レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

この手順の全体的な目的は、生細胞内の単一RNA転写産物をリアルタイムでイメージングすることです。これは、まず、レシオメトリック・分子ビーコンとして知られるヘアピン形成プローブを形成するように設計された2つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることで達成されます。次のステップは、サイズ排除クロマトグラフィーによってレシオメトリック・分子ビーコンを精製することです。

次に、マイクロポレーションを用いて、分子ビーコンによる比率指標を、設計されたRNA標的を発現している細胞に導入します。最終ステップとして、細胞をライブセル顕微鏡観察に適したマイクロウェルプレートに播種します。最終的に、蛍光顕微鏡を用いて、単一細胞内で明るい蛍光スポットとして可視化される個々のRNA転写物の動きをモニタリングします。

この手法の主な利点は、輝度が高く光安定性に優れ、S/N比の高い合成プローブを利用することであり、これによりあらゆる内因性RNAのイメージングが可能になることです。チューブ内で以下の試薬を混合し、分子ビーコンまたはRBM BSによるレシオメトリック測定の準備を開始します。Rbm B oneを20 µL、Rbm B twoを30 µL、10 x リン酸バッファーを6 µL、およびDNase/RNaseフリー水を4 µL加えます。通常、これで約50回の試験分に十分な量となります。

混合物を室温で30分間インキュベートします。その間に、未ハイブリダイズのRBM B twoオリゴヌクレオチドを除去するための液体クロマトグラフィーカラムを準備します。8 mLの液体クロマトグラフィーカラムに、ベッド体積約4 mLとなるように75 prep grade super deckを充填し、シリンジポンプを用いて0.6 mL/minの流速で操作します。

すべての液体がカラム容量を通過する前に、約50 mLの1×リン酸緩衝液を用いてSUExを洗浄および平衡化します。シリンジポンプを停止して取り外し、残りの液体を重力によりカラムに通過させます。次に、RBMB混合物をクロマトグラフィーカラムにロードします。

RBMBサンプルが完全にベッドに入った後、サンプル全体が確実にカラムに導入されるよう、1xリン酸バッファーをさらに250 µLゆっくりとベッド上部に加えます。その後、カラムの縁まで1xリン酸バッファーを満たします。上部を閉じ、シリンジポンプを始動させます。

シリンジに約 50 milliliters の 1X PBS を充填し、0.6 milliliters per minute の流速で流します。通常、プローブに組み込まれた色素の色により、RBMB サンプルを容易に視認できます。RBMB がカラムの底部に近づいたら、マイクロ遠心チューブ 1 本あたり 2 滴の割合で流出液を回収します。

サンプルの回収を停止します。マイクロ遠心チューブ内のサンプルの色が透明になったら、着色したRBMBサンプルを含むチューブ（通常は5〜6本）をまとめ、遠心フィルターデバイスにロードします。サンプルを10,000 RCFで20分間、または目的の容量になるまで遠心分離します。

この速度と時間で処理すると、通常、最終容量は約 30 µL になります。本プロトコルでは、3' UTRにRBMB標的配列を96回タンデムリピートさせてQ-F-P-R-N-Aを発現するように構築したヒト線維肉腫細胞株と、野生型Q-F-P-R-N-Aを発現するように構築したコントロール細胞株を使用しました。プローブ導入の1日前に、T 25フラスコ内で40～50%コンフルエントまで培養した細胞を、1% pen strepおよび10% fetal bovine serumを添加したDMEM培地を用いて、37 °C、5% CO2条件下でインキュベートし、翌日に処理を行いました。

マイクロポレーターの電源を入れ、HT 1080細胞用に最適化されたマイクロポレーションパラメータを設定します。マイクロポレーションチューブに4 mLの電解質バッファーを満たし、マイクロプレパレーションステーションに設置します。精製RBMBのストックサンプルを解凍し、数µLを1xリン酸バッファーで最終濃度12 µMに希釈します。

各マイクロポーションにつき1 µL必要です。各マイクロポーション反応のため、抗生物質を含まないFBS入り培地1 mLをマイクロ遠心チューブにピペットで分注します。これをマイクロポーションデバイスの近くに置いておきます。

これは、マイクロ調製直後に細胞を懸濁させるために後で使用します。マイクロ調製後の細胞生存率が低下するため、抗生物質は使用しません。前日に播種した遺伝子導入HT 10 80細胞は、現在60〜80%のコンフルエント状態になっているはずです。

細胞培養培地を除去し、カルシウムおよびマグネシウム不含のDPBS 1 mLで細胞を1回洗浄した後、トリプシン 1 mLを加えて1～2分間インキュベートします。抗生物質およびフェノールレッドを含まない10%胎児牛血清添加DMEM培地 1 mLを加えてトリプシン反応を停止させ、細胞を2本の1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。マイクロ遠心チューブを用いて、細胞を200 ×gで5分間遠心分離します。

上清を除去し、細胞ペレットを最終量 1 mL の DPBS で再懸濁してまとめます。よく混合した細胞懸濁液から 10 µL を分取して細胞数をカウントします。ピペッティングを数回繰り返し、細胞が十分に分散していることを確認した後、300,000 個の細胞を DPBS とともに新しい 1.5 mL マイクロ遠心チューブに移します。200 ×g で 5 分間遠心分離します。

細胞ペレットを乱さないように注意しながら、上清を除去します。ペレットを11 µLのResus suspension bufferに再懸濁し、細胞が十分に分散するようにピペッティングを数回行います。この際、気泡が混入しないように注意してください。

希釈したRBMBを1 µL加え、ピペッティングで数回混ぜ合わせます。ここでも、気泡が混入しないように細心の注意を払ってください。RBMB懸濁液に気泡が入ると、マイクロ操作中にスパークが発生し、RBMBの供給不良や細胞死を招くため、気泡の混入を避けることが極めて重要です。

マイクロプレパレーションピペットを使用して、RBMB細胞混合液を10 µL吸引し、マイクロプレパレーションチューブにピペットを挿入します。スタートボタンを押して、マイクロコーポレーションを開始します。マイクロポアの画面に完了が表示されたとき、チップ内に目に見える気泡がないことを確認してください。

ピペットをステーションから取り外し、10 µLの混合液を、あらかじめ準備したFBS含有・抗生物質不含の培養液1 mLが入ったマイクロ遠心チューブに分注し、チューブを数回左右に揺らして緩やかに混ぜ合わせます。細胞を200 ×gで5分間遠心分離します。細胞内に導入されなかったrbm BSを除去するため、FBS含有・抗生物質不含のフェノールレッドフリー培養液1 mLで細胞を2回洗浄します。

2回目の洗浄後、細胞をFBS含有・抗生物質不含のフェノールレッドフリー培地 400 µL で再懸濁します。準備済みのポリリジンコート 8ウェルチャンバーカバーグラスに、1ウェルあたり 200 µL または希望のコンフルエンシーで細胞を播種します。

チャンバー付きカバーガラスを細胞培養インキュベーターに入れます。イメージングは、マイクロプレパレーションの後30分で実施可能です。この手順を開始するには、ライブセルステージ上のインキュベーションシステムをオンにし、37 °C、5%二酸化炭素、75%湿度に達するまで平衡化させてください。

顕微鏡と蛍光光源の電源を入れ、MetaMorph画像取得ソフトウェアを起動します。対物レンズに浸油を塗布します。微細孔細胞が載ったチャンバーカバーガラスをライブセルステージに移します。

ステージトップインキュベーションシステム。温度と二酸化炭素濃度が安定するまで、ステージトップシステム内でインキュベートします。MetamorphソフトウェアのAcquireタブを開きます。

「show live」ボタンをクリックして視野を確認します。白色光下でフォーカスを調整し、「stop live」ボタンをクリックします。「acquire」タブの下で操作します。

ストリーム取得ポップアップボタンをクリックして開き、希望する動画取得パラメータを設定します。SCI five CF six 40 Rフィルターを使用して、150フレームを取得します。画像をハードドライブに保存してください。

ここでは、3' UTRにRBMB結合部位の96回タンデムリピート、または4回タンデムリピートを持つRNAを安定的に発現させたHT 10 80細胞の代表的な画像を示します。mbsを細胞内に導入した後の状態です。96回のタンデムリピートが存在することで、個々のRNA転写産物が明るい蛍光スポットとして観察されます。

対照的に、4つのタンデムリピートのみを含むRNAは非常に暗い蛍光スポットとして現れ、背景が極めて低い領域でしか検出できないことが多い。ストリーミング画像の取得により、個々のRNA転写物をリアルタイムでイメージングすることが可能になる。細胞の細胞質および核内において、ブラウン運動またはサブディフューシブ運動を行う個々のRNA転写物を容易に観察することができる。

稀なケースとして、ここで示すように、指向性輸送を受けるRNAが観察されることがあります。指向性輸送を受けるRNA転写産物は、通常、直線的な経路に沿って急速に移動します。このモンタージュでは、時系列の1フレームの上にRNA転写産物の軌跡が重ねて表示されています。

方向性を持ったRNAの移動は、微小管およびマイクロフィラメントに沿ったRNAの輸送と一致しています。このビデオを視聴することで、分子ビーコンを用いたRNAメトリックの調製および精製方法について深く理解することができます。また、マイクロパレーションによる分子ビーコンを用いたRNAメトリックの細胞内導入、および蛍光顕微鏡による単一RNA転写物のイメージングについても習得できます。