妊娠中にラット肝組織中の脂肪酸の組成変化を分析するために、ガスクロマトグラフィーの使用

この手順の全体的な目標は、肝臓の脂肪酸組成を分析することです。これは、最初に肝臓のサンプルを秤量し、均質化することによって達成されます。2番目のステップは、均質化された肝臓サンプルからすべての脂質を抽出することです。

次に、コレステロールエステルなどの個々の脂質クラスを固相抽出法を用いて分離します。最後のステップは、脂質クラスの脂肪酸メチルエステルへの誘導体化です。最終的に、ガスクロマトグラフィーは、栄養介入後に組織の脂肪酸組成がどのように変化するか、または妊娠などの生理学的状態の変化によってどのように影響を受けるかを示すために使用されます。

この方法は、組織脂肪酸組成に関する洞察を提供しますが、油、種子、食品などの他のサンプルタイプにも適用できます。一般に、この手法に不慣れなユーザーは、プロトコルの一部が手先の器用さを必要とし、上部フェーズと下部フェーズの反復的な収集などの練習が必要なため、苦労する可能性があります。この手順を実演するのは、Hena、Fisk、そして私たちの研究室の技術者で博士課程の学生であるAnnette Westです。

まず、約100ミリグラムの凍結肝臓をカットし、組織の重量を量ります。ティッシュをアイスバケツのプラスチックチューブに入れ、0.5ミリリットルの氷冷、0.9%塩化ナトリウムを加えます。次に、組織を均質化し、ガラススクリューキャップ付きチューブに移します。

さらに0.3ミリリットルの0.9%塩化ナトリウムを使用して、残りの組織をガラススクリューキャップ付きチューブに移します。.これに続いて、100マイクログラムのコレステロールヘタデチェン標準を2対1に溶解した乾燥クロロホルムをメタノールにチューブに加え、続いて50ミリグラムのブチル化ヒドロキシトルエンを含む同じ溶媒溶液の5ミリリットルを追加します。1モル塩化ナトリウムを1ミリリットル加えた後、チューブにキャップをし、サンプルが均一になるまでボルテックスして完全に混合します。

次に、サンプルをGの1000倍で10分間遠心分離し、室温で低ブレークします。終了したら、ピペットを過ぎたガラスを使用して下相を収集し、新しいスクリューキャップガラス管に移します。次に、サンプルを摂氏40度の窒素下で乾燥させます。

この時点で、SPEタンクを真空ポンプに接続し、アミノプロピルシリカSPEカートリッジをタンクに置きます。TAGおよびCCEとラベル付けされた新しいスクリューキャップガラス管をカラムの下のタンクラックに置き、最初のフラクションを回収します。総脂質抽出物を1ミリリットルの乾燥クロロホルムに溶解し、サンプルをボルテックスして混合します。

その後、ガラスペーストピペットを使用してサンプルをカラムに移し、重力下で液体をスクリューキャップチューブに滴下させます。カラムから液滴が落ちなくなったら、残った液を真空で取り除きます。次に、1 mL の乾燥クロロホルムでカラムを真空下で 2 回洗浄することにより、TAG 画分と CE 画分を溶出します。

すべての液体がカラムから付着したら、TAGおよびCEフラクションを窒素下で摂氏40度で乾燥させます。新しいアミノプロピルシリカSPEカートリッジをSPEタンクに置き、カートリッジの下のタンクトレイにスクリューキャップガラス管を置いて廃棄物を収集します。カラムを1ミリリットルの乾燥ヘキサンで真空下で3回洗浄します。

バキュームをオフにした後、重力下で最後の1ミリリットルのHヘキサンでカラムを洗浄します。廃液チューブをceとラベル付けされた新しいスクリューキャップガラス管と交換した後、乾燥したTAGとCE画分を1ミリリットルの乾燥ヘキサンに溶解し、サンプルをボルテックスして混合します。次に、ガラスパスまたはピペットを使用してサンプルをカラムに移し、重力下で液体がカラムに滴下するのを待ちます。

カラムから液滴が落ちなくなったら、残った液を真空下真空下で取り除きます。カラムを1ミリリットルの乾燥ヘキサンで2回洗浄してCEを溶出し、収集した画分を40°Cの窒素下で乾燥させます。これに続いて、分離したCE画分に0.5ミリリットルの乾燥トルエンを加え、サンプルをボルテックスして混合します。

乾燥トルエンに溶解したサンプルに、あらかじめ調製したメチル化試薬1ミリリットルを加えます。次に、チューブにしっかりと蓋をして混合します サンプルを摂氏50度で2時間穏やかに加熱します。サンプルが室温まで冷えたら、1ミリリットルの中和液を加えます。

次に、乾燥ヘキサンの1つをサンプルに加えます ボルテックス遠心分離後、サンプルをGの250倍で室温で2分間低休憩します。終了したら、上部の名声相を収集し、新しい非スクリューキャップ使い捨てガラス管に移します。収集した名声サンプルを摂氏40度の窒素下で乾燥させます。

廃液チューブをSPEタンクに入れ、シリカゲル(SPEカートリッジ)をタンクに入れた後、真空下で1ミリリットルの乾燥ヘキサン、重力下で1ミリリットルの乾燥ヘキサンでカラムを3回洗浄します。廃棄物の除去後、洗浄します。新しい廃液チューブをタンクに追加し、CE名声サンプルを1ミリリットルの乾燥ヘキサンに溶解します。

サンプルをボルテックスで混合した後、ガラスパスまたはピペットを使用してサンプルをカラムに移します。重力下で液体がカラムに滴下したら、真空下で1ミリリットルのヘキサンでカラムを3回洗浄します。次に、廃棄物洗浄液を取り出し、CE名声とラベル付けされた新しい非スクリューキャップチューブをタンクに入れます。

95〜5乾燥ヘキサンの2つの1ミリリットルでCE名声画分をdエチルエーテルに溶出します。次に、収集した画分を摂氏40度の窒素下で乾燥させ、乾燥した画分を75マイクロリットルの乾燥ヘキサンに溶解し、サンプルをボルテックスで混合した後、サンプルをボルテックスして混合します。前のステップを繰り返した後、GC自動サンプルバイアルに移します。

プロトコルが正常に守られた場合は、ガスクロマトグラフでサンプルを分析します。ここに示すように、明確で対称的で明確に定義されたピークを持ち、バックグラウンドノイズが最小限に抑えられたクロマトグラムが得られるはずです。コンタミネーションが発生した場合、クロマトグラムには追加のピークが示され、ここに示すように非対称または歪んだピークが見られます。

遊離コレステロールによる汚染は、コレステロールが除去されない限り、CEに由来する名声を実行するときに発生します。調製したキャリブレーションミックスを使用することで、サンプル中の名声を特定することができます。キャリブレーションミックスは、サンプルと同じ装置設定を使用して実行されるため、ここに示すように、クロマトグラムをサンプルおよび保持時間に基づいて同定されたピークと比較できます。

ここでは、トップクロマトグラムのキャリブレーションミックスと脂肪酸の保持時間の比較を示すために、16 個のゼロピークを強調表示しています。下部のサンプルトレースでは、脂肪酸のピーク面積を正しく標識できるようにして、合計に占める特定の脂肪酸の割合を計算します。データが収集されたら、次に示すように、外れ値がないかデータを検査すると便利です。

その後、外れ値のサンプルをさらに調査し、必要に応じて抽出や分析を繰り返すことができます。ここに示すように、ラットの肝臓CE内の名声は、肝臓CE内の総脂肪酸の割合として説明されています。これらのデータは、3つの異なる食事療法のいずれかで20日間給餌された処女または妊娠中のラットの肝臓中のCE脂肪酸を説明しています。

2つの要因であるInnovaを用いた統計解析では、食事と妊娠がいくつかの脂肪酸の割合に有意な影響を与えるほか、妊娠相互作用による食事療法の有意な影響が明らかになりました。例として、妊娠中のラットの肝臓CEのオン酸含有量は、処女の女性よりも食事の影響を受けます。この手法では、正しく実行すれば、1日あたり20個のサンプルを最初から最後まで完成させることができます。

一度マスターすると、サンプルのバッチ処理により、スループットが向上し、1週間で処理される量が2倍になります。このビデオを見れば、固相抽出とガスクロマトグラフィーを使用して個々の脂質クラスの脂肪酸組成を分析する方法について十分に理解できるはずです。溶剤の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、ドラフトでの作業や適切なPPEの着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。