを直腸内に約3～4cmまでゆっくりと挿入しながら、挿入を容易にするために少量のDNBS溶液を注入して結腸を潤滑にします。カテーテルが定位置に配置されたら、100 µLのDNBSを注入します。対照群の動物には、同量の50% ethanolを注入します。

その後、試薬の流出を防ぐため、動物の頭を下に向けた状態で90秒間保持します。DNBS投与後は、最初の1週間、脱水を防ぐために0.2%生理食塩水で希釈した8%スクロース水を動物に与えます。実験の予定期間中、体重減少、脱水、または苦痛の有無について、動物の状態を毎日注意深く観察してください。

DNBS投与後、安楽死させた動物の腹腔を開き、大腸全体を摘出します。次に、腸管を縦方向に切開します。結腸の遠位端から近位に約2〜3cmの範囲で、肉眼的な粘膜潰瘍が観察されるはずです。

実験動物においては肉眼的な損傷が最大となる部位の近位から0.5 centimeterの切片を採取し、対照動物においては対応する解剖学的部位から結腸のセグメントを採取します。次に、ミエロペルオキシダーゼ活性を評価するため、対照群1検体および1D NBS処理群1検体から0.5 centimetersを液体窒素で急速凍結させ、その他の切片は組織学的解析のために10%中性緩衝ホルマリン中で一晩固定します。翌朝、ホルマリン固定した組織を70%エタノールで洗浄し、カセットに入れて組織病理学施設に送付し、パラフィン包埋およびヘマトキシリン・エオジン染色を行い、組織学的スコアリングを実施します。

次に、各動物から採取した少なくとも3つの組織切片を光学顕微鏡で観察し、各群の組織学的損傷スコアを判定します。DNBS投与組織のミエロペルオキシダーゼ活性を測定するには、まず、急冷した対照群および試験群の組織をミエロペルオキシダーゼホモジナイズ緩衝液中でホモジナイズし、緩衝液1 mLあたり結腸セグメント50 mgとなる懸濁液を作成します。その後、ホモジナイズ液を1 mLずつ分注し、10,000 ×g、4 °Cで2分間遠心分離します。

次に、各分注液から100 µLを個別のキュベットに移し、IDE、ジヒドロクロリド、および過酸化水素を添加した2.9 mLのPBSを加え、激しく混合します。最後に、分光光度計を用いて460 nmでの吸光度速度を測定します。これは、前述のようにDNBSによる直腸内投与による負荷を行った後に行います。

魚油またはカノーラ油を投与したラットでは48時間までに、サフラワー油を投与したラットでは72時間までに、有意な体重減少が観察されます。最大体重減少は、魚油投与ラットでは48時間に、カノーラ油またはサフラワー油投与ラットでは72時間までに起こります。

72時間後に体重増加が再開し、DNBS投与から5日後までに、魚油およびサフラワー油投与群の体重はベースライン値と同程度まで回復した。食事性オイルを補給し、直腸内エタノール投与による負荷を与えた対照群のラットは、5日間の研究期間を通じて着実に体重が増加した。DNBSによって引き起こされる腸管損傷は広範囲に及ぶ可能性がある。

しかしながら、最大損傷部位は通常、ラットでは結腸の遠位6 cm、マウスでは遠位3 cmに局在します。詳細な組織学的評価を行うと、潰瘍の形成、好中球およびリンパ球の浸潤、粘液の枯渇、および浮腫を含む広範な上皮損傷が観察されます。DNBSによる誘発後、これら炎症および組織損傷の組織学的徴候は3つの食事性オイル補充群すべてで認められますが、最も深刻な損傷はサフラワー油群に見られ、次いでキャノーラ油群で認められます。

一方、魚油投与群のラットでは、上皮損傷が最小限であり、粘膜固有層への炎症細胞浸潤も限定的です。サンプル間の組織学的損傷の差を定量化することで、群間のより詳細な比較が可能になります。グラフは、DNBS誘発結腸炎における3つの食事油投与群の組織学的損傷スコアを示しています。

H&E染色切片で観察されるように、紅花油添加群で最も激しい損傷が認められ、次いでキャノーラ油群の順となりました。魚油群で損傷が最も少なかった一方で、特に好中球を中心とした炎症細胞浸潤の程度については、ミエロペルオキシダーゼ活性測定を行うことでさらに詳細に検討することが可能です。これは組織学的損傷スコアから予想される結果と一致しています。

DNBS曝露から5日後のラット結腸におけるミエロペルオキシダーゼ活性の評価により、3群すべてで活性の上昇が認められ、活性が最も高かったのは紅花油群であり、次いでカノーラ油群、魚油群の順となりました。本手順を実施する際は、マウスに軽度の麻酔を施すこと、およびDNBS投与量を最適化することを忘れないでください。この手法の開発により、炎症性腸疾患（IBD）分野の研究者が、IBD動物モデルにおける腸管炎症を制御するメカニズムを探索する道が開かれました。

DNBSの取り扱いは極めて危険であるため、溶液を調製する際は、保護衣、手袋、ゴーグル、フェイスシールドなどの保護具を常に着用し、十分な注意を払ってください。