Name: レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: 学ぶレシオメトリック二分子ビーコンを用いた生細胞内単一RNA転写物のリアルタイム蛍光イメージング法。マイクロポレーションによるプローブ導入と蛍光顕微鏡観察でRNA動態を可視化し、細胞内RNA挙動の理解に貢献します。

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この作品は、国立科学財団キャリア賞（0953583）と健康NCI / R21-CA116102総合研究所、NCI / R21-CA125088、NIBIB / R01-EB012065、NCI / R01-CA157766によってサポートされていました。

このプロトコルでは、一つのオリゴヌクレオチド（RBMB1）はCF640Rレポーター色素とその5 &#39;末端で標識され、配列：5&#39;mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC mUのmGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC MUMU-3&#39;。ヘアピン構造の形成を推進自己相補的ドメインは、太字で示しています。第二のオリゴヌクレオチド（RBMB2）はアイオワブラックRQ-Spをクエンチャーとの3 &#39;末端で標識され、配列を有した：5&#39;-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3&#39;。 RBMBsの調製<ol><li> RBMB1とRBMB2オリゴヌクレオチドを​​含有するチューブの迅速なスピンを行って、乾燥したオリゴヌクレオチドは、100μMの最終濃度までDNaseおよびRNaseフリー水中のチューブの底、再懸濁にあることを確認します。例えば、オリゴヌクレオチドの10ナノモルサンプルは100μlの水に再懸濁されるべきである。 </li><li> [測定URE紫外可視分光法によるRBMB1とRBMB2株式サンプルの正確な濃度。 <ol><li>マイクロチューブ117μlのDPBS（カルシウム及びマグネシウムを含まない）でRBMBサンプル3μlのを混ぜる。 </li><li> DPBSでブランク分光光度計とは、200〜800 nmの吸光度から測定します。注：ピークは260nmでの吸光度から650nmが見えるはずです。 </li><li>の式を用いて、260nmの（またはRBMB1 650 nm）における吸光度に基づいてRBMB試料のストック濃度を計算する： ストック濃度（M）は260で 260 nmでの吸光度と希釈係数が40である260 *希釈係数/吸光係数=。 注：RBMBの吸光係数は、オリゴヌクレオチドの製造元が提供する仕様書に記載されています。 650nmにおけるCF640Rの吸光係数は103,000である。 </li></ol></li><li> 100μMのRBMB120μlの100μMのRBMB230μlの、6μlの10倍を混ぜる;リン酸緩衝液（10×リン酸緩衝液：480mMのK 2 HPO 4、45mMのKH 2 PO 4、140mMのNaH 2 PO 4、pH7.2）で4μlのDNaseおよびRNaseフリー水。 30分間室温で混合物をインキュベートする。注：これは、典型的には、約50の研究のために十分である。 </li><li>いずれのハイブリダイズしていないRBMB2オリゴヌクレオチドを​​除去するために75調製グレードスーパーデックスを用いた液体クロマトグラフィーカラムを準備します。混合プローブの小さな体積を精製する〜4ミリリットルの総容積で8mLの（0.7×20cm）に、液体クロマトグラフィーカラムを使用してください。 </li><li>洗浄を、0.6 ml /分の流速でフローで動作するシリンジポンプを用いて〜1×リン酸緩衝液の50ミリリットルを平衡化したSuperdex。流体のすべてがベッドボリュームに入る前に、それを外し、シリンジポンプを停止し、残りの液体は、重力によってカラムを通過してみましょう。 </li><li>クロマトグラフィーカラムにRBMB混合物（60μl）をロードします。 <ol><li> RBMBサンプルは完全にした後にゆっくりと試料全体が完全にカラムに入ったことを確認するために、ベッドの上部に1×リン酸緩衝液の別の250μlのを追加し、ベッドに入った。 </li><li> 1×リン酸緩衝液でリムに列を入力します。上部を閉じて、シリンジポンプを起動 - シリンジ〜50ミリリットル1×PBSを充填した0.6 ml /分の流速で実行されるべきである。 </li><li> RBMBたら塔の底部に近づく - RBMBサンプルは一般的に容易に起因するプローブに組み込まれた染料の色に可視化することができる - フロースルー微量遠心チューブあたり2滴（1.5ミリリットル）で収集します。マイクロチューブ内の色が明らかになった時点で、サンプルの収集を停止。 </li></ol></li><li>通常は5-6チューブ - - 色のRBMBサンプルを含むチューブを組み合わせ、遠心フィルター装置（10,000 MWカットオフ）にロードする。 20分間または所望の体積になるまで万RCFでサンプルを遠心。注：これらの速度と時間は、一般的になります〜30μlの最終容量が得られる。 </li><li>紫外可視分光法により、精製RBMBサンプルの正確な濃度を測定する。 <ol><li>濃厚RBMBサンプル3μLを取り、マイクロチューブに117μlのDPBSで混ぜる。 </li><li> DPBSでブランク分光光度計とは、200〜800 nmの吸光度から測定します。注：ピークは260nmでの吸光度から650nmが見えるはずです。 </li><li>の式を用いて、650nmでの吸光度に基づいて、ハイブリダイズしたRBMBのストック濃度を計算する： ストック濃度（M）は650で 650 nmの吸光度で650 *希釈係数/絶滅係数=、希釈係数は40である。 注：650nmの時CF640Rの吸光係数は103,000であり、アイオワ州ブラックRQの吸光係数は〜20,000。吸光係数は、添加剤であり、ハイブリダイゼーションは区別されません。したがって、在庫RBMBサンプルはapproximatelの組み合わせ吸光係数を有する650nmでのy 123000。 </li></ol></li><li>将来の使用のために-20℃での名前と濃度とストアに適切にチューブにラベルを付けます。 </li></ol> 8ウェルチェンカバーガラスコーティングされたポリ-D-リジンの調製<ol><li>無菌環境に滅菌水25ml中のポリ-D-リジン（凍結乾燥粉末、g線照射）5mgを溶解することによって、ポリ-D-リジン0.2 mg / mlの溶液を調製する。 </li><li>無菌環境で、8ウェルチャンバーカバーガラスの各ウェルに0.2 mg / mlのポリ-D-リジン溶液200μlを追加します。 </li><li>細胞培養フード内で16〜18時間、室温でインキュベートする。 </li><li>ポリ-D-リジンを吸引し、滅菌蒸留水でウェルを3回洗浄する。注：コーティングされたチャンバースライドを4℃で保存することができる。 </li></ol> 3プローブ配信注：使用した細胞系は、少なくとも4順次結合してRNAを発現する統合された遺伝子構築物を含むべきで3 &#39;非翻訳領域（UTR）にRBMBのための部位をる。標的配列はRBMBのループに相補的であるべきである。これは、陰性対照として、同じ細胞株が、タンデムリピートなしで、同じ遺伝子構築物を発現するように操作されることをお勧めします。このプロトコルでは、ヒト線維肉腫細胞株HT1080は、3&#39;-UTRにおけるRBMB標的配列の96タンデムリピートを有するGFPの RNAを発現するように操作した。コントロール細胞株は、野生型GFPの RNAを発現するように操作した。 <ol><li>一日のプローブ配達の前40〜50％の集密度でT25フラスコ中で細胞をプレート。培養DMEM培地で細胞を1％のペニシリン/ストレプトマイシンおよび10％ウシ胎児血清（FBS）を補充し、そして5％CO 2、37℃でインキュベートする。 </li><li>次の日は、microporatorをオンにし、950 V、2パルス、25ミリ秒に微小穿孔のパラメータを設定してください。注：これらのパラメータは、HT1080細胞のために最適化されてきたが、それらは、細胞型に依存しており、adjusことができます製造業者の取扱説明書に記載されるような他の細胞型のためテッド。 </li><li> 4ミリリットルの電解液とのマイクロポチューブを記入し、マイクロポ·ステーションの上に置きます。 </li><li>精製されたRBMBの在庫サンプルを取り出して、それを解凍。 1×リン酸緩衝液で12μMの最終濃度になるように、いくつかのマイクロリットルに希釈する。 1μlを各微小穿孔のために必要とされる。 </li><li>ピペットFBSを有するがマイクロ遠心チューブに抗生物質を含まない培養液1ミリリットル。注：これは当分の間、マイクロポ機器の近くで、マイクロポ直後に細胞を懸濁するために使用され、取っておくことができます。培養培地中の抗生物質を含めることは、マイクロポレーション後の細胞生存率を減少させる。 </li><li>一回1ミリリットルのCa 2 +およびMg 2 +を含まないDPBSで細胞を洗浄、操作されたHT1080細胞（60〜80％コンフルエント）から細胞培養培地を取り出し、1〜2分間1ミリリットルトリプシンでインキュベートする。 </li><li> trypsinizatioを停止します抗生物質およびフェノールレッドを含まない10％ウシ胎児血清を補充した1ミリリットルDMEM培地を添加すること、および2つの1.5mlのマイクロチューブに細胞を移すことによりn。 </li><li> 5分間200×gで遠心チューブ中で細胞をスピンダウン。上清を除去し、再懸濁し、1mlのDPBSの最終体積で細胞ペレットを兼ね備えています。 </li><li>よく混合細胞懸濁液から10μLを取り、細胞をカウントします。 </li><li>必ず彼らはよく分散されていることを確認し、新しい1.5 mlのマイクロチューブにDPBSで300,000細胞を転送し、5分間200×gでスピンダウンするには、上下に数回の細胞をピペット。 </li><li>細胞ペレットを乱さないように注意しながら、上清を除去します。細胞を十分に分散されることを保証するために11μlの再懸濁緩衝液とピペット最大で数回上下ペレットを再懸濁する。気泡を発生しないように注意してください。注意：空気の泡がマイクロポ中に火花が発生し、貧しいRBMB配信や細胞死をもたらすであろう。 </li><li>希釈されたRBMB（12μM）を1μlを加え、ピペッティングにより数回上下よく混ぜる。ここでも気泡を生成しないように注意してください。 </li><li>吸引除去RBMB細胞液10μl、マイクロポピペットを用いて、マイクロポチューブにピペットを挿入します。マイクロポを開始するには、スタートボタンを押してください。注意：先端には目に見える気泡があってはならない。 </li><li> microporatorの画面が完了したことを示している場合には、FBSを1ミリリットルの培養液ではなく、抗生物質を含まない、先に作製したマイクロ遠心チューブに10μlの混合物を排出する、駅からピペットを取り外します。チューブ左右に数回揺動により穏やかに混合します。 </li><li> 5分間200×gで細胞をスピンし、細胞内に送達されなかったRBMBsを除去するために、FBSを1ミリリットルのフェノールレッドを含まない培養液ではなく、抗生物質を含まない、細胞をさらに2回洗浄する。 FBSを除いた全ての400μlのフェノールレッドを含まない培養培地で再懸濁抗生物質。 </li><li>ポリ-D-リジンへのプレートmicroporated細胞はウェルあたり200μlので、又は所望の密集度で8ウェルチャンバーカバーガラスをコーティングした。 </li><li>オプション：それは核イメージすることが望ましい場合、0.01ミリグラム/ mlの最終濃度で細胞にヘキスト33342を追加する。 </li><li>細胞培養インキュベーターにチャンバーカバーガラスを配置します。細胞がカバーガラス表面に落ち着くのに十分な時間を持つように、撮像前に1〜2時間、細胞をインキュベートする。注：イメージングは​​、30分後にマイクロポとすぐに行うことができる。 </li></ol> 4。画像取得<ol><li>生細胞期トップのインキュベーションシステムの電源を入れ、37℃、5％のCO 2、および75％の湿度に達するまで平衡化。 </li><li>顕微鏡と蛍光光源をオンにして、をMetaMorphソフトウェアを開きます。注：顕微鏡制御と画像取得のための他の同様のソフトウェア·パッケージを使用することもできる。 </li><li>にImmersolオイルを塗布する目的。 </li><li>生細胞期トップインキュベーションシステムにmicroporated細胞とチャンバーカバーガラスを転送します。温度までステージ天システムをインキュベートし、CO 2レベルが安定化される。 </li><li>をMetamorphソフトウェアで、[取得]タブを開きます。 、フィールドを見つけるためにショーのライブボタンをクリックして、白色光の下で焦点を調整し、[停止ライブ]ボタンをクリックします。 </li><li> [取得]タブで、クリックして、ストリーム取得ポップアップボタンを開き、目的の映画の収集パラメータを設定します。のCy5 / CF640Rフィルターを使用して150フレームを取得し、ハードドライブに画像を保存します。 </li></ol>

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博士マークBehlke博士陵黄は原稿に記載された化合物の一部に類似の販売のためのオリゴヌクレオチドを​​提供していますどのIDTによって採用されている。 IDTは株式公開企業、しかし、ではない、彼らは個人的には、IDT内の任意の株式/持分を所有していない。

従来の広視野顕微鏡を用いて、生きた細胞内の画像の単一設計されたRNA転写する能力は、各RNA転写物と結合していない蛍光プローブから発せられる低蛍光バックグラウンドに関連付けられる、明るく光安定蛍光シグナルを必要とします。この方法では、明るい蛍光シグナルは、各RNA転写物の上に、（96まで）の複数のオリゴヌクレオチドに基づく蛍光プローブ、 すなわち RBMBsをハイブリダイズさせることによって達成される。しかし、わずか4つのバインディングサイトは16で十分です。集団的信号をリアルタイムで追跡することができ、明るい蛍光スポットになる。集合的信号が失われる前に、蛍光色素の実質的な部分を光退色されなければならないので、複数のプローブの存在はまた、より長いイメージング時間を可能にする。なお、この技術は、RNA生物にユニークな洞察を提供し、目の測定範囲のRNAの挙動の広範囲の研究を可能にすることが想定されるさまざまな外部刺激へのRNA輸送の電子応答、RNAの運命と寿命に勉強し、そしてRNA規制への洞察を提供する、標的RNAのユニークな細胞内局在パターンを観察する。それに加えて、RNA発現の変化（ すな...

RNA転写物の発現および調節は、細胞の挙動と運命を制御するための主な原因であり、複雑で動的なプロセスである。細胞機能を口述におけるRNAの重要性は以前から知​​られているが、ほとんどのRNAの解析ツールは、このような転写破裂、RNAなどの重要な調節事象を捕捉するために必要な空間および時間分解能を欠いているので、両者の間に明確な接続を描画することはしばしば困難である人身売買、およびローカライズされたRNAプロセシング。これは、個別のRNA転写物がリアルタイム1に生細胞内で可視化することを可能にするいくつかの技術の出現につながっている。おそらく、これらの技術の最も顕著な3&#39;-UTR 2,3にMS2結合部位の縦列反復を含むように操作されたRNAを標的とGFP-MS2融合タンパク質を利用する。近接さ、複数のGFP分子をもたらすことで、個別のRNA転写物は、明るい蛍光スポットとして表示され蛍光顕微鏡を経由。 GFP-MS2システムは、直接可視化および転写の測定値4,5破裂 、ユニークな細胞内局在および処理6-9の検出、およびRNA輸送10のリアルタイムイメージングを含む、RNAの挙動に前例のない洞察を、提供してきました。しかし、GFP-MS2システムの大きな可能性にもかかわらず、結合していないGFP-MS2融合タンパク質は汎用性とこの技術のダイナミックレンジを制限する高いバックグラウンド蛍光信号を生成することができる。いくつかのアプローチは、タンパク質断片相補11、及び代替RNA結合タンパク質と12を標的に結合していないGFP-MS2 10の細胞内区画化を含む、このバックグラウンド信号を制限するために開発されてきた。しかしながら、これらのアプローチの全ては、RNA標的とGFP-MS2融合タンパク質の相対的な総発現に対して感受性のままである。 AとしてGFP-MS2システムにlternative、分子ビーコンはまた、3&#39;-UTR 13,14における相補的な結合部位の縦列反復して操作されたRNA転写物を検出するために使用されてきた。分子ビーコンは、クエンチャーで、蛍光レポーターと他方の端部に一端で標識されているヘアピン形成オリゴヌクレオチドプローブである。標的RNAに結合されていない場合には蛍光レポーターとクエンチャーは、低蛍光状態になり、すぐ近くに残っています。ハイブリダイゼーションの際、蛍光レポーターとクエンチャーが離れて強制されると蛍光が復元されます。 GFP-MS2システムと同様、蛍光顕微鏡によって同定することができる明るい蛍光スポットにおける単一のRNA転写産物をもたらす上に複数の分子ビーコンの結合;しかしながら、バックグラウンド蛍光は、未結合の分子ビーコンの急冷構成に起因はるかに低いことが期待される。残念なことに、m個に組み込まれる巧妙な活性化メカニズムにもかかわらずolecularビーコンデザイン、生きている細胞に導入された場合にハイブリダイズしていない分子ビーコンは、ヘアピンコンフォメーションに残っていないことを成長している証拠がある。したがって、それらは有意にシグナル対バックグラウンドを低減する偽陽性シグナルを生成する。 15,16;この欠点を克服するために、私たちは最近、生きている細胞、レシオメトリック二分子ビーコン（ 図1A RBMBs）で画像化RNAのための新しい合成プローブを開発しました。 RBMBsは、短いヘアピンRNA（shRNA）、および分子ビーコンの両方から特徴を有するハイブリッド構造を形成する2つの2&#39;-O-メチルオリゴヌクレオチド鎖から構成されている。 3&#39;-UUオーバーハングの長い二本鎖ドメインはshRNAのより特徴的である間ループし、蛍光活性化機構は、分子ビーコンに似ています。 shRNAの機能は、核輸出を駆動するように設計されている私たちは&gt; 24時間に増加した細胞内寿命を見つけている、最小限の観察劣化し、ループの非特異的な開口を防止する。結果RBMBsは、分子ビーコンよりも有意に高いシグナル対バックグラウンドを示した。 これは、DNAベースのプローブは、RNAベースのプローブと同じ核外輸送機能を有していないのでRBMBsは、DNAオリゴヌクレオチドを​​用いて調製することができないことに留意すべきである。構造的に、RBMBループは、典型的には、RNAのハイブリダイゼーションの際の特異性および選択性の間のバランスを作成するために、長い15と21塩基の間であるように設計されている。 2つの自己相補的なドメインから構成する短いステムは、通常、4塩基であるように設計されている。長いステムが選択されている場合、RBMBループと標的RNAとのハイブリダイゼーションの速度は著しく17,18を減速される。より短いステム配列が選択されたとき、逆に溶融温度が高いバックグラウンドシグナルをもたらす、37℃でステムループ構造を維持するために頻繁に低すぎる。 RBMBの特異性も赤です茎長が短くなるようにuced。 RBMBステム-ループの配列はまた、RBMB性能に影響を与えることができるので、19を慎重に選択しなければならない。具体的には、理想的なループ配列は、最小の二次構造を有するべきである最小の二次構造を有するRNA配列にハイブリダイズし、タンパク質結合部位を回避し、および結合オフターゲットを回避する。 RBMBおよびRNA二次構造の両方の予測は、MFOLD 20などのソフトウェアを使用して得ることができる。コンプリメンタリオフターゲット部位は、ヌクレオチドの基本的なローカル割り付け検索ツール（BLAST）を使用して識別することができます。しかし、モデル予測およびタンパク質入札機関部位を同定することが困難に不整合により、すべてのRBMBsの特異性は、最終的には実験的に検証する必要があります。 望ましい場合には、ハイブリダイゼーション状態の影響を受けない非消光参照色素はRBMB 15に加えることができる。参照色素の添加は、PRができるプローブの配信のためにマーカーをovide全細胞蛍光のより正確な測定が必要な場合は、レシオメトリックイメージングに使用される。リファレンス色素は測定が送達細胞間のばらつきに起因バックグラウンドの差を調整することができる。しかし、個別のRNAを撮像する際は、参照色素を必要としない転写産物。注目すべきことに、いくつかの基準色素は核内でわずかに高いバックグラウンドシグナルをもたらし、核からRBMBsの輸出を妨害する可能性がある。 適切に設計されたときに、標的RNAは、少なくとも4つのRBMB結合部位（ 図1B）16 を含むように操作された場合、RBMBsは、単一の生細胞内の画像個別のRNA転写物に使用することができる。 RBMBsを効率的に細胞生存率21全く影響がほとんどで、マイクロポレーションを介して細胞タイプの広い範囲内に送達することができ、遺伝子発現の定量的測定であることができる30分以内に取得しました。結合していないRBMBsからの蛍光を効率的に消光されるので、方法論は、RBMB濃度と標的RNAのレベルにかなり鈍感である。ここでは、マイクロポリアルタイムで単一のRNA転写物の画像化を介して生細胞へRBMBsを準備し、精製するために使用される方法の詳細な説明、ならびにRBMBsの送達のための一般的な手順を提供する。

<table><tbody><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>AM9932</td><td>DEPC処理なし</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 14190-144</td><td>Ca2+およびMg2+</sup</td></tr><tr><td>>Cary 100 UV-Vis分光光度計</td><td>アジレント・テクノロジー</td><td></td><td></td></tr>ズ <tr><td>リン酸二塩基性カリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P284-500</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>ナトリウム一塩基性</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S381-500</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>22364111</td><td>1.5 ml</td></tr><tr><td>クロマトグラフィーカラム</td><td>キンブルチェイスライフサイエンス</td><td>420400-0720</td><td>0.7 x 20 cm</td></tr><tr><td>Superdex 75 プレップグレード</td><td>GEヘルスケア</td><td>17-1044-01</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-300</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD</td><td>301035</td><td>60 ml、ルアーロックチップ</td></tr><tr><td>遠心フィルターユニット</td><td>ミリポア</td><td>UFC501096</td><td>MW 10,000 カットオフ</td></tr><tr><td>遠心分離機 5418</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280-5MG</td><td>凍結乾燥粉末、g-照射済み</td></tr><tr><td>8ウェルチャンバーカバーグラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>155409</td><td>作業量 0.2-0.5 ml</td></tr><tr><td>HT1080</td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td>ヒト線維肉腫細胞株</td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ</td><td>コーニング</td><td>430639</td><td>25 cm2</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッドを含まない</td>高グルコースDMEM <td>Life Technologies</td><td>21063029</td>高<td>グルコース</td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ペネシリン/ストレプトマイシン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ</td> 15140122 <td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 25300054</td><td>0.05% トリプシン-EDTA</td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステム</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステムキット</td><td>ライフテクノロジー</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>ヘシュト 33342</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ H1399</td><td></td></tr><tr><td>IX-81 倒立蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLAライトエンジン</td><td>ルーメンコール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタモル</td><td>フィカルデバイス</td><td></td><td>ソフトウェア制御顕微鏡</td></tr><tr><td>Immersol oil 518F</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66B</td><td></td></tr></tbody></table>

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのrna転写物のリアルタイムイメージング

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

両方の遺伝子発現の時間的および空間的調節は細胞機能に重要な影響を持つことができ、成長の実現は、単一の生細胞内の個別のRNA転写産物を視覚化するために多様な技術が開発された。最近記載されている一つの有望な技術は、3 &#39;非翻訳領域におけるRBMB標的配列の少なくとも4つのタンデムリピートを含むように操作されたRNA転写産物を検出するためのオリゴヌクレオチドベースの光プローブ、レシオメトリック二分子ビーコン（RBMB）を利用する。 RBMBsを具体的に相補的なRNAへのハイブリダイゼーションの際に、明るい蛍光シグナルを発するように設計されているが、それ以外は急冷されたままになります。この方法で合成プローブの使用は、赤方偏移し、光安定性を可能にし、高度に発光性有機染料は、画像形成に使用される。広視野蛍光顕微鏡下で見たときの離散蛍光スポットにおける工学的RNA転写産物の結果を複数のRBMBsの結合。したがって、個別のRNA転写物の移動が容易に蛍光画像の時系列を取ることによって、リアルタイムで可視化することができる。ここでは、マイクロポと単一のRNA転写物の生細胞イメージングによる細胞への送達、RBMBsの調製および精製を記載している。

広視野蛍光顕微鏡で画像化する際まもなくRBMBsの存在下で、HT1080細胞のマイクロポ以下、それらの3&#39;-UTR内の複数RBMB結合部位を含むように操作された個別のRNA転写物（ 図2）のように明るい蛍光スポットとして表示されます。わずか4つのRBMB結合部位を有する個別のRNA転写物は、生細胞内で画像化することができるが、3&#39;-UTRにおける結合部位よりRBMB、強い蛍光シグナル。信号は光退色に失われる前にまた、より長い各転写産物に結合しているより多くのRBMBsは、RNAを可視化することができる。このプロトコルでは、RNAは、3&#39;-UTRにおけるRBMB標的配列の96タンデムリピートを含有するように構築された。ストリーミング画像の取得は、個別のRNA転写産物は、リアルタイム（ 動画1）で結像されることを可能にする。個別のRNA転写物は、容易に細胞質および核O内で移​​動することがわかる細胞F。スポットのほとんどはブラウンまたはサブ拡散運動を受けるように見えるが、まれに向け輸送を受けているRNAは、（ 動画2）</strong...

レシオメトリック二分子ビーコン（RBMBs）は、生細胞内の画像の単一操作されたRNA転写物に使用することができる。ここでは、マイクロポリアルタイムで単一のRNA転写物の蛍光イメージングによる細胞内へのRBMBsの配信、RBMBsの調製および精製を記載している。

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

この手順の全体的な目的は、生細胞内の単一RNA転写産物をリアルタイムでイメージングすることです。これは、まず、レシオメトリック・分子ビーコンとして知られるヘアピン形成プローブを形成するように設計された2つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることで達成されます。次のステップは、サイズ排除クロマトグラフィーによってレシオメトリック・分子ビーコンを精製することです。次に、マイクロポレーションを用いて、分子ビーコンによる比率指標を、設計されたRNA標的を発現している細胞に導入します。最終ステップとして、細胞をライブセル顕微鏡観察に適したマイクロウェルプレートに播種します。最終的に、蛍光顕微鏡を用いて、単一細胞内で明るい蛍光スポットとして可視化される個々のRNA転写物の動きをモニタリングします。この手法の主な利点は、輝度が高く光安定性に優れ、S/N比の高い合成プローブを利用することであり、これによりあらゆる内因性RNAのイメージングが可能になることです。チューブ内で以下の試薬を混合し、分子ビーコンまたはRBM BSによるレシオメトリック測定の準備を開始します。Rbm B oneを20 µL、Rbm B twoを30 µL、10 x リン酸バッファーを6 µL、およびDNase/RNaseフリー水を4 µL加えます。通常、これで約50回の試験分に十分な量となります。混合物を室温で30分間インキュベートします。その間に、未ハイブリダイズのRBM B twoオリゴヌクレオチドを除去するための液体クロマトグラフィーカラムを準備します。8 mLの液体クロマトグラフィーカラムに、ベッド体積約4 mLとなるように75 prep grade super deckを充填し、シリンジポンプを用いて0.6 mL/minの流速で操作します。すべての液体がカラム容量を通過する前に、約50 mLの1×リン酸緩衝液を用いてSUExを洗浄および平衡化します。シリンジポンプを停止して取り外し、残りの液体を重力によりカラムに通過させます。次に、RBMB混合物をクロマトグラフィーカラムにロードします。RBMBサンプルが完全にベッドに入った後、サンプル全体が確実にカラムに導入されるよう、1xリン酸バッファーをさらに250 µLゆっくりとベッド上部に加えます。その後、カラムの縁まで1xリン酸バッファーを満たします。上部を閉じ、シリンジポンプを始動させます。シリンジに約 50 milliliters の 1X PBS を充填し、0.6 milliliters per minute の流速で流します。通常、プローブに組み込まれた色素の色により、RBMB サンプルを容易に視認できます。RBMB がカラムの底部に近づいたら、マイクロ遠心チューブ 1 本あたり 2 滴の割合で流出液を回収します。サンプルの回収を停止します。マイクロ遠心チューブ内のサンプルの色が透明になったら、着色したRBMBサンプルを含むチューブ（通常は5〜6本）をまとめ、遠心フィルターデバイスにロードします。サンプルを10,000 RCFで20分間、または目的の容量になるまで遠心分離します。この速度と時間で処理すると、通常、最終容量は約 30 µL になります。本プロトコルでは、3' UTRにRBMB標的配列を96回タンデムリピートさせてQ-F-P-R-N-Aを発現するように構築したヒト線維肉腫細胞株と、野生型Q-F-P-R-N-Aを発現するように構築したコントロール細胞株を使用しました。プローブ導入の1日前に、T 25フラスコ内で40～50%コンフルエントまで培養した細胞を、1% pen strepおよび10% fetal bovine serumを添加したDMEM培地を用いて、37 °C、5% CO2条件下でインキュベートし、翌日に処理を行いました。マイクロポレーターの電源を入れ、HT 1080細胞用に最適化されたマイクロポレーションパラメータを設定します。マイクロポレーションチューブに4 mLの電解質バッファーを満たし、マイクロプレパレーションステーションに設置します。精製RBMBのストックサンプルを解凍し、数µLを1xリン酸バッファーで最終濃度12 µMに希釈します。各マイクロポーションにつき1 µL必要です。各マイクロポーション反応のため、抗生物質を含まないFBS入り培地1 mLをマイクロ遠心チューブにピペットで分注します。これをマイクロポーションデバイスの近くに置いておきます。これは、マイクロ調製直後に細胞を懸濁させるために後で使用します。マイクロ調製後の細胞生存率が低下するため、抗生物質は使用しません。前日に播種した遺伝子導入HT 10 80細胞は、現在60〜80%のコンフルエント状態になっているはずです。細胞培養培地を除去し、カルシウムおよびマグネシウム不含のDPBS 1 mLで細胞を1回洗浄した後、トリプシン 1 mLを加えて1～2分間インキュベートします。抗生物質およびフェノールレッドを含まない10%胎児牛血清添加DMEM培地 1 mLを加えてトリプシン反応を停止させ、細胞を2本の1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。マイクロ遠心チューブを用いて、細胞を200 ×gで5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞ペレットを最終量 1 mL の DPBS で再懸濁してまとめます。よく混合した細胞懸濁液から 10 µL を分取して細胞数をカウントします。ピペッティングを数回繰り返し、細胞が十分に分散していることを確認した後、300,000 個の細胞を DPBS とともに新しい 1.5 mL マイクロ遠心チューブに移します。200 ×g で 5 分間遠心分離します。細胞ペレットを乱さないように注意しながら、上清を除去します。ペレットを11 µLのResus suspension bufferに再懸濁し、細胞が十分に分散するようにピペッティングを数回行います。この際、気泡が混入しないように注意してください。希釈したRBMBを1 µL加え、ピペッティングで数回混ぜ合わせます。ここでも、気泡が混入しないように細心の注意を払ってください。RBMB懸濁液に気泡が入ると、マイクロ操作中にスパークが発生し、RBMBの供給不良や細胞死を招くため、気泡の混入を避けることが極めて重要です。マイクロプレパレーションピペットを使用して、RBMB細胞混合液を10 µL吸引し、マイクロプレパレーションチューブにピペットを挿入します。スタートボタンを押して、マイクロコーポレーションを開始します。マイクロポアの画面に完了が表示されたとき、チップ内に目に見える気泡がないことを確認してください。ピペットをステーションから取り外し、10 µLの混合液を、あらかじめ準備したFBS含有・抗生物質不含の培養液1 mLが入ったマイクロ遠心チューブに分注し、チューブを数回左右に揺らして緩やかに混ぜ合わせます。細胞を200 ×gで5分間遠心分離します。細胞内に導入されなかったrbm BSを除去するため、FBS含有・抗生物質不含のフェノールレッドフリー培養液1 mLで細胞を2回洗浄します。2回目の洗浄後、細胞をFBS含有・抗生物質不含のフェノールレッドフリー培地 400 µL で再懸濁します。準備済みのポリリジンコート 8ウェルチャンバーカバーグラスに、1ウェルあたり 200 µL または希望のコンフルエンシーで細胞を播種します。チャンバー付きカバーガラスを細胞培養インキュベーターに入れます。イメージングは、マイクロプレパレーションの後30分で実施可能です。この手順を開始するには、ライブセルステージ上のインキュベーションシステムをオンにし、37 °C、5%二酸化炭素、75%湿度に達するまで平衡化させてください。顕微鏡と蛍光光源の電源を入れ、MetaMorph画像取得ソフトウェアを起動します。対物レンズに浸油を塗布します。微細孔細胞が載ったチャンバーカバーガラスをライブセルステージに移します。ステージトップインキュベーションシステム。温度と二酸化炭素濃度が安定するまで、ステージトップシステム内でインキュベートします。MetamorphソフトウェアのAcquireタブを開きます。「show live」ボタンをクリックして視野を確認します。白色光下でフォーカスを調整し、「stop live」ボタンをクリックします。「acquire」タブの下で操作します。ストリーム取得ポップアップボタンをクリックして開き、希望する動画取得パラメータを設定します。SCI five CF six 40 Rフィルターを使用して、150フレームを取得します。画像をハードドライブに保存してください。ここでは、3' UTRにRBMB結合部位の96回タンデムリピート、または4回タンデムリピートを持つRNAを安定的に発現させたHT 10 80細胞の代表的な画像を示します。mbsを細胞内に導入した後の状態です。96回のタンデムリピートが存在することで、個々のRNA転写産物が明るい蛍光スポットとして観察されます。対照的に、4つのタンデムリピートのみを含むRNAは非常に暗い蛍光スポットとして現れ、背景が極めて低い領域でしか検出できないことが多い。ストリーミング画像の取得により、個々のRNA転写物をリアルタイムでイメージングすることが可能になる。細胞の細胞質および核内において、ブラウン運動またはサブディフューシブ運動を行う個々のRNA転写物を容易に観察することができる。稀なケースとして、ここで示すように、指向性輸送を受けるRNAが観察されることがあります。指向性輸送を受けるRNA転写産物は、通常、直線的な経路に沿って急速に移動します。このモンタージュでは、時系列の1フレームの上にRNA転写産物の軌跡が重ねて表示されています。方向性を持ったRNAの移動は、微小管およびマイクロフィラメントに沿ったRNAの輸送と一致しています。このビデオを視聴することで、分子ビーコンを用いたRNAメトリックの調製および精製方法について深く理解することができます。また、マイクロパレーションによる分子ビーコンを用いたRNAメトリックの細胞内導入、および蛍光顕微鏡による単一RNA転写物のイメージングについても習得できます。

real-time-imaging-single-engineered-rna-transcripts-living-cells

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

RNAポリメラーゼII転写反応速度は、生きた細胞内の特定の遺伝子を測定しています。興味のある遺伝子から転写されるmRNAは、蛍光標識と（FRAP）転写伸長の生体内動態が得られる光退色後蛍光回復を使用しています。...

単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定

我々は、画像への開裂により蛍光顕微鏡法、共同翻訳活性化（CoTrAC）、タンパク質の機能を乱すことなく、単一分子の精度で生細胞中のタンパク質分子の製造を記述している。このメソッドは、転写因子、λリプレッサーCIの確率の発現動態を追跡するために使用されています...

遺伝子調節の1分子蛍光イメージング<emインビボ&gt;</em&gt;開裂により同時翻訳アクティベーションの使用（CoTrAC）

本稿では、蛍光標識 DNA プローブ、エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光用と個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書を表示する方法について説明します。smFISH は、同時検出、ローカリゼーション、および固定の個々 の細胞における mRNA...

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

ここでは、分子ビーコン、スピニングディスク共焦点顕微鏡、オープンソース分析を用いたライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNA人身売買の可視化、検出、分析、追跡のためのプロトコルを提示する。ソフトウェア。...

ライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNAの可視化と追跡

このプロトコルは、mRNA合成および分解のインビボ運動を測定するための一分子蛍光をその場所でのハイブリダイゼーション(smFISH)での適用について説明する。...

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

個々の翻訳イベントを追跡することで、キャップ依存翻訳メカニズムの高解像度の運動研究が可能になります。ここでは、蛍光標識抗体とエピトープタグ付き新生ペプチドとのイメージング相互作用に基づく インビトロ 単分子アッセイを示す。この方法は、 インビトロ...

キャップ依存翻訳キネティクス解析のための インビトロ 単分子イメージングアッセイ

この場合の単一分子RNA蛍光蛍光(smFISH)は、単一細胞レベルで特異的なRNAのレベルおよび局在を正確に定量する方法です。ここでは、特定のRNAの単一細胞定量化のためのウェットベンチ処理、イメージングおよび画像解析のための検証済みのラボプロトコルを報告します。...

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

ビーズローディングは、タンパク質、プラスミド、および粒子を付着した哺乳類細胞に導入します。この細胞ローディング技術は、安価で迅速であり、細胞の健康に実質的に影響を与えません。ライブセルイメージングに最適です。...

ビーズは、接着性ヒト細胞にタンパク質と核酸をロード

このプロトコルは、新しいレポーター遺伝子システムと、一分子感受性を有するDNA二本鎖破断時の転写を検出するための実験的セットアップを提示する。...

DNA二重鎖破断時の転写活性の生細胞イメージング

このプロトコルの目的は、リボグロウプローブの定量的な蛍光寿命測定を、vitro、生体哺乳類細胞、三次元細胞モデルでの再現可能なRNAイメージングワークフローを可能にすることです。サンプル準備、プローブ投与、データ取得、定量解析のワークフローを概説し、バイアスなし蛍光寿命測定を抽出します。...

生体哺乳類細胞および三次元細胞モデルにおける蛍光寿命イメージングの基礎としてのリボグロウプローブのin vitro 特性解析

学ぶレシオメトリック二分子ビーコンを用いた生細胞内単一RNA転写物のリアルタイム蛍光イメージング法。マイクロポレーションによるプローブ導入と蛍光顕微鏡観察でRNA動態を可視化し、細胞内RNA挙動の理解に貢献します。

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

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