Name: 妊娠中にラット肝組織中の脂肪酸の組成変化を分析するために、ガスクロマトグラフィーの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 学ぶガスクロマトグラフィーを用いたラット肝組織中の脂肪酸組成分析。妊娠中の脂質代謝変化と食事性脂肪の影響を評価し、脂質プロファイルの詳細な定量が可能です。

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著者らは、ラットの研究にMeritxellロム·ナダルの貢献を感謝したい。

1。動物手続き<ol><li>全ての動物研究は、内務省動物（科学的処置）法（1986）に従って行われるべきである。 </li><li>一夫一婦制の繁殖による古い10週齢のWistarラットを交尾し、膣栓の出現によって妊娠を確認します。妊娠1日目としてこれを記録し、実験食を開始。処女雌については、個別にそれぞれのラットを収容し、実験食を開始。 </li><li> 20日間の実験飼料を供給した後、頸椎脱臼に続いてCO 2窒息によりラットは安楽死させる。 </li><li>腹腔を露出させ、腹部、胃と十二指腸の前壁を振動板に肝臓をつなぐ靭帯を切断することにより、肝臓を切除する解剖鉗子やハサミを使用してください。 -80℃で保存する前に、PBS中で肝臓を洗浄し、液体窒素中で凍結</li></ol> 2。総脂質の製造は、9を抽出します<ol><li> moleculを追加ARキュラー&#39;ドライ&#39;溶剤を作成するためにすべての溶媒に（溶剤容器の1月10日を記入します。）。 ヒュームフード内のすべての溶剤作業を実施 。 </li><li>約100ミリグラムを凍結した肝臓を切り取り、重量を量る。アイスバケットにチューブに組織を配置し、0.8ミリリットルの氷冷0.9％のNaClを追加します。組織を均質化する。 </li><li>乾燥クロロホルムを1ml / mgの中に溶解し、内部標準を追加：メタノール（2:1、v / v）のブチル化ヒドロキシトルエン（BHT;を50mg / l）を含有する抗酸化剤。ラットの肝臓の100 mgのためのCE規格（コレステヘプタデカン午後05時）の100μgのを追加します。 注意 ：クロロホルムおよびBHTは危険です。 </li><li> 5.0ミリリットルの乾燥クロロホルムを追加：メタノール（2:1、v / v）のBHTた（50mg / L）を含有する。 </li><li>混合物が均一に見えるまで、ボルテックスで十分に混和、1.0ミリリットル1MのNaClを追加します。サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。 </li><li> 10分、室温で低ブレーキ1,000×gで遠心分離する。 </li><li> lower収集ガラスパスツールピペットを用いて相は、40℃の窒素下に新しいスクリューキャップガラスチューブに移し、ドライサンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。 </li></ol> 3。固相抽出（SPE）10による脂質クラスの分離<ol><li>真空ポンプにSPEタンクを接続し、タンクにアミノプロピルシリカSPEカートリッジを配置します。 </li><li>第一の画分を収集するために列の下のタンクラック内のタグおよびCEというラベルの新しいスクリューキャップのガラス管を配置します。 </li><li> 1.0ミリリットルの乾燥クロロホルムや渦の総脂質抽出物を溶解する。 </li><li>ガラスパスツールピペットを用いてカラムにサンプルを適用し、重力下でスクリューキャップチューブに通って滴下することができます。これ以上のドリップが落ちない場合は、真空によって残った液体を除去。 </li><li>真空下でTAGおよびCEの分画を溶出、乾燥クロロホルム2×1.0 mLの洗浄でカラムを洗浄。 </li><li>全ての液体が除去されると、TAGおよびCE fractioを乾燥40℃で窒素下、Nサンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。 </li><li>列の下のタンクトレイに新しいスクリューキャップのガラス管ラベルのPCを配置します。 </li><li> 2×1.0ミリリットルを加え乾燥クロロホルムを真空下でのPCの割合を溶出：メタノール（60:40、v / v）で、すべての液体がカラムから除去されるまで。 </li><li> 40℃で窒素下でのPCの画分を除去し、乾燥サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。 </li><li>タンクトレイに、PEという新しいスクリューキャップのガラス管を配置し、1.0ミリリットルを加え、真空下で乾燥メタノールでのPE分を溶出。 </li><li> 40℃で窒素下でのPE画分を除去し、乾燥サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。 </li><li>タンクトレイにNEFAという新しいスクリューキャップのガラス管を置き、乾燥クロロホルム2×1.0ミリリットルの洗浄を添加することにより、真空下でNEFA分を溶出：メタノール：氷酢酸（100:2:2、v / v / v）を注意 ：氷酢酸危険である。 </li><li> 40℃の窒素下で収集NEFA画分と乾燥を削除サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。 </li><li> SPEタンクに新しいアミノプロピルシリカSPEカートリッジを配置し、廃棄物を収集するためのカートリッジの下にタンクトレイにスクリューキャップのガラス管を配置します。 </li><li> 3真空下で乾燥ヘキサン洗浄および重力下で、最終的な1.0ミリリットルの洗浄でカラムを洗浄します。 。カートリッジ（ヘキサンレベルはカートリッジ行列に近い場合に閉位置にカートリッジカラム·チャネルをオンに） 注意ドライになることを許可していない：ヘキサンは危険です。 </li><li>新しいスクリューキャップガラス管ラベルのCEと廃液チューブを交換してください。 </li><li>乾燥ヘキサンと渦の1.0ミリリットル中に（ステップ3.6で製造）乾燥し、タグおよびCE分を溶解する。ガラスパスツールピペットを使用して列にこれを適用するとgの下を滴らすることができますravity。 </li><li>これ以上のドリップが落ちないときは、真空下で残りの液体を除去。 </li><li>真空下、40℃で窒素下、CEおよび乾燥回収した画を溶出する乾燥ヘキサン2×1.0 mLの洗浄でカラムを洗浄サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。 </li><li>タンクトレイに新しいスクリューキャップのガラス管にラベルされたタグを配置し、乾燥ヘキサン2×1.0ミリリットルの洗浄を追加してタグを溶出：メタノール：酢酸エチル（100:5:5）を真空下。 </li><li> 40℃の窒素下で乾燥回収した画。サンプルは週までの注意のために蓋をし ​​て、この段階で-20℃で保存することができます：酢酸エチルは危険です。 </li></ol> 4。 CEの10からFAMEの調製<ol><li> 。分離のCE分（ステップ3.19で収集）し、ボルテックス注意を乾燥トルエン0.5ミリリットルを追加します。トルエンは危険です。 </li><li> 2％（vでメチル化試薬を調製（乾燥メタノール/体積）は1.0 mlのサンプル当たり要求されるH 2 SO 4）。ガラスや蓋付きの適切なプラスチック容器に乾燥メタノールの量を分配し、H 2の必要量を追加し、SO 4滴下し、転倒混和注意 ：濃硫酸は危険です。 </li><li>乾燥トルエンに溶解したサンプルをメチル化試薬の1.0ミリリットルを加え、しっかりとチューブにキャップをし、穏やかに混合。 </li><li> 50℃で2時間、試料を加熱する</li><li> 2時間後に火からチューブを取り外します。一度クール（0.25M KHCO 3 0.5MK 2 CO 3）水溶液を中和する1.0ミリリットルを追加注意 ：重炭酸カリウムおよび炭酸カリウムは危険です。 </li><li> 1.0ミリリットル乾燥ヘキサンと渦を追加します。 </li><li> 2分、室温で低ブレーキ用250×gで遠心分離する。 </li><li>名声を含んでいる上相を収集し、新しい非スクリューキャップ使い捨てガラス管に移す。 </li><li>下で収集名声を乾かし40℃の窒素サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。 </li></ol> 5。 CE FAME 14から遊離コレステロール汚染の除去 （遊離コレステロールは、サンプルを汚染することができます。無料のコレステロール除去をしてなくても例えば、クロマトグラフトレースの図1を参照）。 <ol><li> SPEタンクに廃液チューブを配置し、タンクの上にシリカゲルSPEカートリッジを配置します。 </li><li>真空下での乾燥ヘキサンで3回1ミリリットルの洗浄と重力の下、1×1ミリリットルでカラムを洗浄します。 </li><li>廃棄物の洗浄を取り外し、タンクに新しい廃液チューブを追加します。 </li><li> 1ミリリットル乾燥ヘキサン、渦のCE名声を溶かす。 </li><li>ガラスパスツールピペットを用いてカラムに適用され、重力の下を滴下することができます。 </li><li>真空下でのヘキサンで3回1ミリリットルの洗浄でカラムを洗浄します。 </li><li>廃棄物の洗浄を外し、タンクラベルCEの名声に新しい非スクリューキャップチューブを配置します。 </li><li>溶出2×1ミリリットル乾燥ヘキサンでのCE FAME：ジエチルエーテル（95:5 v / v）で洗浄する。 </li><li> 40℃の窒素下で乾燥する。サンプルは週までの注意のために蓋をし ​​て、この段階で-20℃で保存することができます：ジエチルエーテルは危険です。 </li></ol> 6。 GCオートサンプラーバイアルにFAMEの転送<ol><li> 、渦をサンプリングして、GCのオートサンプルバイアルに転送する75μlの乾燥ヘキサンを追加します。 </li><li> 、サンプル渦と同じGCオートサンプルバイアルに転送し、さらに75μlの乾燥ヘキサンを追加します。サンプルは、月までのために蓋をして、この段階で-20℃で保存することができます。 </li></ol> 7。ガスクロマトグラフ14を用いた分析<ol><li>ガスクロマトグラフ上で名声を分析します。の例では、最大セット：30 MX X 0.25ミリメートル0.25ミクロンBPX-70温度プロトコル溶融シリカキャピラリカラム： 初期温度115℃、245℃、Hに18.5分、傾斜60℃/分を保持し、200℃まで2分、勾配10℃/分を保持旧4分。 コラム：ヘリウムガス、流量1.0、圧力14.6と速度29。 インジェクタ：温度= 300℃、 検出器：水素流量40.0、空気の流れ184.0、ガスヘリウムを構成している、45.0を流量、温度= 300℃、 </li><li> （CEの名声分析用など 25:1）に応じて分割比を設定します。 </li><li>適切なソフトウェアを使用して、各ピーク下の面積を決定し、標準と比較することによって名声を識別します。例えば、クロマトグラムについては、図2を参照してください。 </li><li>総脂肪酸の割合として、個々の脂肪酸の寄与を計算するために、ピークデータ下の面積を使用する。 </li><li>添加量は、内部標準の面積で割ることにより脂肪酸の絶対濃度を計算する。用いる組織量内の各脂肪酸の絶対濃度を得るために、この結果により、各脂肪酸の領域を分割する。 </li></ol>

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著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

ガスクロマトグラフィーは脂肪酸分析のために使用する正確な技術であり、その高い再現性が臨床分析に適したこの技術を認める。適切なGCカラムは、使用可能なカラムは、固定相、カラムの長さと内径の極性の変化を有する、関心対象の脂肪酸の同定を可能にするために使用されなければならない。この分析方法では、溶融シリカキャピラリーカラムの使用は、良好な熱安定性およびその高い表面不活性及び良好な分解能8による保持時間の再現性を提供する。 このプロトコルの中の重要なステップは、下限と上限位相収集ステップを（プロトコル2.7と4.8ステップ）が含まれる。それは、正しい位相の限りが不要な相のいずれかとの汚染なしに可能な限り収集することが重要である。サンプル中の汚染物質の存在は望ましくないクロマトグラフの出力になります図2に示すように、 SPE間にCEを収集する際には、カートリッジカラムは、サンプルは、タグからのCEの成功分離を可能にする列を貫通することを確認し、ヘキサンで洗浄後、溶媒（ステップ3.1...

ガスクロマトグラフィー（GC）は、肥満症（および糖尿病などの関連疾患）、または妊娠3などの補充または生理学的状態の間脂質プールおよび細胞膜1,2への脂肪酸の取り込みを同定および定量するために使用される十分に確立された技術である- 5。それはまた、食品中の脂肪のタイプおよび量を分析するのに適している。実験食を特徴付けるだけでなく、食品業界は、規制に準拠していることを確実にする場合に便利です。例えば、GC、その標識が正しく、規制が6,7に接着されるように、このような栄養補助食品のような製品内のアイデンティティおよび脂肪酸の量を確認するために使用することができる。脂肪酸の分析では、健康と病気、食事変更の影響、および生理的状態8の変化の影響での脂質代謝への貴重な洞察を提供することができます。妊娠中にサンプルを研究するため、GCの使用が重要に提供してきました脂肪酸と複合脂質の恒常3の変化についての情報。 クロマトグラフィー分離の前に、脂質は、典型的には、クロロホルムとメタノールの溶媒混合物中の脂質の溶解度を用いてサンプルから抽出される。塩化ナトリウム相9,10を含有する水性および有機脂質への混合物の分離を容易にするために添加される。関心対象の複合脂質クラスは、固相抽出（SPE）によって総脂質抽出物から分離することができる。この分離技術は、それらの極性または結合親和性に基づいた脂質クラスを溶出する。 Triacyglycerols（TAG）およびコレステリルエステル（CE）を合わせた画分、さらにクラス、ホスファチジルコリン（PC）として最初に溶出され、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、および非エステル化脂肪酸（NEFA）は、溶出溶媒の極性を増加させることによって溶出される。 CEからのタグの分離は、新鮮なのSPE cartri、タグの結合を利用DGE、CEが溶出することができるようにする。 TAGは、次いで溶出溶媒9,10の極性を増加させることによって溶出させることができる。この方法は、複数のサンプルが比較的小さいサイズのサンプル（ 例えば、&lt;100μlの血漿または血清、&lt;100 mgの組織）は11,12分析することができることを意味する薄層クロマトグラフィーを用いて達成されるよりも高い収率で同時に分離することができる。 GCは、最初、1950に記載された十分に確立された技術であり、これは、次いで、液 - 液系における移動相は蒸気で置き換えることができることが示唆された。当初は石油分析のために使用されるが、そのような急速に主要な関心が依然としてあるアミノ酸分析および脂質生化学などの他の分野に拡大した。以前に使用した充填カラムからこのようなキャピラリカラムの開発など、GC機器や技術の進歩により、脂肪酸があることができるかが私たちの現在の技術につながっているGCは、日常的な調査13の広い範囲で脂肪酸を同定および定量するために使用され、その結果、より低い温度でより効率的に分離する。 GCは、それらが熱分解することなく、妥当な温度で溶出するのに十分に揮発性になることができるようにするために誘導体化される脂肪酸を必要とする。これは、通常、分析のためにエステル、チオエステル、またはアミドを形成するために水素を含む官能基の置換を含む。メチルエステルは一般的にメチル化によって製造される誘導体を、研究されている。この方法では、複合脂質中のエステル結合が脂肪酸メチルエステル（FAME）を形成するtransmethylatedされている遊離脂肪酸を放出するために加水分解される。 GCにより決定FAMEの結果として生じるプロファイルは、脂肪酸組成物と呼ばれ、簡単に異なる実験群9,10の間で比較することができる。技術は個々を、両方の割合ができますUALの脂肪酸およびそれらの濃度を測定する。 栄養学研究において、食品業界内の脂肪酸を分析するためのGCの使用に加えて、この技術は、分析の幅広い分野で使用できる。例えば、GCを用いて、環境分析は殺虫剤および土壌水の汚染を測定することが含まクロロベンゼン含有量を測定解析する。毒物学では、GCはまた、尿、個人の血液試料中の違法な物質を同定するために使用されている等のスポーツパフォーマンスエンハンサー12及び炭化水素の複雑な混合物を分離する能力は、石油化学分析12のための石油産業におけるこの技術が人気となる。 妊娠は、多価不飽和脂肪酸アシ有意な母体組織の脂肪酸組成の変化、具体的にはω-3の含有量が第（n-3）およびω-6（n-6）系に関連付けられているDS（PUFA）3。現在の研究では、異なる油供給源と低および高脂肪食を与えた処女と妊娠ラットから採取した肝臓組織の脂肪酸組成の分析においてその使用を記述することにより脂肪酸の測定におけるGCの使用を例示する。ここで提供される実験食は低脂肪大豆油ベースの食、高脂肪大豆油ベースの食事療法（130.9グラム総脂肪/ kgの総脂肪）または高脂肪亜麻仁油ベースの食事療法（130.9グラム総脂肪/ kgであった20日間のために提供食）、。これらの食事の完全な栄養素と脂肪酸組成は、以前に14に記載されている。大豆油食はリノール酸（18:2 n-6系）に富み、亜麻仁油食は、α-リノレン酸が豊富に含まれている間、いくつかのα-リノレン酸（18:3 n-3系）が含まれている。これらの高脂肪食は、リノールα-リノレン酸にする（それぞれ8:1 1:1の配給）の異なる飼料を表しています。個々の脂質クラスの分離とGCによる分析のための方法は、我々であるLL設立され、検証され、以前に10ではなく、ここに見つかった詳細な技術的説明なしに公開されています。

<table><tbody><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>M/4056/17</td><td>「コーション」ヒューム - HPLCグレード</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C/4966/17</td><td>「コーション」ヒューム - HPLCグレード</td></tr><tr><td>BHT</td><td>Sigma- アルドリッチ</td><td>W218405</td><td>「コーション」 ダストヒューム - 無水</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma- アルドリッチ</td><td>S9888</td><td>無水</td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>H/0406/17</td><td>「コーション」ヒュームズ - HPLCグレード</td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>シグマ- アルドリッチ</td><td></td> <td>695084「コーション」 バーンズ - 99.85%</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>シグマ- アルドリッチ</td><td>339741</td><td>「コーション」 バーンズ - 99.999%</td></tr><tr><td>炭酸カリウム</td><td>シグマ- アルドリッチ</td><td>209619</td><td>99% ACS試薬グレード</td></tr><tr><td>重炭酸カリウム</td><td>シグマ-Aldrich</td><td>237205</td><td>99.7% ACS Reasgent グレード</td></tr><tr><td>エチルアセテート</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td></td> <td>10204340'CAUTION' ヒュームズ - 99+% GLC SpeciFied</td></tr><tr><td>トルエン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>T/2300/15'CAUTION</td><td>' ヒュームズ</td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>Σ- Aldrich</td><td></td> <td>309966'CAUTION' ヒューム</td></tr><tr><td>窒素 (酸素フリー) シリンダー</td><td>BOC</td><td>44-w</td><td>「注意」 圧縮ガス - 爆発の危険性</td></tr><tr><td>アミノプロピルシリカ SPE カートリッジ</td><td>アジレント</td><td>12102014</td><td>カートリッジ - ビーズ質量 100 mg</td></tr><tr><td>シリカゲル SPE カートリッジ</td><td>アジレント</td><td>14102010</td><td>カートリッジ - ビーズ質量 100 mg</td></tr><tr><td>分子 seives</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>334324</td><td>ペレット、AW-300、1.6 mm</td></tr><tr><td>ガラス パスツールピペット</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td><td>ック FB50251</td><td></td></tr></tbody></table>

妊娠中にラット肝組織中の脂肪酸の組成変化を分析するために、ガスクロマトグラフィーの使用

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

ガスクロマトグラフィー（GC）を高精度かつ再現性の高い結果が得られ、組織、細胞、血漿/血清から脂質の脂肪酸含量を同定および定量するために使用される高感度な方法である。代謝および栄養の研究においてGCは、脂肪酸濃度の変化の評価は、介入の後、または妊娠などの生理的状態の変化の間に可能にする。アミノプロピルシリカカートリッジを使用して固相抽出（SPE）は、トリアシルグリセロール、様々なリン脂質、およびコレステリルエステル（CE）を含む主要な脂質クラスの分離を可能にする。 SPEと組み合わさGCは、種々の高および低脂肪食を給餌されたバージン及び妊娠ラットの肝臓におけるCE画分の脂肪酸組成の変化を分析するために使用した。肝臓CEのω-3およびω-6脂肪酸含有量に大きなダイエット/妊娠相互作用効果は、妊娠中の女性が食物manipulatに対して異なる応答を有することを示してありよりイオンは処女雌の間で見られます。

この方法の成功は、正確かつクロマトグラムにも表示される可能性が「ノイズ」と汚染を低減するために、きれいな溶媒および試薬を使用しているプロトコルを以下に依存します。汚染されたサンプルは、曲線下面積の計算の精度を低下させること、分析することがより困難である。プロトコルが明確な左右対称、明確に定義されたピークとし、最小限のバックグラウンドノイズで正常にクロマトグラムを続いている場合は、図3に示すように得られるべきである。汚染が発生した場合のクロマトグラムは、追加のピークが表示され、 図4に示すように非対称（スキュー）ピークを示す。 CE（コレステロールが削除されない限り、 図1を参照してください（プロトコル5を参照）から派生した名声を実行する際に遊離コレステロールからの汚染が発生します。 調製されたキャリブレーション混合物の使用は、目におけるFAMEの同定を可能Eサンプル。クロマトグラムを図2に示すように、それらの保持時間に基づいて、試料と正しく同定され...

妊娠は、母体組織の脂肪酸組成に有意な変化をもたらす。脂質プロフィールは、ラットの間で個々の脂質クラス内の脂肪酸の同定および定量は、妊娠中の種々の高および低脂肪食を給餌できるように、ガスクロマトグラフィーを介して得ることができる。

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

この手順の全体的な目的は、肝臓の脂肪酸組成を分析することです。まず、肝臓のサンプルを秤量し、ホモジナイズすることでこれを達成します。次のステップでは、ホモジナイズした肝臓サンプルからすべての脂質を抽出します。次に、コレステロールエステルなどの個別の脂質クラスを固相抽出を用いて分離します。最終ステップでは、脂質クラスを脂肪酸メチルエステルへと精製および誘導体化します。最終的に、ガスクロマトグラフィーを用いて、栄養介入後に組織の脂肪酸組成がどのように変化するか、あるいは妊娠などの生理的状態の変化によってどのような影響を受けるかを示します。この手法は組織の脂肪酸組成に関する知見を得るのに有用ですが、オイル、種子、食品などの他のサンプルタイプにも適用可能です。一般的に、本手法に不慣れなユーザーは、上層と下層の繰り返し回収など、プロトコルの一部で手先の器用さや練習を要するため、苦労する可能性があります。本手順のデモンストレーションは、当研究室の技術員であるHena Fisk氏と、博士課程の学生であるAnnette West氏が行います。まず、冷凍肝臓を約100 mg切り出し、組織の重量を測定します。組織を氷上のプラスチックチューブに入れ、氷冷した0.9%塩化ナトリウム溶液を0.5 mL加えます。その後、組織をホモジナイズし、ねじ込み蓋付きのガラスチューブに移します。さらに0.3 millilitersの0.9% sodium chlorideを用いて、残りの組織をガラス製ねじ蓋チューブに移します。次に、2:1の乾燥クロロホルムとメタノールの混合溶液に溶解した100 microgramsのcholesterol hepta dechen標準物質をチューブに加え、続いて50 milligrams per literのbutylated hydroxy tolueneを含む同溶媒溶液をさらに5 milliliters加えます。1 molar sodium chlorideを1 milliliter加えた後、チューブに蓋をし、サンプルが均一に見えるまでボルテックスミキサーで十分に混合します。次に、サンプルを室温で1000 ×g、10分間、低速ブレーキで遠心分離します。終了後、ガラスパステラーピペットを用いて下層を回収し、新しいスクリューキャップ付きガラスチューブに移します。その後、40 °Cで窒素気流下にてサンプルを乾燥させます。ここで、SPEタンクを真空ポンプに接続し、アミノプロピルシリカSPEカートリッジをタンクにセットします。最初の手分画を回収するため、TAGおよびCCEとラベルした新しいねじ蓋付きガラスチューブを、カラム下のタンクラックに配置します。全脂質抽出物を1 mLの乾燥クロロホルムに溶解し、ボルテックスミキサーでサンプルを混合します。次に、ガラスペーストピペットを用いてサンプルをカラムに移し、液体がスクリューキャップチューブに自然に滴下するようにします。カラムから液体が滴下しなくなったら、残った液体を真空吸引で除去します。続いて、真空条件下で1 mLの脱水クロロホルムを用いてカラムを2回洗浄し、TAGおよびCE分画を溶出させます。カラムからすべての液体が流出した後、TAGおよびCE画分を40°Cの窒素気流下で乾燥させます。新しいアミノプロピルシリカSPEカートリッジをSPEタンクに取り付け、カートリッジ下のタンクトレイにスクリューキャップ付きガラスチューブを配置して廃棄物を回収します。真空条件下で1 mLの乾燥ヘキサンを用いてカラムを3回洗浄します。真空ポンプを停止した後、1 mLのH hexaneを用いて重力降下法でカラムを洗浄します。廃液チューブを「ce」とラベル付けした新しいねじキャップ付きガラスチューブに交換し、乾燥させたTAGおよびCE画分を1 mLの脱水hexaneに溶解させ、ボルテックスミキサーで混合します。次に、ガラスパスまたはピペットを用いてサンプルをカラムに導入し、液体が重力でカラムを通過して滴下するようにします。カラムから液滴が落ちなくなった後、残った液体を真空下で除去します。ドライヘキサン1 mLでカラムを2回洗浄してCEを溶出させ、回収した分画を40 °Cで窒素気流下で乾燥させます。その後、分離したCE分画にドライトルエン0.5 mLを加え、ボルテックスでサンプルを混合します。あらかじめ調製したメチル化試薬1 mLを、乾燥トルエンに溶解したサンプルに加えます。その後、チューブのキャップをしっかりと閉めて混合します。サンプルを50 °Cで2時間緩やかに加熱します。サンプルが室温まで冷却されたら、中和溶液1 mLを加えます。次に、サンプルに乾燥ヘキサンを1量分加えます。ボルテックスミキシング後、室温で低速ブレーキ設定を用い、250 ×gで2分間遠心分離します。完了後、上層の有機相を回収し、新しいネジキャップなしの使い捨てガラスチューブに移します。回収した有機相サンプルを、40 °Cで窒素気流下にて乾燥させます。廃棄液チューブをSPEタンクに入れ、シリカゲルSPEカートリッジをタンクにセットした後、真空下で1 mLの乾燥ヘキサンを用いて3回洗浄し、続いて重力下で1 mLの乾燥ヘキサンを用いて洗浄します。洗浄液を廃棄した後、新しい廃棄液チューブをタンクに入れ、CE flameサンプルを1 mLの乾燥ヘキサンに溶解させます。ボルテックスでサンプルを混合した後、グラスパスまたはピペットを使用してカラムに移します。液体が重力でカラムを通過しきったら、真空条件下で1 mLのヘキサンを用いてカラムを3回洗浄します。次に、洗浄液を廃棄し、「CE fame」とラベルを貼った新しいnonsスクリューキャップチューブをタンクにセットします。CE flame分画を、乾式ヘキサンとジエチルエーテルの95:5混合液1 mLずつを用いて2回溶出させます。次に、回収した分画を40 °Cで窒素気流下で乾燥させ、乾燥分画を75 µLの乾式ヘキサンに溶解し、ボルテックスミキサーで混合します。前述の混合操作を繰り返した後、GCオートサンプラーバイアルに移します。プロトコルが正常に遂行された場合は、ガスクロマトグラフでサンプルを分析します。ここに示されているように、背景ノイズが最小限で、対称性が高く、明確に定義されたピークを持つクロマトグラムが得られるはずです。コンタミネーションが発生している場合、ここに示されているように、クロマトグラムに追加のピークが現れ、非対称または歪んだピークが認められます。遊離コレステロールを除去せずにCE由来のFAMEを分析すると、遊離コレステロールによるコンタミネーションが発生します。調製済みの校正用ミックスを使用することで、試料中のFAMEを同定することが可能です。校正用ミックスを試料と同じ装置設定で分析し、ここに示すように、クロマトグラムを試料と比較して保持時間に基づきピークを同定します。ここでは、上のクロマトグラムのキャリブレーションミックスと脂肪酸の保持時間を比較するため、16:0のピークを強調して示しています。下のサンプルチャートでは、脂肪酸のピーク面積を正しくラベル付けすることで、全体に占める特定の脂肪酸の割合を算出します。データ収集後、ここで示すように外れ値がないかを確認することが有用です。その後、外れ値のサンプルについてさらに調査し、必要に応じて抽出および分析を繰り返します。ここで示すように、ラット肝臓のCE（コレステリルエステル）におけるFAME（脂肪酸メチルエステル）は、肝臓CE内の総脂肪酸に対する割合（%）として記述されます。これらのデータは、3種類の異なる食事を20日間与えられた未交配または妊娠中のラットの肝臓におけるCE脂肪酸を示しています。二元配置分散分析（Innova）を用いた統計解析により、いくつかの脂肪酸の割合に対して食事および妊娠の有意な影響があること、ならびに食事と妊娠の有意な相互作用があることが明らかになりました。例として、妊娠したラットの肝臓CEにおけるオニ酸含有量は、未交配の雌よりも食事の影響を強く受けます。この手法を正しく実施すれば、1日あたり20検体の全工程を完了させることが可能です。習得すれば、サンプルのバッチ処理によりスループットを向上させ、1週間あたりの処理量を倍増させることができます。このビデオを視聴することで、固相抽出とガスクロマトグラフィーを用いて、個々の脂質クラスの脂肪酸組成を分析する方法について十分に理解できるはずです。溶剤の使用は非常に危険であるため、本手順の実施中は、常にドラフトチャンバー内での作業や適切なPPE（個人用保護具）の着用などの予防策を講じることを忘れないでください。

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化学

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学ぶガスクロマトグラフィーを用いたラット肝組織中の脂肪酸組成分析。妊娠中の脂質代謝変化と食事性脂肪の影響を評価し、脂質プロファイルの詳細な定量が可能です。

妊娠中にラット肝組織中の脂肪酸の組成変化を分析するために、ガスクロマトグラフィーの使用

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