レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

この手順の全体的な目標は、生細胞内の単一RNA転写産物をリアルタイムでイメージングすることです。これは、最初に2つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって達成されます。このオリゴヌクレオチドは、分子ビーコンによるレシオメトリックとして知られるヘアピン形成プローブを形成するように設計されています。2番目のステップは、サイズ排除クロマトグラフィーによる分子ビーコンによる比率メトリックを精製することです。

次に、分子ビーコンによる比率メトリックを、マイクロポーリオンを介して操作されたRNAターゲットを発現する細胞に導入します。最後のステップは、生細胞顕微鏡に適したマイクロウェルプレートに細胞を入射することです。最終的に、蛍光顕微鏡法は、単一細胞内の明るい蛍光スポットとして視覚化された個々のRNA転写産物の動きを監視するために使用されます。

この技術の主な利点は、明るく光安定であり、バックグラウンドに高いシグナルを示す合成プローブを利用することであり、これにより、任意の内因性RNAをイメージングする可能性が広がります。 チューブ内で以下の試薬を混合することにより、分子ビーコンまたはRBM BSによる比率メトリックの準備を開始します。 20マイクロリットルのRbm B1 30マイクロリットルのRbm B2 6マイクロリットルの10 xリン酸緩衝液、 4マイクロリットルのDNAとRNAフリーウォーター。これは通常、約50件の研究に十分です。

混合物を室温で30分間インキュベートします。その間、UNハイブリダイズRBM B 2つのオリゴヌクレオチドを除去するための液体クロマトグラフィーカラムを調製します。毎分 0.6 ミリリットルの流量で作動するシリンジポンプを使用して、ベッド容量が約 4 ミリリットルの 8 ミリリットル液体クロマトグラフィーカラムに 75 プレップグレードのスーパーデッキを使用します。

すべての液体がベッドボリュームに入る前に、約50ミリリットルの1 x リン酸緩衝液でSUExを洗浄し、平衡化します。シリンジポンプを停止して取り外し、残りの液体を重力でカラムに通します。次に、RBMB混合物をクロマトグラフィーカラムにロードします。

RBMBサンプルがベッドに完全に入ったら、ベッドの上部にさらに250マイクロリットルの1 x リン酸緩衝液をゆっくりと追加して、サンプル全体がカラムに完全に入ったことを確認します。カラムの縁まで、1 x リン酸バッファーを充填します。上部を閉じて、シリンジポンプを始動します。

シリンジには約50ミリリットルのXPBSが充填され、毎分0.6ミリリットルの流量で作動します。通常、RBMBサンプルは、プローブに組み込まれた色素の色により、容易に視覚化できます。RBMBがカラムの底部に近づいたら、マイクロ遠心チューブあたり2滴で流れを回収します。

サンプルの収集を停止します。マイクロ遠心チューブ内のサンプルの色が明確になったら、色付きのRBMBサンプルが入ったチューブ(通常は5〜6本のチューブ)を結合し、遠心フィルター装置にロードします。サンプルを10, 000 RCFで20分間または所望の量になるまで遠心分離します。

この速度と時間により、通常、最終的な容量は約30マイクロリットルになります。このプロトコルでは、ヒト線維肉腫細胞株を、3つのプライムUTRにおけるRBMB標的配列の96タンデムリピートでQ-F-P-R-N-Aを発現するように操作し、対照細胞株は、40〜50%coの流暢培養でT 25フラスコ中のプローブ送達プレート細胞の1日前に野生型Q-F-P-R-N-Aを発現するように操作した。DMEM培地を1%連鎖球菌と10%ウシ胎児血清で補った細胞は、翌日に5%二酸化炭素と摂氏37度でインキュベー

マイクロポーをオンにして、HT 10 80セル用に最適化されたマイクロポートレーションパラメータを設定します。マイクロポリオンチューブに4ミリリットルの電解バッファーを入れ、マイクロプレパレーションステーションに置きます。精製したRBMBのストックサンプルを解凍し、1 x リン酸緩衝液で数マイクロリットルを最終濃度12マイクロモルに希釈します。

マイクロポリオン1個につき1マイクロリットルが必要です。マイクロポリオン反応ごとに、抗生物質を含まないFBS入りの培養液1ミリリットルをマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。マイクロポリオンデバイスの近くに脇に置きます。

これは、後でマイクロ調製直後に細胞を懸濁するために使用されます。抗生物質は、マイクロ調製後の細胞生存率を低下させるため、使用されません。前日に播種した人工HT 10 80細胞は、現在60〜80%コンフルエントになっているはずです。

細胞培養培地を取り出し、1ミリリットルのカルシウムとマグネシウムを含まないDPBSで細胞を1回洗浄し、1ミリリットルのトリプシンと1〜2分間インキュベートします。抗生物質とフェノールレッドを含まない10%胎児ウシ血清を添加したDMEM培地1ミリリットルを追加してトリプシンを停止し、細胞を2本の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。マイクロ遠心チューブ内の細胞をGの200倍で5分間スピンダウンします。

上清を取り除き、再懸濁し、細胞ペレットを最終容量の1ミリリットルDPBSに結合します。よく混合された細胞懸濁液から10マイクロリットルを取り出して細胞を数え、細胞を数回上下にピペットで動かして、それらが十分に分散していることを確認し、DPBSで300、000個の細胞を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。Gの200倍で5分間スピンダウンします。

細胞ペレットを乱さないように注意しながら上清を取り除きます。ペレットを11マイクロリットルのResus懸濁液に再懸濁し、緩衝液とピペットを数回上下させて、細胞が十分に分散していることを確認します。気泡が発生しないように注意してください。

希釈したRBMBを1マイクロリットル加え、ピペッティングで数回上下させてよく混ぜます。繰り返しになりますが、気泡が発生しないように注意してください。RBMBの販売サスペンションに気泡を持ち込むと、マイクロ操作中に気泡が発生し、RBMBの送達が不十分になり、細胞死が発生するため、気泡を吸い込まないようにすることが重要です。

マイクロ調製ピペットを使用して、RBMB細胞混合物の10マイクロリットルを吸引し、ピペットをマイクロ調製チューブに挿入します。スタートボタンを押して、マイクロコーポレーションを起動します。マイクロポーの画面が完成したときに、先端に目に見える気泡があってはなりません。

ステーションからピペットを取り外し、10マイクロリットルの混合物を、FBSを含む1ミリリットルの培養培地を含む前に準備したマイクロ遠心チューブに排出しますが、抗生物質はチューブを左右に数回揺らして穏やかに混合します。細胞をGの200倍で5分間回転させます。1ミリリットルのフェノールレッドフリー培地で細胞をFBSで2回洗浄しますが、抗生物質は使用せず、細胞に送達されなかったrbm BSを除去します。

2回目の洗浄後。Resusは、FBSを含む400マイクロリットルのフェノールレッドフリー培地に細胞を懸濁しますが、抗生物質は使用しません。マイクロ按分された細胞を、事前に調製したポリデリジンコーティングされた8ウェルチャンバーカバーガラスに、ウェルあたり200マイクロリットルまたは所望の流暢さでプレートします。

チャンバー付きカバーガラスを細胞培養インキュベーターに入れます。イメージングは、マイクロプレパレーション後30分で行うことができます。この手順を開始するには、生細胞ステージトップインキュベーションシステムをオンにし、摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度75%に達するまで平衡化します。

顕微鏡と蛍光灯の電源を入れ、metamorph画像取得ソフトウェアを開きます。対物レンズにイマーサルオイルを塗布します。マイクロポアドセルを充填したチャンバーカバーガラスを生細胞ステージに移します。

トップインキュベーションシステム。温度と二酸化炭素レベルが安定するまで、ステージトップシステムをインキュベートします。metamorphソフトウェアのacquireタブを開きます。

「ライブを表示」ボタンをクリックして、フィールドを見つけます。白色光の下でピントを調整し、ライブの停止ボタンをクリックします。[取得] タブの下。

ストリーム取得ポップアップボタンをクリックして開き、目的のムービー取得パラメータを設定します。SCI five CF six 40 R フィルターを使用して 150 フレームを取得します。画像をハードドライブに保存します。

ここに示されているのは、3 つのプライム UTR の RBMB 結合部位の 96 タンデム リピート、または 4 タンデム リピートで RNA を安定して発現する HT 10 80 細胞の代表的な画像です。mbsの細胞内送達後。96タンデムリピートの存在により、個々のRNA転写産物が明るい蛍光スポットとして現れることができます。

対照的に、タンデムリピートが4つしかないRNAは、非常に暗い蛍光スポットとして現れ、多くの場合、バックグラウンドが非常に低い領域でのみ検出できます。ストリーミング画像の取得により、個々のRNA転写産物をリアルタイムでイメージングすることができます。個々のRNA転写産物は、ブラウンまたはサブディフューシス運動を受けている細胞の細胞質および核内で容易に見ることができます。

まれに、ここに示すように、指向性輸送を受けているRNAが観察されます。指向性輸送を受けているRNA転写産物は、通常、直線的な経路に沿って急速に移動します。このモンタージュでは、RNA転写産物の軌跡が時系列の1つのフレームに重ねて示されています。

指向性RNAの動きは、微小管やマイクロフィラメントに沿ったRNAの輸送と一致しています。このビデオを見れば、分子ビーコンによる人種指標の準備と精製の方法についてよく理解できるはずです。マイクロパリオンを介して分子ビーコンによって細胞に人種指標を提供し、蛍光顕微鏡で単一RNA転写産物を画像化します。