神経高密度コア小胞の超解像イメージング

本手順の全体的な目的は、通常の蛍光顕微鏡では到達不可能な解像度で、小胞組織の重要な側面を明らかにする超解像蛍光画像を得ることです。これは、まず、小胞カーゴの光変換キメラをコードするDNAを用いて海馬ニューロンを形質導入し、次に、超解像顕微鏡システムを用いて疎にサンプリングされた生画像を取得することによって達成されます。

次に、超解像画像を生成するために生画像を処理します。最終ステップでは、小胞の組織化を明らかにするためにデータを定量化します。最終的に、点状構造（puncta）の強度のラインプロファイルを用いて、小胞の間隔と小胞の幅を比較し、この手順を用いて小胞がクラスターを形成するのに十分に近い距離にあるかどうかを判定できます。

単色光活性化局在化顕微鏡法（PALM）を用いることで、ほとんどの培養細胞におけるオルガネラの構成を解析することができます。画像取得のために超解像イメージングシステムを起動するには、まずアークランプの電源を入れます。次に、電源リモートにあるシステムPCおよびコンポーネントのスイッチをオンにします。

顕微鏡制御タブレットの電源が入ったらスイッチをオンにし、コンピューターを起動してソフトウェアを立ち上げます。起動ステータスウィンドウを拡大してシステムが正常にロードされていることを確認し、ログインダイアログでシステム開始オプションを選択します。可視化のためにサンプルを配置するには、レーザー安全キャビネットのフロントパネルとトップパネルを開き、透過光アームを傾けてステージと対物レンズにアクセスしてください。

次に、alpha plan APO Chromat 100x 全反射蛍光またはTURF対物レンズにオイルを滴下します。その後、初期フォーカスのための低倍率対物レンズを選択してください。サンプルをステージ上に設置し、対物レンズをサンプルに向かって上昇させます。

コントロールタブレットのX、Y、Z機能を用いてレンズの位置をモニターします。レンズが焦点の概ね適正な位置に到達した時点で停止します。その後、サンプルを可視化し、焦点を微調整します。

ライトアームを下げ、アクセスパネルを完全に閉じます。次に、Locateタブにある接眼レンズ展開シンボルをクリックします。光路の概略図を表示させるには、「trans on」を選択し、電球からの透過光がサンプルに当たっていることが概略図で確認できることを確かめてください。接眼レンズを覗き、コントロールタブレットをガイドとして使用して、細胞に焦点を合わせます。

次に、DRA 2を発現している細胞を特定するため、反射光およびden 2からの緑色蛍光観察に適したフィルターを選択します。低強度の反射光を用いてカバースリップをスキャンし、健全で明るい細胞が見つかるまで探索した後、PALMデータの取得に向けてソフトウェアを設定します。「Acquisition」タブに切り替え、「Experiment Manager」を使用して、適切な実験用PALM取得構成をロードします。

レーザーのオンにするかを確認するポップアップメニューが表示されたら、「はい」をクリックし、カメラ平面で細胞の画像にピントを合わせます。488トラックのみを選択してください。EMCCDゲインなどの取得パラメータを調整し、連続取得を選択します。

次に、ディスプレイを希望の明るさに調整し、画面上の画像にピントが合うまで対物レンズを動かします。続いて、通常の広視野画像を取得するために、スナップボタンをクリックして画像を保存します。488トラックでターフベース照明を設定するには、epi turfボタンのturfを選択してください。

ターフ照明を最適化するには、連続取得（continuous acquisition）を選択し、背景が急に暗くなり、試料を単一の平面でピント合わせできるまでターフ角度ライターを調整します。405 nmレーザーをオフにした状態で、561トラックに切り替えます。EMCCDゲインを約200に、露光時間を約50ミリ秒に設定します。

赤色透過のエミッションフィルターを選択し、レーザー強度を約40%に設定します。561トラックのtuff角度を再確認してください。背景光を低減させるため、背景が消えるまでサンプルを照射します。561レーザーのみを活性化させた状態で561トラックを使用します。

パームデータの収集を行うには、561トラックの405ナノメートルレーザーをオンにし、405レーザーの強度を約0.01%に調整します。取得中に計算されたパーム画像をモニタリングするには、オンライン処理オプションメニューを展開し、「online processing palm」にチェックを入れてデフォルトパラメータで処理します。「start experiment」をクリックして取得を開始し、データ収集中に光変換を視覚的にモニタリングしながら、405ナノメートル光変換レーザーの強度を上げます。2回目の光変換が減少하기始めたら停止します。

レーザー強度の増加に伴って光変換がそれ以上増加しなくなった時点で、[finish current step]をクリックします。実験を終了するには、ファイルを保存してください。保存した画像を処理するには、[processing]タブをクリックし、[method]メニューを展開して、[palm]サブメニューを展開します。

4つのサブオプションから再度palmを選択します。適切な画像を選択し、ビューイングウィンドウに表示させます。メソッドパラメータを展開して「select」をクリックして画像を入力し、設定フィールドを展開して「default」を選択し、デフォルトのオプションでピーク検出と局在化を実行します。

Processingタブのapplyを押してパーム画像を算出します。画像は閲覧ウィンドウの別タブに表示され、データ内のサンプリング不十分な成分をフィルタリングします。ナイキストのサンプリング定理とremove palm outliersツールを使用して、ピーク間の平均間隔（小文字のD）が大きすぎて、パーム画像を用いて直径（大文字のD）の小胞を分解できない領域のピークを削除します。閲覧ウィンドウにパーム画像を表示した状態で、selectをクリックして画像を入力し、applyをクリックします。新しい画像が閲覧ウィンドウの別タブに表示され、局在化不十分なフローラ（flora）をフィルタリングします。

PALフィルタータブに移動し、許容されるフローラを制限します。4つの局在化精度を35 nanometers未満のシグマに設定します。PAL画像の表示モードを選択するには、PALレンダリングタブに移動し、ピクセル解像度と希望の表示モードを選択してください。

この画像では、神経細胞の高密度コア小胞（DCV）のイメージングおよび処理における代表的なPALM最終生成物が赤色で示されています。局在化した単一分子（白）の水平座標がCentro表示モードで示されており、関連する小胞の超解像画像がGaussian表示モードで示されています。2番目の図では、TPA-Danger2を発現させた培養8日目の海馬ニューロンの細胞体および近位突起について、同様の広視野画像（緑）とPALM画像（赤）が表示されています。

画像の重要な特徴として、点状構造（パンクタ）と、従来のワイドフィールド画像およびPalm画像との間に、広範な一対一の対応と黄色い重なりが見られることが挙げられます。また、Palm画像における点状構造のサイズが著しく小さいことや、場合によっては単一のワイドフィールド点状構造が複数のPalm点状構造として分解されることがあります。ここでは、tpaを発現する2番目の海馬ニューロンの突起の一部に沿ったD cvsのPalm画像を示しています。

DENDRA twoを示します。punctaの直径が小さく均一な外観であること、および、DCVクラスターと推定される近接したpunctaの観察例が少ないことに注目してください。この最後の図では、2つ以上のcvがクラスターを構成するほど十分に近接しているかを判定するための、簡便な定量的方法を概説します。

グラフに示されているように、puncta強度のラインプロファイルを作成し、これを用いてDCVの間隔およびDCVの幅を定量化します。間隔が幅を大幅に上回る場合、DCV同士は接触していないと判断されます。一方、間隔が幅とほぼ等しい場合は、これらの基準に基づき、DCVが接触している可能性があります。この手順に従い、この画像のDCVは「非接触」に分類され、こちらの画像のDCVは「接触」に分類されました。

異なる構造の相対的な局在を調べるためには、2色PALMなどの他の手法を用いることができます。