Name: トランスジェニック齧歯類アッセイ男性生殖細胞変異頻度を定量化するための (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T15:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: 学ぶトランスジェニック齧歯類アッセイによる男性生殖細胞変異頻度の定量化法。環境変異原の影響を直接測定し、感度向上と資源削減を実現する遺伝毒性学の重要手法です。

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この研究は、カナダのバイオテクノロジー規制システム（CRSB）および化学物質管理計画（CMP）のイニシアチブによって資金提供されました。

<ol><li>Ahmadi, A., Ng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilizing+ability+of+DNA-damaged+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa.</a> J. Exp. Zool. 284 (6), 696-704 (1999).</li>
<li>Crow, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins%2C+patterns+and+implications+of+human+spontaneous+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation.</a> Nat. Rev. Genet. 1 (1), 40-47 (2000).</li>
<li>Nelson, K., Holmes, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malformations+due+to+presumed+spontaneous+mutations+in+newborn+infants%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Malformations due to presumed spontaneous mutations in newborn infants.</a> N. Engl. J. Med. 320 (1), 19-23 (1989).</li>
<li>Kong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+de+novo+mutations+and+the+importance+of+father%27s+age+to+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rate of de novo mutations and the importance of father's age to disease risk.</a> Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).</li>
<li>Michaelson, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequencing+in+autism+identifies+hot+spots+for+de+novo+germline+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequencing in autism identifies hot spots for de novo germline mutation.</a> Cell. 151 (7), 1431-1442 (2012).</li>
<li>Marchetti, F., Wyrobek, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+decline+during+mouse+spermiogenesis+results+in+the+accumulation+of+heritable+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">DNA repair decline during mouse spermiogenesis results in the accumulation of heritable DNA damage.</a> DNA Repair (Amst). 7 (4), 572-581 (2008).</li>
<li>Marchetti, F., Wyrobek, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+consequences+of+paternally-transmitted+chromosomal+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+C.+Embryo.+Today%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and consequences of paternally-transmitted chromosomal abnormalities.</a> Birth Defects Res. C. Embryo. Today. 75 (2), 112-129 (2005).</li>
<li>Demarini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Declaring+the+existence+of+human+germ-cell+mutagens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Declaring the existence of human germ-cell mutagens.</a> Environ. Mol. Mutagen. 53 (3), 166-172 (2012).</li>
<li>Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+dominant-lethal+test+to+detect+genetic+activity+of+environmental+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health.+Perspect%22%5BJournal%5D)">Use of the dominant-lethal test to detect genetic activity of environmental chemicals.</a> Environ. Health. Perspect. 6, 23-26 (1973).</li>
<li>Russell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray-induced+mutations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">X-ray-induced mutations in mice.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 16, 327-336 (1951).</li>
<li>Singer, T. M., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+mutagens%3A+Risk+assessment+challenges+in+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Germ cell mutagens: Risk assessment challenges in the 21st century.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51 (8-9), 919-928 (2010).</li>
<li>Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, P., Eriksson, S., Tornqvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide%3A+A+cooking+carcinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Acrylamide: A cooking carcinogen.</a> Chem. Res. Toxicol. 13 (6), 517-522 (2000).</li>
<li>Witt, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow+micronucleus+test+results+do+not+predict+the+germ+cell+mutagenicity+of+N-hydroxymethylacrylamide+in+the+mouse+dominant+lethal+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow micronucleus test results do not predict the germ cell mutagenicity of N-hydroxymethylacrylamide in the mouse dominant lethal assay.</a> Environ. Mol. Mutagen. 41 (2), 111-120 (2003).</li>
<li>Marchetti, F., Rowan-Carroll, A., Williams, A., Polyzos, A., Berndt-Weis, M. L., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sidestream+tobacco+smoke+is+a+male+germ+cell+mutagen%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Sidestream tobacco smoke is a male germ cell mutagen.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), 12811-12814 (2011).</li>
<li>Yauk, C. L., Dubrova, Y. E., Grant, G. R., Jeffreys, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single+molecule+analysis+of+spontaneous+and+radiation-induced+mutation+at+a+mouse+tandem+repeat+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus.</a> Mutat. Res. 500 (1-2), 147-156 (2002).</li>
<li>Niwa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+mechanisms+of+genomic+instability+and+the+biological+significance+of+mutations+at+tandem+repeat+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Indirect mechanisms of genomic instability and the biological significance of mutations at tandem repeat loci.</a> Mutat. Res. 598 (1-2), 61-72 (2006).</li>
<li>Campbell, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+human+mutation+rate+using+autozygosity+in+a+founder+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Estimating the human mutation rate using autozygosity in a founder population.</a> Nat. Genet. 44 (11), 1277-1281 (2012).</li>
<li>Beal, M. A., Glenn, T. C., Somers, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+sequencing+for+quantifying+germline+mutation+frequency+in+humans+and+model+species%3A+Cautious+optimism%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Whole genome sequencing for quantifying germline mutation frequency in humans and model species: Cautious optimism.</a> Mutat. Res. 750 (2), 96-106 (2012).</li>
<li>Shwed, P. S., Crosthwait, J., Douglas, G. R., Seligy, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+MutaMouse+lambdagt10-lacZ+transgene%3A+Evidence+for+in+vivo+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Characterisation of MutaMouse lambdagt10-lacZ transgene: Evidence for in vivo rearrangements.</a> Mutagenesis. 25 (6), 609-616 (2010).</li>
<li>Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+review+of+transgenic+rodent+mutation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Detailed review of transgenic rodent mutation assays.</a> Mutat. Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guideline+for+the+testing+of+chemicals%3A+Transgenic+rodent+somatic+and+germ+cell+gene+mutation+assays%22">OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays</a>. , (2011).</li>
<li>Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testes+weight+reflect+ethylnitrosourea+induced+histopathology+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice.</a> Toxicol. Lett. 17 (1-2), 77-80 (1983).</li>
<li>Russell, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+male+germ-cell+stage+on+the+frequency%2C+nature%2C+and+spectrum+of+induced+specific-locus+mutations+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse.</a> Genetica. 122 (1), 25-36 (2004).</li>
<li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+sperm+and+artificial+insemination+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting sperm and artificial insemination of mice.</a> J. Vis. Exp. (3), 184(2007).</li>
<li>Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+galactose-sensitive+E.+coli+strains+as+selective+hosts+for+LacZ-+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids.</a> Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254(1992).</li>
<li>Lemieux, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+benzo%5Ba%5Dpyrene-induced+pig-a+and+lacZ+mutations%2C+micronuclei+and+DNA+adducts+in+muta+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse.</a> Environ. Mol. Mutagen. 52 (9), 756-765 (2011).</li>
<li>Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+molecular+characteristics+of+mutations+induced+by+ethylnitrosourea+in+germ+cells+isolated+from+seminiferous+tubules+and+in+spermatozoa+of+lacZ+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (16), 7485-7489 (1995).</li>
<li>Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose--response+curve+for+ethylnitrosourea-induced+specific-locus+mutations+in+mouse+spermatogonia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dose--response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (11), 3589-3591 (1982).</li>
<li>Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cII+locus+in+the+MutaMouse+system%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">The cII locus in the MutaMouse system.</a> Environ. Mol. Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).</li>
<li>Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+induced+male+germline+mutation%3A+Correlations+and+comparisons+between+traditional+germline+mutation+assays%2C+transgenic+rodent+assays+and+expanded+simple+tandem+repeat+instability+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays.</a> Mutat. Res. 598 (1-2), 164-193 (2006).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

従来の方法と比較して、TGR生殖細胞突然変異アッセイは、 インビボで生殖細胞突然変異を誘発され定量化するより速く、より経済的で、かつより高感度な手段を提供する。子孫とは対照的に精子を直接導入遺伝子MFを評価することによって、動物の数は、任意の単一化合物の生殖細胞変異原性を評価するために必要な時間およびリソースが大幅に低減される。感度の点では、用量群ごとに5匹の動物を用いて、25mg / kgののENUへの曝露後の精原幹細胞MFが大幅に2.6倍の増加を検出することができた。これとは対照的に、特定の遺伝子座アッセイは、使用してこの同じ用量で、MFに有意な変化を検出することができませんでした&gt;曝露群における3000マウス&gt;50万対照マウス28。 両方の機構的および規制調査のための適性に加えて、この方法は、体細胞および生殖系列mutati間の比較研究のための機会を提供率に。最近の証拠は、いくつかの薬剤のための生殖細胞変異は体細胞変異のために必要とされるよりも低い濃度で誘導され得ることを示唆している。例えば、N-ヒドロキシメチルアクリルアミドへの長期暴露は、食品の発癌物質アクリルアミド12の代謝産物は、赤血球中の小核頻度、体細胞遺伝学的損傷13の伝統的な尺度に影響を与えることなく、マウスにおける優性致死生殖細胞変異の頻度を増大させる。さらに、両方の主流と副流タバコ煙に対するマウスの曝露は、血液小核頻度14を増加させない用量での精子におけるタンデムリピートのDNA座で上昇した変異頻度が発生します。これらの知見は、体細胞遺伝毒性試験は常に生殖細胞系の保護的であるという仮定に挑戦し、生殖細胞変異頻度を定量化するためのより効率的で費用効果的な手段の需要を強化する。しかし、優先的な生殖細胞変異原性の証拠はまだ弱いです、主に体細胞および生殖細胞組織に突然変異率を比較するための利用可能なデータが不足しているため。 TGRの突然変異試験は、並列テストと同じ導入遺伝子を使用して、複数の組織における誘発突然変異率の比較を可能にする。したがって、TGRアッセイを用いた比較突然変異検査は、優先生殖細胞効果の可能性を取り囲むデータギャップを埋めるために役立つだろう。 規制試験のための体細胞および生殖細胞変異の同時評価はまた、必要な動物の数を減らすことにより効率を改善するであろう。体細胞変異のためのOECDガイドラインは、3日間のサンプリング時間（+ 3 28）に続いて、28日の管理時間を推奨しています。それは精子形成の精母細胞と精細胞相（ 図3）の間、主に曝露された細胞を標的とするので、尾部精子の分析は、この時点で貧弱な感度を提供することがあります。これらの段階の細胞はDNAを合成し、漸進的にDNA修復のための6能力を失うことはありません&lt;/ SUP&gt;。さらに、この時点でのサンプリング尾精子は精原幹細胞に存在する変異を検出するために失敗していました。このように、28 +3設計への統合のために、OECDガイドラインは、精細管から生殖細胞を採取することをお勧めします。この混合集団は、DNA合成および幹細胞を含む修復熟練した細胞型由来の細胞を含み、精子形成の段階の大部分にわたって露出している。しかし、これらの細胞の混合性質のために、精細管の細胞分析は、相固有の情報を提供していません。また、非標的細胞の存在が観察されたMFに影響を与えることができることが懸念される（ 例えばによるDNA修復欠損の生殖細胞から変異した生殖細胞シグナルの突然変異した体細胞の汚染、または希釈に偽陽性の生殖細胞変異呼び出し） 。現在、28 + 3申し出同じ感度と特異性aにおける精細管細胞からの結果かどうかを結論付けるには不十分なデータが存在する後の時点でのS尾部精子。当研究室では現在、この点に対処するために、さまざまなサンプリング時間後に収集精細管細胞及び尾部精子における誘導のMFを比較している。私たちは、OECDガイドラインがゆっくりなども生殖細胞分析に適している可能性がある肝臓のような組織を分割するための28日間の代替的なサンプリング時間を示唆していることに注意してください。それにもかかわらず、利用可能なデータはまだ不十分であり、当社は現在、規制テスト用のTGRの突然変異アッセイを用いて、体細胞および生殖細胞の同時分析のための1つの実験計画をお勧めすることはできません。 注目すべきであるこのアッセイの一つの特徴は、変異事象は、非マウスのトランスジーンで評価されていることである。しかし、導入遺伝子が内因性遺伝子20と同様の方法で、環境変異原に応答することを示唆する十分な証拠がある。さらに、独立した突然変異事象の正確な起源はすることは困難であるため、解決し、結果は、一般に、（変異頻度とは対照的に）変異頻度として報告される。結果はクローン拡大のために補正されている場合は、実際の変異頻度を解消することができる（ すなわち 、導入遺伝子変異体の観察された頻度に寄与することができる単一の変異細胞の分裂および乗算）DNA配列決定によってを。変異体遺伝子の配列決定は、lacZの変異を特徴付けるために行われ、これは、分析の時間とコストを大幅に追加されたが、クローン性増殖事象に由来することができる変異体を同定することができる。短い（294 3021塩基対lacZの対塩基、 図1）および29の配列決定が容易になり、λ のcII遺伝子の変異体：lacZ遺伝子に加えて、theλgt10トランスジェニックベクターは、代替的な温度依存性の変異レポーター遺伝子を保有する。配列決定はまたmutatioへの洞察を提供し、誘導された突然変異スペクトルの解析を可能にする問題の化合物の内部メカニズム。クローン性増殖の極端な例では、「ジャックポット」の突然変異の発生である（ すなわち 、劇的に上昇したMFに貢献臓器の開発の非常に早い段階で、導入遺伝子変異、時には何百背景よりも大きい数千倍まで）。 「ジャックポット」変異を有する動物または組織は、分析から削除する必要があります。 私たちが説明したアッセイは、例えば、（20に総説）、同様の変異レポーターベクターを保有するこれらの全てはBigBlueマウスおよびラット、およびlacZプラスミドマウスなどの他のTGRのモデルに広く適用可能である。同様の方法を採用して今日までに行われ、生殖細胞の研究の大部分は、そのようなENUおよび（30に概説される）放射線とほぼ独占的に上のよく特徴付け変異原を当てている。これは、TGRのアッセイのためのOECDテストガイドラインの最近のリリースで、このアッセイはなることが予想される化学スクリーニングおよび規制評価のためにますます人気。規制テストバッテリーにTGR生殖細胞突然変異試験の組み込みは、生殖細胞11における突然変異誘発の効率的な評価を可能にすることにより、既存のギャップを埋める。さらに、このアッセイは、同一の遺伝的エンドポイントでの環境因子による突然変異の誘発に体細胞および生殖細胞の相対感度を比較するための適切な手段を提供し、実質的に任意の組織においてMFを測定するために使用することができる。

生殖細胞における散発DNA変異は、減少し繁殖成功につながることや、継承された場合には、子孫1-3で癌に対する遺伝的疾患または高められた素因の原因となります。実質的な証拠が新生突然変異の大部分は父方の生殖細胞系列4から継承されることを示している、と子孫における変異の数は、積極的に受胎5の時に父方の年齢と相関していること。男性の突然変異のより高い割合が男女間の配偶子形成時の年齢差の結果であると考えられている、女性の生殖細胞系列2 oogenic細胞分裂の数と比較して精子形成細胞分裂より多くの、そしてDNAの進行性の低下男性では年齢とともに修復効率。これらの要因はすべて、男性の生殖細胞系列6の複製エラーの確率が増加に寄与している。しかし、父方の暴露の影響は、エンバイロする新生突然変異の頻度にnmental要因は不明である。それにもかかわらず、環境因子の多数のげっ歯類7の生殖細胞突然変異を誘発することが知られており、これらの薬剤のいくつかは、ヒト生殖細胞系8に影響を与えることができることの証拠があるれている。これらの懸念にもかかわらず、化学物質が日常的に規制目的のために体細胞において変異を誘導するそれらの能力について試験し、それは一般的に体細胞試験は生殖細胞を保護するのに十分であると仮定する。したがって、化学物質はまれにしか生殖細胞突然変異を誘導するそれらの能力について評価されていない。 生殖細胞変異原性試験は、主に規制意思決定プロセスから省略されている一つの理由は、実用的な方法論の欠如である。このような優性致死9および特定の遺伝子座10のテストなどの伝統的な齧歯類ベースの方法は、胚または子孫の変異表現型をスコアリングすることにより生殖細胞突然変異率を推定露出した両親。これらのアッセイは、統計的に意味のある結果を取得するために、動物、時間とリソースの非常に多数の使用を必要とする。 生殖細胞変異を定量化するためのいくつかの近代的な方法は、最近浮上しているが、多くは彼らの実用性、効率性、および生物学的関連性の面で欠点を抱えている。例えば、遺伝子座は、単一分子PCR法15を用いて、雄性生殖細胞に定量することができる拡張した単純なタンデムリピート（エストル）で長さ変異を繰り返す。しかし、この方法の実行は技術的に困難かつ面倒であることができ、点突然変異とは異なり、非常に不安定エストル遺伝子座の反復長の変化の生物学的および健康的意義は不明である16。現代の世代突然変異4,17の問題に適用した場合に全ゲノムシーケンシング技術は、生物学的に意味のあるデータを豊富に提供することができますが、高コスト、高エラー率、必要に関連した検証変異を確認し、バイオインフォマティクスの課題は、依然として規制のテスト容量18には、このオプションの日常的な適用を制限する。 ここで、私たちは、トランスジェニック雄マウスの生殖細胞内に直接誘導された変異を定量化するための実用的な方法を説明している。このプロトコルは、第3染色体19（ 図1）の両方のコピーに組み込まれ、大腸菌lacZレポーター遺伝子を含む組換えをλgt10ファージベクターの複数の連結のコピーを有するトランスジェニックMutaMouseモデル、に記載されている。 このプロトコルは、（。BigBlueマウスおよびラット、またはlacZのプラスミドマウスなど ）も同じ原理に基づいて、他のトランスジェニックげっ歯類（TGR）のモデルに関連しているか、わずかに異なるレポーター遺伝子（GPTデルタマウスおよびラット、TGRのモデルはランバートらに検討文献 20）。この方法は、最近リリースされたに記載されたTGRの突然変異試験に基づいていますやOECDテストガイドライン21を改訂し、私たちが原因精子形成の独特の特性のため、男性の生殖細胞系列の変異の評価に対応するために必要な特別な考慮事項について記述する。簡単に述べると、このアッセイは、予め突然変異病変が安定した突然変異に固定されたサンプリング時間に続いて、変異原性物質に対するトランスジェニック雄マウスを曝露することを含む。選択されたサンプリング時間に、マウスを安楽死させ、生殖細胞は、精巣上体尾または精細管のいずれかから収集される。以下に説明するように、精子形成の異なる段階において変異原性は、露光及びサンプル収集の間の時間を選択することによって決定することができる。細胞当たりのλファージゲノムの複数のコピーを含むトランスジェニックインサートは、生殖細胞のゲノムDNAから単離し、次いでE.を感染させるために使用されている感染性λファージ粒子を作成する空のλファージカプシドにパッケージングされている大腸菌ホスト。感染した細菌は、セレク上に成長させる野生型のlacZを保有する細胞からlacZの突然変異したコピーを有するベクターを含む細胞を区別することができる電性メディア。男性の生殖細胞系列への露光の変異原性効果は、対照と処置マウスとの間の変異導入遺伝子の頻度と比較することによって決定される（ランバートらに概説図2、 図20）。生殖細胞の大多数は、必要な動物の数を削減しながら、従来の方法に対するこのアッセイの優れた感度を与え、単一のマウスからアッセイすることができる。全く特殊な装置やトレーニングを必要としないためと、このアッセイは、最も近代的な毒物学/分子生物学の研究室で生殖細胞突然変異検査のための実用的かつ効率的なオプションを提供します。 TGR生殖細胞突然変異試験の効果的な適用のための一つの本質的な要件は、精子形成サイクル（ 図3）を理解することである。マウスの生殖細胞がSTから進行するまでの時間全角精原細胞への精細管中の細胞、精母細胞、精子細胞、および最終的に精巣上体に精子を成熟（ すなわち精子形成）は、約49日である。変異は、このサイクルのさまざまな段階で発生し、多くの場合、化合物に特異的であることができます。雄の生殖細胞における変異誘発に特に関連ある二つの主要な機能は、早期減数分裂時のDNA合成の停止、及び後期ポスト減数分裂時のDNA修復能6の進行性の喪失、の誘導および固定のために必要な2つのプロセスであるほとんどの突然変異。 そのため、精子形成のこれらのユニークな特性のため、TGR生殖細胞突然変異試験の実施のための3つの重要な実験的な変数があります：（1）試験化合物投与時間が; （2）サンプリング時間;及び（3）分析のために収集する生殖細胞集団の選択（ 図3及び表1）。管理時間がexperimeです長い標的細胞が試験化合物にさらされている方法を決定NTAL変数。投与時間の長さはまた、特定の細胞型または精子の位相に対するエクスポージャーを標的化するために使用することができる。例えば、一日の投与は、特定の細胞型急性曝露の影響を決定するために使用することができる。同様に、露光のみ減数分裂割る精母細胞を標的とする、または有糸分裂2週間の投与時間と適切なサンプリング時間を使用して、精原細胞を分割することにより、例えば、全体の精子形成相に集束させることができる。慢性および亜慢性投与回数は、例えば（長期曝露の影響を評価するために試験化合物の十分な薬物動態学的分布を確実にするために、または弱い変異原の変異の十分な蓄積を可能にするOECD試験で推奨される28日間の投与時に使用され指針）。 サンプリング時間は、時を決定するための重要な変数である精子形成の段階は、標的細胞は、露光時であった。サンプリング時間は、どのくらいの時間が決まるので、どのくらいのさらなる精子形成サイクルに沿って、細胞が曝露後に通過する。例えば、幹細胞精原細胞における効果を調べるために、サンプリング時間&gt; 49日&gt;は42日、完全に成熟した精子を採取する場合に必要な、またはされ、収集されたすべてのセルがするのに十分な時間があったことを確認するために、精細管から未成熟生殖細胞を採取する場合暴露さから発生して細胞を生じる。それは、少なくとも70日のサンプリング時間が精子形成の後の段階で曝露された細胞の除去のために、毒性の薬物動態学的分布のための十分な時間を提供するために、真の幹細胞の効果を実証することが好ましい、とを考慮していることに留意することが重要である〜6週間の高い変異原性化合物22にさらされた後に発生することがあり、一時的な無菌性の期間。同様に、21日のサンプリング時間は、精子のコレを確実にする精巣上体尾からCTEDはちょうど暴露の最終日に減数分裂を完了しているだろう。 生殖細胞は、精巣上体尾から、または精細管からの各種の精子形成細胞型の混合物として成熟精子として採取することができる。成熟精子は、相対精度で精子は、任意の実験計画のために発信された精子の細胞型または位相を決定することが可能となる、〜3日間、尾部に残る。このように、尾部精子が許すの分析は非常に段階特異的突然変異の影響の調査を目標と。一方、精細管から採取した細胞懸濁液は、発達の異なる段階で、さまざまな生殖細胞型の混合物を含有し、従って、変異が発信された精子相の乏しい分解能を提供する。また、精細管から回収した細胞懸濁液は、精母細胞、続いて、過剰表現精子細胞を含有する傾向があり、版yのいくつ精原細胞および幹細胞（これらの比率は、 図3に卒業白いバーで表されます）。また、精細管から調製懸濁液はまた、さまざまな体細胞を含むことができる。非常に多くの細胞型が存在するので、したがって、突然変異の効果は、非標的細胞のさまざまな影響を与えることができる。しかし、精細管から試料を採取することは、同時に複数の生殖細胞型、および体細胞突然変異のための標準OECDテストプロトコルに生殖細胞分析の容易な統合をスクリーニングするための経済的なオプションを提供しています。 治験責任医師、投与時間、サンプリング時間及び収集細胞集団のニーズに応じて、繰り返しにさまざまな細胞型における精子形成の異なる段階での曝露の影響を調べるために調整することができる。慎重にこれらの変数を選択することにより、実験を、またはより一般規制試験の対象と機構的研究のために設計することができるる目的。 アッセイで習熟を達成するために、70日サンプリング時間陽性対照として、続いて100mg / kgのN-エチル-N-ニトロソウレア（ENU）の急性経口投与の使用をお勧めします。尾部精子の分析は、このように一般的にENUのこの非常に変異原投与後対照より突然変異体頻度（MF）における4〜5倍の増加を示し、精原幹細胞（ 図3）、標的とする。これは、この用量は、このようにより短いサンプリング時間に適した制御用量でなくてもよく、露光後6週間無菌性を誘導することが知られていることに留意すべきである。この用量は、ほとんどの体細胞組織20におけるMFの検出可能な増加を生成します。以下に代表的な結果は、最大ENUの3用量を用いて、および100mg / kgを含む急性70暴露レジメンに従って作製した。

<table><tbody><tr><td>MutaMouse</td><td>Covance</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (lacZ-/galE-</sup/sup>)</td><td>Covance-Cloloform</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Caledon</td><td>3001-2-40</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、0.5 M、pH 8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03690 FLUKA</td><td></td></tr><tr><td>イソアミルアルコール</td><td>Caledon</td><td>2/10/7900</td><td></td></tr><tr><td>Lennon LB ブロスベース</td><td>Invitrogen</td><td>12780-029</td><td></td></tr><tr><td>ステンレススチールメッシュフィルター</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3770</td><td></td></tr><tr><td>トランスパック包装抽出物</td><td>Agilent Technologies</td><td>200220</td><td></td></tr><tr><td>&β;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール、無水 (EtOH)</td><td>市販アルコール</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Gibco</td><td>11593-027</td><td>dH2O</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Gibco</td><td>11815-024</td> で <td>5 mg/mL を調製 dH2O</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Invitrogen</td><td>15509-097 で調製</td><td>メーカーの指示に従って0.1 M Tris-HClで飽和</td></tr><tr><td>Phenyl-&beta;-D-galactopyranoside (P-Gal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6501</td> ジメチルホルムアミドプロテイナーゼK Invitrogen 25530-031 <td>10 mlあたり3 gを溶解</td></tr>し、<tr><td></td><td></td><td></td><td>60 mg / ml溶液dH2Oを使用直前に調製します。l サンプルあたり</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム (NaAc)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td> 3 <td>M 溶液、pH 5.2</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td> 調製 <td>10% 溶液 dH2O</td></tr><tr><td>1 M MgSO4</td><td></td><td></td><td>24.6 g MgSO<サブ>4</サブ>&middot;100 ml dH2Oあたり7H2O、オートクレーブ、室温で1年まで保存</td></tr><tr><td>LBブロス</td><td></td><td></td><td>5.0 g LBベース、1 L dH2Oあたり6.4 g NaCl。 オートクレーブと冷たい</td></tr><tr><td>生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC)</td><td></td><td></td><td>150 mM NaCl、 15 mM クエン酸三ナトリウム、pH 7.0&nbsp;</td></tr><tr><td>SMバッファー5.8</td><td></td><td></td><td>g NaCl、2.0 g MgSO4&middot;7H2O、50 ml 1 M Tris-HCl(pH 7.5)、5.0 ml ゼラチン(2% w/v)、1 L dH2Oあたり)、オートクレーブ、室温で最大1年間の</td></tr><tr><td>TEバッファー</td><td></td><td></td>で保存 <td>10 mM Tris、1 mM EDTA、pH 8</td></tr></tbody></table>

トランスジェニック齧歯類アッセイ男性生殖細胞変異頻度を定量化するための

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo変異は主に男性の生殖細胞系で発生し、その後の世代で健康に悪影響を及ぼす可能性があります。生殖細胞の突然変異の誘導を評価する従来の方法では、多数の動物を使用する必要があり、実用的ではありませんでした。そのため、生殖細胞の変異原性が化学試験やリスク評価で評価されることはめったにありません。ここでは、最近承認された経済協力開発機構(OECD)の試験ガイドラインに基づくトランスジェニックげっ歯類モデルを用いたin vivo雄性生殖細胞変異アッセイについて述べる。この方法では、in vitroポジティブセレクションアッセイを使用して、レポーター遺伝子を直接担持するトランスジェニックλgt10ベクターで誘導されたin vivo変異を、ばく露した雄の生殖細胞で測定します。さらに、生殖細胞から回収された導入遺伝子の突然変異の検出を使用して、曝露時間(投与時間)、曝露からサンプル収集までの時間(サンプリング時間)、および分析のために収集された細胞集団の3つの実験パラメータを制御することにより、さまざまな精子形成細胞タイプの変異原曝露に対するステージ特異的感受性を特徴付ける方法について説明します。1人の雄から多数の生殖細胞をアッセイできるため、この方法は従来の方法と比較して感度が優れており、必要な動物が少なくて済み、したがって時間とリソースが大幅に削減されます。

動物20万プラークの平均プラークカウントで、私たちは一般的に8つの独立したデータに基づいて、（私たちの対照群では1.7×10 -5の標準偏差が雄の生殖細胞において、約2.8×10 -5の平均バックグラウンドMFを観察実験）。はn = 5の動物と、このプラークカウント、バックグラウンドレベルと分散、用量群ではそれぞれがパワー&gt; 0.8で、MFでの2倍の増加を検出するのに十分である。 結果は、一般的に、表2と図6は 0の単一の急性経口投与量、25、50にさらさMutaMouse男性の尾部精子（群当たりn = 5）からの代表的な結果を示す。表形式またはグラフ形式で報告され、100mg / kgのされている70日間のサンプリング時間に続いてN-エチル-N-ニトロソウレア（ENU）。この70日の期間は、露光時に精子幹細胞で精子に発生した突然変異事象（ 図3の測定を可能にする）。変異体およびタイタープレート上の典型的なプラーク密度を図7に示す。 表2および図6に示されるように、急性ENU曝露は精原幹細胞のMFでの有意な用量依存的増加を誘導した。低用量は、2.6×10 -5のベースラインMFを持っていたコントロールよりも大幅2.6倍の増加を誘導した。最大誘導は、対照より4.4倍の増加を誘発した高用量、発生しました。 このアッセイの例は、精細管の生殖細胞で行っダグラスら MFが50mg / kgのENUの5日間の反復腹腔内注射後のさまざまな時間間隔で尿細管生殖細胞において決定された文献 27に見出すことができる。その研究では、精細管細胞における変異頻度は、治療後15日目まで増加し、その後一定のままであった。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr tr=""><td> 博覧会必ず養生法</td><td> 採取した組織 </td><td> 収集された細胞型（標的細胞） </td><td> 露光の開始時に、標的セルの相 </td><td> 相は、露光中に渡さ </td></tr><tr><td>急性+ 70 </td><td>尾</td><td>成熟精子</td><td>幹細胞</td><td>幹細胞</td></tr><tr><td> 14 + 21 </td><td>尾</td><td>成熟精子</td><td>精原細胞</td><td>精子細胞</td></tr><tr><td> 14 + 35 </td><td>尾</td><td>成熟精子</td><td>幹細胞</td><td>精母細胞</td></tr><tr><td> 28 + 3 </td><td>尾</td><td>成熟精子</td><td>精母細胞</td><td>精母細胞 精子細胞 成熟精子</td></tr><tr><td></td><td>細管</td><td>幹細胞</td><td>幹細胞</td><td>幹細胞</td></tr><tr><td></td><td></td><td>精原細胞</td><td> Spはermatogonia </td><td>精原細胞</td></tr><tr><td></td><td></td><td>精母細胞</td><td></td><td>精母細胞</td></tr><tr><td></td><td></td><td>精子細胞</td><td></td><td>精子細胞</td></tr><tr><td> 28 + 49 </td><td>尾</td><td>成熟精子</td><td>ステム·セル画</td><td>幹細胞</td></tr><tr><td></td><td>細管</td><td>幹細胞 精原細胞 精母細胞 精子細胞</td><td>幹細胞</td><td>幹細胞</td></tr></tbody></table> さまざまな実験デザインによるトランスジェニック齧歯類突然変異試験の標的とされている、表1の細胞型および精子形成の段階。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 用量群 </td><td> 動物＃ </td><td> ミュータントPFU </td><td> 合計PFU </td><td> MF（X10 -5） </td><td> 平均MF（×10 -5） </td><td> 倍の変化 </td><td> p値 </td></tr><tr><td>コントロール</td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 180245 </td><td> 2.8 </td><td> 2.6 </td><td> 1.0 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 137835 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3 </td><td> 11 </td><td> 385672 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> 431396 </td><td> 0.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 152413 </td><td> 3.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 25ミリグラム/ kgの</td><td> 6 </td><td> 17 </td><td> 162353 </td><td> 10.5 </td><td> 6.9 </td><td> 2.6 </td><td> 0.0002 </td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td> 14 </td><td> 150094 </td><td> 9.3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 154401 </td><td> 2.6 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 9 </td><td> 9 </td><td> 154401 </td><td> 5.8 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 </td><td> 12 </td><td> 196978 </td><td> 6.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50mg / kgの</td><td> 11 </td><td> 17 </td><td> 155727 </td><td> 10.9 </td><td> 9.3 </td><td> 3.6 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td></td><td> 12 </td><td> 11 </td><td> 135847 </td><td> 8.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 13 </td><td> 25 </td><td> 193499 </td><td> 12.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 14 </td><td> 12 </td><td> 133859 &lt;/ TD&gt; <td> 9.0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 15 </td><td> 14 </td><td> 252807 </td><td> 5.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100mg / kgの</td><td> 16 </td><td> 26 </td><td> 170968 </td><td> 15.2 </td><td> 11.5 </td><td> 4.4 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td></td><td> 17 </td><td> 28 </td><td> 234584 </td><td> 11.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 18 </td><td> 10 </td><td> 145289 </td><td> 6.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 19 </td><td> 35 </td><td> 292236 </td><td> 12.0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20 </td><td> 22 </td><td> 190848 </td><td> 11.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表2トランスジェニックオスmの尾部精子中のlacZ変異体頻度彼らは精子幹細胞（= 1日投与時間、サンプリング時間= 70日）だったとき氷がENUに急性暴露した。 PFUは、プラーク形成単位、MF =突然変異体頻度を=。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig1highres.jpg" /> 図1をλgt10ファージ構築物の略図。 <img alt="図2" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig2highres.jpg" /> 図2トランスジェニック齧歯類生殖細胞突然変異試験の概要。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" /> 図3マウスにおける精子形成および細胞型およびPHAの模式図さまざまな実験デザインによるトランスジェニック齧歯類突然変異試験の標的とされているES注：卒業白いバーは、精細管から調製した細胞懸濁液中に存在する細胞の種類（ すなわち精子&gt;精母&gt;精原細胞&gt;幹細胞）の相対的比率を表して<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" target="_blank">ください。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig4highres.jpg" /> マウスの精巣上体尾の4集図。 A））D。静かに精巣および精巣上体を引き出すために脂肪パッドを引っ張る）C。B）副睾丸脂肪パッドを特定します。陰嚢に向かって腹部の切開を作る精巣上体尾を見つけ、切除。 精細管からの生殖細胞の懸濁液の5。準備図。 A）切開は精細管を露出させ、精巣上皮カプセルで作られています。B）精細管がカプセルから絞り出されている。C）組織ローラーを穏やかに5〜10℃の角度で細管に通し、 。D内に含まれる生殖細胞）、生殖細胞懸濁液は、さらなる処理のために収集さを放出する。 <img alt="図6" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig6highres.jpg" /> 図6 MutaMouse精子中のlacZ変異体頻度のグラフ表示ENUに幹細胞として急性暴露さ（n = 5）であった。各三角形は、一匹のMFを表す。* p &lt;0.05のポアソン回帰によって決定される。 <img alt="図7" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig7highres.jpg" /> Eの芝生の上に形成されたプラークを有するトランスジェニック齧歯類突然変異試験から寒天プレート図7代表大腸菌宿主細菌。 A）「変異体」プレートは、特に時折、いくつかのプレートにゼロ斑を持つことになります対照用量群において、矢印でマークされた非常に少数のプラーク（）があります。B）」タイター」プレートは、プラークの数百を持つことができます。

De novo変異は、その後の世代での健康に悪影響を及ぼす可能性があります。ここでは、環境因子によって誘導された雄性生殖細胞の突然変異を定量化するためのトランスジェニックげっ歯類モデルの使用に関するプロトコルについて説明します。

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

この手順の全体的な目的は、化学的または物理的な変異原に曝露した後、雄のトランスジェニックマウスの生殖細胞から回収されたレポーター遺伝子における誘導変異の頻度を測定することである。これは、まず雄マウスを推定される生殖細胞変異原に曝露させることで行われる。次のステップは、精子形成の所望の段階を経て進行した後の生殖細胞を回収することである。次に、変異報告トランスジーンを含むDNAを生殖細胞から回収します。最終ステップでは、回収したレポーター遺伝子をラムダファージ粒子にパッケージングします。最終的に、in vitro陽性選択アッセイを用いて、生殖細胞から回収されたレポーター遺伝子のうち、変異したものの割合を測定します。本手法の、特異的遺伝子座試験やドミノ・リトル試験などの既存の手法に対する主な利点は、変異した子孫を評価するのではなく、生殖細胞における変異を直接測定できる点にあります。1匹の雄から多数の生殖細胞を調査できるため、従来の手法よりもアッセイの感度が向上すると同時に、動物資源の数と時間を大幅に削減することが可能です。本手法は、生殖細胞に対して変異原性を有する物質の特定や、その作用機序の解明など、遺伝毒性学および変異原性研究の分野における重要な課題を解決することができます。本稿ではMutaマウスモデルを用いた手法について解説しますが、これは細菌ファージ変異報告ベクターを保持する他のトランスジェニック齧歯類システムにも容易に適用可能です。さらに、本手法では雄性生殖細胞に関するプロセスについて説明していますが、体細胞組織にも一般的に適用でき、重要な点として、OECDが発行した国際的に整合された試験ガイドラインに準拠しています。一般的に、この手法に不慣れな方は、いくつかのステップで長い待機時間があるため、アッセイのin vitro部分のタイミングに苦労することがあります。この手法を適時に完了させるには、各ステップを慎重に計画し、調整する必要があります。手順のデモンストレーションは、実験開始前に私の研究室の生物学者であるJohn GingrichとLinda Soperが行います。投与時間、サンプリング時間、および回収する生殖細胞集団という3つの重要な実験変数を設定する必要があります。これらの変数を調整することで、さまざまな生殖細胞種および精子形成の異なる段階における曝露の影響を調査することが可能です。本手順を開始するには、生後8～12週のトランスジェニック雄マウスを、1群あたり最低5匹となるように、対照群と処理群にランダムに割り付けます。その後、選択した投与期間にわたり、適切な曝露経路を介して被験化合物および適切な対照物質をマウスに投与します。次に、目的とする精子メタゲニック細胞型に応じて、適切なサンプリング時間を選択します。サンプリング時間が経過した後、イソフルラン麻酔下で頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。精巣を取り出すため、腹部を切開し、上皮脂肪パッドを確認します。脂肪組織を慎重に牽引し、陰嚢から精巣と精巣上体を露出させます。その後、精巣上体を摘出します。摘出した精巣上体を液体窒素で凍結し、後で使用するために-80°Cで保存します。Cotaの精子を処理する準備ができたら、Cotaの精巣上体を氷上で解凍し、解凍したものをペトリ皿に移します。次に、メスまたはカミソリを使用して、精巣上体を十分に細かく刻みます。室温のDPBS 700 µLをペトリ皿にピペッティングします。その後、広口の1000 µLピペットチップを用いて、懸濁液を約10回、またはDPBSが精子で白濁するまで吸引と放出を繰り返し、Cotaから精子を放出させます。精子懸濁液をステンレス製メッシュフィルターでろ過して新しい1.5 mLチューブに移し、11,000 ×gで3分間遠心分離します。ペレットを乱さないように注意しながら、チューブから上清を慎重にデカントします。次に、冷やした1xサリンクエン酸ナトリウムを1 mL加え、ペレットが完全に再懸濁するまでチューブをボルテックスします。続いて、10% SDSを15 µLチューブに加え、非精子細胞を破壊するためにチューブを30秒間激しく振盪します。その後、チューブを11,000 ×gで2分間遠心分離します。遠心分離後、上清をチューブから注意深くデカントして除去し、0.2 x 冷塩化ナトリウムクエン酸ナトリウムを940 µL加え、ペレットが再懸濁するまで再度チューブをボルテックスします。そこに、A beta メルカプトエタノール 120 µL、10% SDS 100 µL、0.5 M EDTA (pH 8) 20 µL、および 60 mg/mL の溶液 20 µLを添加します。再懸濁した精子にProteinase Kを添加します。溶液を十分に混合し、チューブをローテーターに設置して37°Cで一晩放置し、消化させます。一晩の消化後、テキストプロトコルに記載されているフェノールクロロホルム抽出の手順に従って、精子尾部からDNAを抽出します。DNA沈殿物を40〜100 µLのTris EDTAバッファー（pH 8）に溶解し、4 °Cで保存します。次のステップに進む日の数日前までに、DNAを完全に溶解させておいてください。LAX Z変異アッセイを実施する前に、処理するサンプル数に応じた十分な量のボトムオーガーを準備し、オートクレーブ滅菌します。次に、無菌的にアガーを90 mmのペトリ皿に分注し、50 mLチューブ内でアガーを凝固させます。10 mLのLBブロス、100 µLの20%マルトース溶液、25 µLの20 mg/mLアンピシリン、および20 µLの5 mg/mLカナマイシンを加えます。その後、$\Delta$lacZ- $\Delta$galE E. coliをチューブに接種し、37 °Cで240 RPMで振盪しながら一晩培養します。アッセイの1日目に、一抗生物質を含まない新鮮なLBを用いて、一晩培養した菌液を1:100に希釈し、細胞を継代培養します。培養液を37 °Cで240 RPMで振盪しながら、約3時間、またはOD 600が1になるまでインキュベートします。OD 600が1に達したら、細胞懸濁液を50 mLチューブに等量ずつ分注し、15 °Cで1,300 ×gで10分間遠心分離します。その後、上清を除去し、10 mM硫酸マグネシウムを含む元の体積の半分量のLBで細胞を再懸濁します。他の試薬を準備している間、細胞はそのままにしておきます。まず、ワイドボアピペットを使用して、coda精子から抽出したDNA 4 µLを1.5 mLチューブに分注し、DNAをラムダファージ粒子にパッケージングします。ファージパッケージング抽出キットの1本目のチューブを室温で解凍し、4.8 µLのパッケージング抽出液をDNAの入ったチューブにピペッティングします。次に、ピペットチップで溶液を静かに混ぜ、チューブを30 °Cのウォーターバスで1.5時間インキュベートします。続いて、2本目のパッケージング抽出液チューブを解凍し、同様に4.8 µLをDNAの入ったチューブにピペッティングします。ピペットチップで溶液を穏やかに撹拌し、チューブを30 °Cの恒温水槽で1.5時間インキュベートします。パッケージ化されたファージ粒子を500 µLの塩化マグネシウム緩衝液で再懸濁し、チューブをローテーターにセットして20 RPMで30分間回転させます。回転後、サンプルを短時間ボルテックスし、11,000 ×gで30秒間遠心分離して、サンプルをチューブの底部に回収します。ファージ粒子が感染準備に整いました。次に、各タイタープレートおよび変異体プレート用に8 mLのトップアガーを調製します。硫酸マグネシウム濃度を10 mMにする前まで、トップアガーを50 °Cに維持し、変異体選抜用には選択剤のPGALを3 g/L添加します。細胞への感染前に、最上部のオージャーのみを使用してください。サンプルごとに50 milliliterチューブを2本用意し、それぞれに「mutant」と「titer」とラベルを貼ります。次に、サンプルごとにオージャープレートを8枚用意し、4枚に「mutant」、4枚に「titer」とラベルを貼ります。次に、再懸濁した細胞を2 mLずつ、各50 mLチューブに分注します。「mutant」とラベルを貼った50 mLチューブに、パッケージ化されたファージ粒子を500 µL加えます。チューブを静かに混ぜ、室温で30分間、ファージ粒子に細胞を感染させます。30分間のインキュベーション後、感染細胞を短時間ボルテックスし、感染細胞15 µLを対応する50 mLタイターチューブに移します。その50 mLタイターチューブに、50 °Cに加温したタイター・トップ・オーガー30 mLを加えます。直ちに、オーガーと細胞の混合液を4枚のタイタープレートに分注します。50°Cの変異株選択培地に、1Lあたり3gのP galが添加されていることを確認します。次に、PGALを含む変異株選択培地30 mLを、変異株が入った50 mLチューブに加えます。その後、培地と細胞の混合液を直ちに4枚の変異株用プレートに分注します。プレートを凝固させた後、プレートを反転させ、37 °Cで一晩インキュベートします。一晩のインキュベーション後、変異株プレートおよびタイタープレート上のプラーク数をカウントします。次に、4枚の変異株プレートでカウントした変異株プラークの総数を、タイタープレートから算出された感染細胞の全量に含まれるプラーク形成単位（PFU）の推定総数で除し、変異頻度を推定します。一般的なトランスジェニックげっ歯類生殖細胞変異原性試験では、変異検出用プレート、特に対照投与群において検出されるプラーク数は非常に少なくなります。その一方で、タイタープレート上では数百個のプラークが検出されます。muttマウスの雄にENUを0, 25, 50, 100 mg/kgの単回経口投与し、70日間のサンプリング期間を設けることで、精原幹細胞における変異イベントの測定が可能となりました。低用量のENUは、対照群に対して変異頻度を2.6倍増加させ、最大用量では4.4倍の増加を誘導しました。本手順を用いた実験を計画する際は、常にタイミングを考慮することが重要です。目的の精子メタジェニック細胞種に由来する影響を観察するためには、精子のメタジェニックサイクル、投与時間、サンプリング時間、および回収する細胞種を慎重に選択する必要があります。本手順に続き、変異プラークに対してDNAシーケンシングを行うことで、変異の特性解析を行い、クローン増殖イベントに由来する可能性のある変異体を特定することができます。この手法は、遺伝毒性学分野の研究者が、生殖細胞を標的とする可能性のある変異原を特定するための道を切り拓くものです。このビデオを視聴することで、変異原に曝露させた生殖細胞またはトランスジェニック雄マウスにおける誘導変異頻度の決定方法について、十分に理解できるはずです。本アッセイは、生殖細胞変異原の規制試験や、より標的を絞ったメカニズム解析への応用が期待されます。

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Research

JoVE Journal

Biology

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