ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから、スケーラブルな高スループットの選択

このスケーラブルな手順の全体的な目標は、数百の抗原標的ドメインに対する並行選択を可能にするハイスループットアプローチを使用して、ファージ表示ライブラリから特異的で高親和性のファブファージクローンを単離することです。これは、まず精製された抗原ドメインをマイクロウェルプレートに固定化することによって達成されます。次のステップは、連続した選択ラウンドでマイクロプレート固定化抗原に特異的に結合するファブファージクローンを露光、捕捉、放出、および増幅することです。

このプロセスでは、選択の有効性は、各ステップでプールされた方法を使用して監視されます。最後のステップは、単離されたファブクローンの特異性、親和性、および/または活性を評価することです。最終的に、多数の抗原に対する特異的な高親和性fabフラグメントが並行して単離され、構造的または機能的に関連するタンパク質の全クラスの分析に有用な抗体の生成が可能になります。

この方法の重要性は、学術研究室や産業界の研究室において、従来の抗体開発技術の限界を克服し、ペースを加速させるのに役立つ代替手段を提供することにあります。ハイブリドーマなどの従来の抗体開発技術に対するこの技術の主な利点は、動物を使用する必要がないことです。毒性タンパク質や非免疫原性タンパク質など、ほぼすべてのタンパク質に使用できます。

これから見ていくように、これは容易に並列化でき、最終的には特定の抗原に特異的な高親和性抗体をコードする再生可能な組換えDNAと、機能的および標準的なイムノアッセイをわずか6〜8週間で得られます。生物医学の研究における抗体の重要性を考えると、私たちは、抗原生成と抗体の選択と同定をハイスループットアプローチに適応させ、拡大する機会を見出しました。同時に、規模と利用可能なリソースの両面でさまざまなラボへのアクセス性を維持しています。ファージ選択の日の朝に、T-1ファージ耐性e大腸菌細胞の単一のコロニーを選択します。

2yt培地のミリリットルに加え、テトラサイクリンを50マイクログラム/ミリリットルで加えます。コロニーを2.5cmのオービタルシェーカーで200RPMで振とうしながらインキュベートします。培養物の増殖が視覚的に明らかになったら、テトラサイクリンを添加した必要量の培地に細胞を移します。

選択井戸ごとに100マイクロリットル、または96ウェルあたり約10ミリリットルに十分な量が必要です。ウェルプレートは、培養物のアリコートをカーボンペニシリンとカニン添加培地の両方に拡大します。これらの培養物は、増幅に使用される細胞の事前感染を防ぎます。

培養物の光吸収率が595ナノメートルで0.4〜0.8に達するとき。5〜7時間後、細胞を抗原プレートに塗布する準備が整います。このプロトコルでは、ライブラリーの所望のカバレッジを確保するために、十分な複製抗原プレートおよび非特異的コントロールタンパク質プレートを調製します。

表示された計算の詳細を使用して、テキストプロトコルで提供されます。標的および非特異的制御タンパク質を一晩固定化した後、プレートからタンパク質溶液を除去します。200マイクロリットルのブロッキングバッファーを添加し、振とうしながら1時間ブロックし、プレートを4回洗浄してから、細胞が増殖している間にファージライブラリーを添加します。

ファージ選択の日には、100マイクロリットルのファージライブラリをネガティブセレクションプレートに移し、ネガティブセレクションを追加することで、非特異的またはタグ特異的に結合したファージが表示されたFABクローンをライブラリーから事前にクリアします。過剰な可溶性アフィニティータグを添加することにより、タグ結合ファージを除去します。これを行うには、それぞれに10マイクロモルの最終濃度の可溶性GSTを追加します。

次に、プレートを室温のシェーカーで1〜2時間インキュベートします。プレートから標的タンパク質プレート吸引タンパク質溶液を調製するには、200マイクロリットルのブロッキングバッファーを添加し、1時間ブロックし、4回振とうして洗浄してからファージライブラリーを添加します。インキュベーション後、プレートからファージスナットを回収します。

96チャネルリキッドハンドラーを使用して、ファージスピネートを抗原コーティングプレートに移します。その後、プレートを室温のシェーカーで1〜2時間インキュベートします。インキュベーション後、PTバッファーを使用してウェルを8〜15回洗浄することにより、結合していないファージを除去します。

これは、手動または自動プレートワッシャーを使用して行うことができます。次に、細胞を添加する直前に、細胞と抗原プレートの準備ができたら、余分な洗浄バッファーをすべて取り除きます。各ウェルに100マイクロリットルの増殖細胞を加えてファージを溶出し、プレートを摂氏37度で30分間インキュベートします。

最初の数回の選択ラウンドでは、大幅な濃縮は期待されていませんが、出力ファージ力価の定量化により、選択を成功させるために必要な最小ファージ濃度の錯覚を確保できます。これを行うには、ヘルパーファージを添加する前に細胞のアリコートを除去し、抗生物質を添加した寒天プレートに細胞の段階希釈液を調製してプレーティングすることにより、ファージ出力を引き締めることができます。30分間インキュベートした後、M 13 K oh 7ヘルパーファージを各ウェルに添加し、1ミリリットルあたり100億コロニー形成単位を濃縮します。

プレートをさらに45分間インキュベートし、今回は200 RPMで振とうします。次に、細胞を、ウェルごとに1.2ミリリットルの添加された2つのYT培地を含むV底を持つ96ウェルの深いウェルブロックに移します。ディープウェルプレートを摂氏37度で一晩インキュベートし、翌日200RPMで振とうします。

プレートを4, 000GSで摂氏4度で15分間回転させることにより、バクテリアをペレット化します。次に、各レプリケートプレートから、ファージを含む上清を同量ミニチューブに移します。プールされたファージへの選択のその後のラウンドの入力として使用する96ウェルマイクロプレートブルーボックス、10 XPBTの10番目のボリュームを1つ追加し、中和するために混合します。

次に、ライブラリからの選択プロセスを繰り返します。プレクリアランスと抗原ファージのインキュベーションは、前回の選択ラウンドから増幅されたファージを使用して3〜4回インキュベートします。これは、Eliza Microウェルプレートによる非特異的コントロールタンパク質の結合と比較して観察されるまでこれを行い、ライブラリの事前クリアランスおよび抗原ファージインキュベーションで前述したように、1ミリリットルあたり2マイクログラムの抗原またはコントロールタンパク質でコード化されたプレートをブロックし、洗浄し、ブロックして洗浄した抗原およびコントロールタンパク質コーティングプレートに100マイクロリットルの希釈ファージをウェルに適用し、プレートを振とうしながらインキュベートさせます。室温で15分 インキュベーション後、プレートをPTバッファーで8回洗浄します。

次に、洗浄後、100マイクロリットルの抗M 13 HRP抗体をPBT中の1〜5,000ルチオンで各ウェルに30分間インキュベートして、抗原結合ファージに抗体が結合できるようにします。次に、プレートをPTバッファーで6回、さらにストレートPBSで2回洗浄し、100マイクロリットルの1〜1個のTMB基質を各ウェルに調製、混合、および適用します。これを5〜15分間反応させ、色が大きく変化したときに反応を停止させます。

1モルリン酸を100マイクロリットル加えて反応を停止します。次に、450ナノメートルのウェル内の吸光度を読み取り、標的結合シグナルを濃縮後のコントロールタンパク質の結合シグナルと比較します。個々のクローンは、ファージのシーケンシング、遊離ファブに結合したファージのDNA変換、およびプロトコルのテキスト部分で説明されているように、クローンFabuLisaを使用した標的への直接結合の評価によって単離および特徴付けることができます。

より高いスループットが必要なラボでは、この方法論を拡張して自動化することができます。この目的を念頭に置いて、ブロッキング、ファージ、結合、elucianなど、手順のすべての側面を自動化することにより、選択能力を拡大できるカスタマイズされたロボット工学が開発されました。抗体選択に使用する抗原を取得するための1つのアプローチは、単離されたタンパク質ドメインの発現のためのコンストラクトを取得するための合成遺伝子技術の使用です。

ほとんどの場合、これにより、選択に適した量の十分に純度の高い精製抗原をハイスループットで発現し、単離することができます。選択プロセスの連続したラウンドでは、回避されたファージ濃度と抗原に特異的に結合したファージの濃縮を、前に示したようにファージ滴定によってモニターするか、ファージプールでモニターしました。ELAアッセイでは、結合比が2より大きい場合、一般に特定の結合クローンが存在することを示します。

逆に、比率が低いほど、選択の失敗の原因を特定するのに役立ちます。比色アミノアッセイを用いてクローン結合を特徴づけることで、結合ファブファージまたは固定化抗原への結合の比較と、結合ネガティブコントロールタンパク質の比較が可能になり、ロボットリキッドハンドリングユニットによる選択のスケーリングと自動化の際の特異性が得られます。吸収性発色団の使用は、流路系の特定のチャネルが詰まっているか、シールが失われ、部分的な体積送達をもたらす場合を検出するのに役立ち、洗浄手順の最適化中のトラブルシューティングに役立ちます。既知の結合クローンの使用により、ターゲット結合が維持され、バックグラウンド結合が洗浄中に除去されます。

さらに、効果的な除染プロトコルにより、連続した選択ラウンドまたは異なる選択手順による相互汚染がないことが保証され、テキストプロトコルで追加のトラブルシューティングパラメータを確認することをお勧めします。この技術を産業応用にスケールアップすることで、研究者が構造的または機能的に関連するタンパク質の全クラスを探索できるようにし、高親和性再生抗体の選択と同定を加速し、最終的にはプロテオームカバレッジを最大化することを目指します。