Name: からのペプチドおよびタンパク質との組換えエラスチン様ポリペプチドおよびその融合の非クロマトグラフィー精製エシェリヒア·コリ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学ぼう、逆相転移サイクリングを用いたエラスチン様ポリペプチドの非クロマトグラフィー精製法。Escherichia coli由来の組換えELPを塩・熱誘導で精製し、創薬や組織工学への応用を可能にする効率的なバイオポリマー精製技術です。

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1。ELP式<ol><li> DMSOストックまたはEの寒天平板コロニーを滅菌したテリフィックブロス培地の3ミリリットルを接種T7-lacプロモーターの制御下で、所望のELPをコードするプラスミドを含有するタンパク質の発現に適した大腸菌 。適切な抗生物質を追加し、継続的に200rpmで振盪しながら37℃で一晩（O / N）でインキュベートする。 </li><li> 4リットルのフラスコ内のテリフィックブロスの滅菌培地を1リットルに、O / N培養の1ミリリットルを追加します。適切な抗生物質を追加し、200 rpmで連続振とうしながら24時間、37℃でインキュベートする。 NOTE：培養24時間インキュベートされた場合T7-lacプロモーターで見られる「漏出性」のベースライン発現は、多くのELPの高レベル発現に十分である。しかしながら、より従来のアプローチは、培養物の光学密度が0.6に達したときにタンパク質発現は、さらに0.2〜1 mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG）の添加によって誘導され、使用することができる。 </li&gt; <li> 2,000 X gで15分間、4℃で1Lの遠心分離ボトルや遠心分離機に4リットルのフラスコから文化を転送します。 </li><li>上清を捨てる。 NOTE：培養物の1以上Lを成長させる場合、それらはペレットに培養物の他のリットルを添加し、工程1.3を繰り返すことにより凝縮させることができる。培養2 Lまでの単一細胞ペレットに凝縮することができる。 </li><li> 50mlコニカルチューブに細胞懸濁液と45mlの転写に到達するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、水、又は他の所望の緩衝液中にペレットを再懸濁。 </li></ol> 2 ELP精製：。準備作業と逆転移サイクリングの最初のラウンド<ol><li>氷上でサンプルを維持しながら、10 &#39;上&#39;秒、85 Wの出力電力で20秒間「オフ」のサイクルで9分間、合計再懸濁した細胞ペレットを超音波処理する。簡単に説明すると、サンプルが氷の上で冷却してからもう一度9分サイクルを繰り返すことができます。注：ELPは、非常に低いT tを有することが予測される場合</サブ&gt;「オフ」の間隔がT tを上記溶液の加熱を回避するために40秒まで増加させることができる。 </li><li> 50ミリリットルの丸底遠心管に溶解液を移す。 </li><li>文化の各リットルのための10パーセントの2ミリリットル（w / v）のポリエチレンイミン（PEI）を追加し、混合する振る。注：PEIは負に荷電した遺伝的汚染物質の凝縮を助ける正に帯電したポリマーである。 PEIはまた、ELP製品を凝縮し、削除することができように、ELPが負に帯電している場合は、この手順を実行しないでください。 </li><li> 16,000 X gで10分間4℃で遠心します。 </li><li>クリーン50ミリリットル丸底遠心管に上清を移し、ペレットを捨てる。 </li><li>オプションのステップを「ベークアウト」：タンパク質汚染物質を変性させ、ELPが完全に可溶化されるまで4℃に、または氷に転送するために10分間60℃でサンプルをインキュベートする。遠心分離機16,000 X gで10分間4℃でのサンプル。 CLに上清を移し、50ミリリットルの丸底遠心管をEAN、ペレットを捨てる。注：ペプチドまたはタンパク質は、ELPと融合させて、上昇した熱の状態で変性することが期待されている場合は、この手順を実行しないでください。これは、ELP転移が熱不可逆的になるために、または融合された部分の活性を破壊することが原因となることがあります。 </li><li>結晶性のNaCl（3Mを超えない）を加えることで、ELPの移行を誘導する。あるいは、クエン酸ナトリウム（0.3 Mを超えない）は、より高いT tをsまたは低い収率を有するELPは使用することができる。注： 塩が溶解した後、溶液は、溶液からのELPの相分離を示す、濁るべきである。高いT tをs の非常に親水性のELP ELPは、転移のこの予備誘導にELPの相分離を誘導するために、塩の添加と組み合わせて、ある程度の加熱を必要とし得る。 </li><li> 16,000 XG（ホットスピン）で10分間、室温temperatue（RT）で遠心分離する。注：ELPペレットをbすべきEそのサイズは、ELPの発現収量に依存し、観察した。このELPペレットは、最初に不透明に見えるかもしれませんが、冷却後には、半透明表示され、色が茶色である。浄化が進み、汚染物質が除去されるように、ELPペレットはより無色になります。 </li><li>上清を捨て、ペレットに必要なバッファー1-5 mLを加え。ピペッティングによりペレットを再懸濁、または4℃で回転するようにチューブを設定する NOTE：緩衝液の体積は、必要ELPペレットのサイズ、および緩衝液の十分な量のELPペレットの可溶化を可能にするために添加されるべきであるELP発現の歩留まりに依存するであろう。混入タンパク質とジスルフィド相互作用を排除するpH7の10mMトリス（2 - カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP-HCl）を含む水中での精製からの高いシステイン含量の利益を有するのELP。その電荷を中和し、エレメントを低減するために調整されたpHで精製から高い電荷コンテンツ利益を有するのELP汚染タンパク質との相互作用ctrostatic。 </li><li>新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに1mlアリコートに再懸濁したELPソリューションを転送します。 </li><li> 16,000 XG（コールドスピン）で10分間4℃で遠心します。不溶性汚染物質の小さなペレットが観察されるべきである。 </li><li>きれいなチューブに上清を移し、ペレットを捨てる。 </li></ol> 3 ELP精製：逆転移サイクリングのその後のラウンド<ol><li>熱および/またはNaClを添加したELP転移を誘導する。サンプルは、T tを超える温度で15分間ヒートブロックまたはウォーターバス中でインキュベートすることができる。場合は、しかしながら、ELPは（熱の使用を排除する）タンパク質に融合されるか、またはELPは熱のみで到達できない高いT tを有する場合には、NaClを5 M溶液を誘導するために滴下して添加することができるELP遷移。注：溶液は、溶液から、ELPの相分離を示す、曇りを有効にしてください。 </li><li&gt; 16,000 XG（ホットスピン）で10分間遠心します。熱は、ステップ3.1で使用した場合、ELP転移を誘発するために必要であった温度よりも高い温度でこの遠心分離工程を行う。一人でのNaCl、ステップ3.1で使用された場合は、室温で、この遠心分離工程を行う。注：ELPペレットを観察する必要があります。 </li><li>上清を捨て、必要なバッファーの500から750μLを加え、ピペッティングによりペレットを再懸濁または4℃で回転させるためにチューブをセット</li><li> 16,000 XG（コールドスピン）で10分間4℃で遠心します。不溶性汚染物質の小さなペレットが観察されるべきである。 </li><li>きれいなチューブに上清を移し、ペレットを捨てる。 </li><li>全く汚染物質ペレットをステップ3.4の間に観察されなくなるまで繰り返して3.5に3.1を繰り返します。 </li></ol> 4。後の精製処理（オプション） <ol><li>必要に応じて、精製されたELP溶液から過剰の塩を除去するための適当な緩衝液に対してサンプルを透析。注：凍結乾燥されるべきのELPがあるべき4℃でのddH 2オブジェクト指向/ Nに対して透析</li><li>所望であれば、前のO / Nを凍結乾燥すると30分間-80℃で溶液を凍結することによって、長期保存用のELPを凍結乾燥注：凍結乾燥が付加タンパク質とのELPには使用しないでください。 </li><li>必要に応じて、ELPタグを削除することにより、ペプチドまたはタンパク質のELP融合から遊離ペプチドまたはタンパク質を回収。 <ol><li>ビオチン化プロテアーゼ（タンパク質分解酵素供給者によって推奨されているように）、または遺伝的にペプチドまたはタンパク質とELPの間で設計されたプロテアーゼ部位に対応するプロテアーゼのELP融合を有​​するペプチドまたはタンパク質のELP融合を消化。 </li><li>該当する場合は、（プロテアーゼ供給業者により推奨されているように）、ストレプトアビジンで修飾されたビーズを用いてビオチン化プロテアーゼを削除します。 </li><li> 5 M NaCl溶液を滴下により開裂ELPおよび/またはプロテアーゼELP融合体の移行を誘導する。 </li><li> 16,000 X gで10分間、室温で遠心分離します。注：ELPペレットを観察する必要があります。 </li><li>上清を回収し、ELPペレットを捨てる。所望のバッファーに対して上清を透析または純粋なペプチドまたはタンパク質溶液から高塩濃度を除去するために緩衝液交換を行うために遠心フィルターを使用。 </li><li>ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によりELPタグから遊離ペプチドまたはタンパク質の完全な切断を確認する。 </li></ol></li></ol> 5キャラ：SDS-PAGE <ol><li> 2 - メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液10μlに水で希釈し、ELPの10μLを混合することにより、SDS-PAGE用のELPのサンプルを準備します。 NOTE：ELP40μgのELPは、しばしば、産物のサイズおよび純度を評価するのに十分である。 </li><li> 2分間100℃でサンプルをインキュベートした後、適切なサイズのタンパク質ラダーとともにポリアクリルアミドゲルにロードします。 </li><li>色素がゲル（約45分）の底に近づくまで180 Vでゲルを実行します。 </li><li>染色ロッキングしながら、5分間、0.5MのCuCl 2溶液を用いたゲル。注： いくつかのELP配列は、この色素と相互作用しないようにのELPは、一般的に、クマ​​シーブリリアントブルー染色により可視化されていません。クマシーブリリアントブルーは、アルギニン残基と主に相互作用し、他の塩基性残基ヒスチジンおよびリジンおよび芳香族残基、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン26と弱く相互作用します。従ってELPはペプチドまたはタンパク質ELP融合体は、それらの一次配列は、これらの特定の残基の十分な数が含まれている場合のみ、クーマシーブリリアントブルーで染色することができる。 </li><li> ELPバンドのMwは、ELP遺伝子からと無関係な汚染物質のバンドが存在しないことを期待理論MWのものに対応することを確認します。注：一部のELPは、その予想されるMWの9、27よりも最大20％高い見かけの分子量で移動する。 </li></ol> 6キャラ：マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF-MS） <ol><li>約25μmのELP濃度を達成するために0.1％トリフルオロ酢酸を含む50％アセトニトリル水溶液でELP溶液を調製する。注：このソリューションは、塩があってはならないので、ELPが精製後、H 2 Oに対して透析しなければなりません。 </li><li> 0.1％トリフルオロ酢酸を含む50％アセトニトリル水溶液に飽和シナピン酸マトリックス溶液を調製する。 </li><li>約2.5ピコモル/μLのELP濃度を達成するためにマトリックス溶液9μlにELP溶液1μlを追加します。注：この混合物は、さらに、MALDI-TOF信号を最適化するために、マトリックス溶液で希釈することができる。 </li><li>金属MALDIプレート上に堆積物ELP-マトリックス混合物の1〜2μlのスポットが完全に乾燥させます。 </li><li> ELPの比（m / z）を充電し、その測定されたMWを推定するために質量を決定するためにMALDI-TOFで5-10スペクトルを得る。 </li></ol> 7。CharacterizatioN：温度プログラム比濁法および動的光散乱<ol><li>温度プログラム濁によるELPのT tを決定します。 <ol><li>使用するバッファーでELPソリューション（5〜100μmでから、 例えば ）希釈系列を用意します。 </li><li>温度制御されたUV-可視分光光度計を用いて、1℃/分の加熱速度で温度（ 例えば 、20〜80℃）の範囲にわたって350nmでの光学密度（OD）を測定する。 NOTE：ODの増加が見られない場合にはT tは 、器具の温度上限を超えることがある。見かけのT tは、NaClの添加によって減少させることができる。 1MのNaClから始まり、ELP遷移が測定可能な温度範囲内で検出されるまで、0.5 Mのステップで増加。 </li><li> 1°C /分の冷却速度で温度と同じ範囲にわたってODの減少を測定することにより、ELP転移の可逆性を確認する。 </li><li>ホモのT tを決定する濁度プロファイル（ODは、温度に対してプロット）の変曲点を識別することによって、ポリマーELP。注：この温度は容易に誘 ​​導体の最大値に対応する温度をT tと定義されるOD曲線の導関数から定義することができる。より複雑なELP·アーキテクチャは、より複雑な濁度プロファイルが表示され、セクション7.2で説明したように、さらに分析する必要があります。 </li></ol></li><li>より複雑な熱的性質（球状ミセルに自己集合、例えば 、ELPジブロックコポリマー）を表示するのELPのさらなる特徴付けは、動的光散乱（DLS）によって達成される。 <ol><li>使用するバッファーでELP液を調製し、20から450 nmの細孔径を有するフィルターを通してサンプルを渡します。 NOTE：フィルターの孔径の選択は、溶液中の任意のELPアセンブリの有無、大きさ、および安定性に依存するであろう。最小の実現可能なフィルタ孔径は、次のような汚染物質を排除することが好ましいDLS測定の質を低下させるほこり、。小さいフィルタ細孔サイズを通してELPソリューションを渡すときに大きな抵抗を経験しているとき、より大きなフィルター孔サイズを使用する必要があります。 </li><li>濁度プロファイルで識別された関心領域に対応する温度範囲にわたって流体力学的半径（R H）を測定する。注：ELPのユニマーは通常、R H &lt;10 nmのナノ粒子集合体がR、H〜20〜100 nmであり、凝集体はR、Hがある&gt; 500ナノメートルを持っています。 R Hの各増加は粒子の大きさに比例する温度の関数としてのUV-可視分光光度計により測定された350nmでのODの増加に対応すべきである。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することなく、競合する金融利害関係はありません。

ELPは、それらの刺激応答性相挙動の利用による精製の安価ーフリーの手段を提供します。このアプローチは、Eの遺伝的にコード化されたのELPの発現後の両方で、可溶性と不溶性の汚染物質を除去するためのELPとペプチドまたはタンパク質のELP融合体のLCST挙動を利用しています大腸菌 。精製のこの容易さは、様々な用途のELPを生成するために使用することができる、またはELPポスト精製処理で除去され得る精製タグとして作用することができる組換えペプチド又はタンパク質の精製のために利用することができる。 ELPの精製は、 大腸菌を溶解する予備的な手順が含まれます大腸菌およびITCによる残留可溶性および不溶性汚染物（ 図2）を除去し、粗培養溶解物（ 図1）からのゲノムおよび不溶性細胞片を除去する。 ADDIでELP遷移をトリガした後、遠心分離熱や塩のTiONのホットスピンと呼ばれる工程では、上澄み液中の可溶性の汚染物質からELPを分離します。 ELPを再可溶化した後、溶液を不溶性汚染物ペレットを除去するためにT tを下回る温度で再度遠心分離され、ステップ冷スピンと呼ばれる。ホットとコールドスピンを交互にすることは得小さなコストで、各サイクルでのELPソリューションの純度を向上させます。精製収率は、ELP T tの長さ、および縮合ペプチドまたはタンパク質に依存して変化する。典型的に、このプロトコルは、E.リットル当たり精製ELP 100mgをもたらす大腸菌の文化は、しかし収量は500ミリグラム/ Lまで達することができるELP生成物の最終純度は、SDS-PAGE（ 図3）によって確認される。精製されたELPのMwはELP遺伝子によりコードされた理論MWと密接に一致している必要があります。しかし、いくつかのELPは、その予想されるMWの9、27よりも最大20％高い見かけの分子量をSDS-PAGEに移行します。 ELPのより正確な分析MWはまた、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などの分析手法直交するとともにELP生成物の純度に関する追加情報を提供することができるMALDI-TOF-MSによって達成することができる。 精製後、ELP T tは、温度プログラム比濁法により測定される。温度を上昇させながら、この技術は、ELP液のODを監視します。それは、ELPの意図されたアプリケーションに関連する一連の濃度を特徴付けることをお勧めしますので、T tは濃度依存性である。 ELPは、濁度プロファイルはユニマーために、ミクロンスケールの凝集体からELP遷移に対応する単一の急激な増加（ 図4A）を示すためのホモポリマー。 T tは正確に温度に対するODの一次導関数の最大値として決定さ濁度プロファイルにおける変曲点に対応する温度として定義される。の可逆性ELPの相転移は、温度がT tを（ 図4B）の下方に下降するようにベースラインにODの減少によって確認される。温度ランプを増減した濁度プロファイルは、ELPのコアセルベートとのELP溶化の可変ヒステリシスの沈降に大きさと反応速度が異なります。ペプチドまたはタンパク質のELP融合体は、同様に、ELPに融合されたペプチドまたはタンパク質は、T Tに影響を与え、このようにLCST挙動を示す。タンパク質についてELPは、遷移が、タンパク質の融解温度未満の融合体に可逆的である。温度プログラムは、比濁法ELP製品の初期熱特性のための優れた方法であるが、このような示差走査熱量測定（DSC）などの代替技法も、ELP T tを測定するために使用することができる。 より複雑なアーキテクチャを有するELPはまた、温度PROGRAによって特徴付けることができる、より複雑な熱的挙動を示すMMED比濁法。 ELPジブロックコポリマーは、例えば、それらの臨界ミセル温度で球状ミセル中にそれらの温度トリガ型自己集合に対応する特徴濁度プロファイルを示す。このようなELPジブロックコポリマーの場合は外径は、典型的には第1より高い温度でのODの急激な増加は（最大で2.0単位のベースラインの上）ミクロンスケールの形成を示す、その後、ミセルへのユニマーからの移行を示すベースラインの上0.1〜0.5単位が増加骨材（ 図5A）。温度トリガー自己集合ELP構造に関する追加の情報は、DLS、溶液中のELPアセンブリのR Hを測定する手法で得られる。 R、Hの変化は、比濁法（ 図5B）を用いて測定し、ODの変化と密接に同意するものとします。ナノ粒子集合体は、R、H〜は20〜100nmを示し、凝集体はR、Hを発揮しながら、ELPのユニマーは通常、R H &lt;10ナノメートルを示す17、23、29により得ることができる。 ELPによる熱特性の調整可能性のために、T tをs の範囲は、様々なELPの設計によって得られる。それは、本来のT tが極端に低い、または高いT T S は 、この標準的なプロトコルほとんど修正を必要とする各ELPのための精製プロトコルの最適化に影響を与えるであろうことを心に留めておくことが重要です。非常に高い転移温度を有するELPは、この方法による精製のために不適切である。新規のELPとペプチドまたはタンパク質ELP融合体の設計は、ELPの熱応答性を損なう可能性がある場合、単純なヒスチジンタグは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによる代替的な精製のために含めることができる。さらに、ゲスト残基が荷電されている場合ELP配列の特性は、このプロトコルの変更を必要とし得る。緩衝液の操作は、汚染物質17との静電相互作用を排除する努力においてELPの全体の電荷を変化させる方法として使用することができる。適切な処置を精製プロセスが融合部分の活性を混乱させないように注意したときさらに、このプロトコルは、ペプチドおよびタンパク質を有するELP融合体の特殊な状況に適している。そのような修飾に関するプロトコルを通じてノートがT tを、電荷、または融合懸念に対して、これらの課題を提示し得るのELPの精製を導くように働く。 そのLCST挙動によるのELPの精製はのELPとEに発現されたペプチドまたはタンパク質のELP融合体の大部分を精製するために、シンプルでクロマトグラフィーのないアプローチを提示大腸菌 。ここに要約プロトコルは、浄化Oを許可ほとんどの生物学の研究室に共通している機器を使用して1日でFのELP。のELPとその融合体の精製の容易さは、我々は願って、材料科学、バイオテクノロジー、医療に新たなアプリケーションのためのELPのデザインの増え続ける多様性を奨励する。

エラスチン様ポリペプチド（ELPは）は、X、ゲスト残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸である反復ペンタペプチドVPGXGから構成される生体高分子である。 ELPは展示下限臨界溶液温度（LCST）の相転移挙動、均質ELP溶液は、一般ELP文献1における逆転移温度（T t）が呼び出され、そのLCSTに加熱すると2相に分離するような。 2相は非常に希薄ELP球相とELP豊富な土砂相から構成されている。 ELPの豊富な堆積物は、その後、合体、ミクロンサイズの粒子に、ELP鎖の凝集の際に、短い時間スケール上に形成されている。この動作は、数℃の範囲にわたり発生し、均一な溶液がT tを以下の温度に戻ったときに回復されるように、通常は可逆的である。 ELPは、典型的には、往復大腸菌（E.coli）で合成される発現プラスミドに連結する人工遺伝子をメートル。次いで、このプラスミドをE.に変換されるタンパク質発現のために最適な大腸菌細胞株。我々は、 大腸菌内のELPの多種多様の発現のためのT7-LAC pETベクターシステムを独占的に使用している大腸菌 、酵母2-4、5真菌、および植物6-8の他の発現系はまた、他の研究者によって利用されているが。多くのアプローチは、遺伝的に再帰的な方向性のライゲーション（RDL）9、プラスミドの再構築（PRE-RDL）10で再帰的に、方向性ライゲーションを含め、反復的なELP遺伝子を構築するために存在し、拡張ローリングサークル増幅（OERCA）を11に重なっている。遺伝子レベルでのELPを設計する能力は、さらなる機能を付加することができる様々なアーキテクチャ（ 例えば 、モノブロック、ジブロック、トリブロックなど）とのELPを作成するために、組換えDNA技術を使用する機会を与えるペプチドおよびタンパク質。遺伝子レベルでの制御は、各ELPが完全に単分散のバイオポリマー製品を提供し、正確な長さおよびその遺伝プラスミド鋳型によって指示組成物を用いて発現されることを保証する。 各ELPの熱特性は、その分子量（MW）とシーケンスだけでなく、その溶液中の濃度と、そのような塩などの他の共溶質の存在を含む外因性の要因として、生体高分子に固有のパラメータに依存する。 ELP 12およびそのゲスト残基の組成物の長さは1、13、14、疎水性ゲスト残基およびより長い鎖長がより低いT tをs をもたらすT tを制御するために使用することができるELPの設計における2つの直交するパラメータ、一方、親水性であるゲスト残基およびより短い鎖長は、より高いT tをs をもたらす。 ELP濃度は反比例グラムの溶液T tを、に関連しているイーターELP濃度は低いT T S 12を持っている。塩の種類と濃度はまた、塩の効果は、ホフマイスター系列15に続く ELP T tを 、影響を与える。コスモトロピックアニオン（CL -とホフマイスター系列でより高い）ELPのT tを低下させ、塩濃度を増加させると、この効果を高めます。これらの内因性および外因性パラメータは、ELPの特定の用途に必要とされる目標温度範囲内で熱的挙動を得るために調整することができる。 のELPの刺激応答挙動はバイオセンシング16、17、組織工学18、および薬物送達19、20などのアプリケーションの多様な範囲のために有用である。 ELPは、遺伝子レベルでのペプチドまたはタンパク質に融合されるとさらに、ELPは、組換え元気の精製のための安価なバッチ方法を提供する単純な精製タグとして機能することができる何ー21を必要としない潮またはタンパク質。精製プロセスの改変は、ELPに融合ペプチドまたはタンパク質の活性が維持されることを保証する。ペプチドまたはタンパク質ELP融合体は、ELPタグは22,23または代替的に、遊離ペプチドまたはタンパク質が必要とされる場合、プロテアーゼ認識部位は、ペプチドまたはタンパク質とELPとの間に挿入することができる有用である用途のために精製することができる。 ELPタグの除去は、遊離プロテアーゼまたは後者は標的ペプチド又はからELPタグとプロテアーゼELP融合体を分離することができるELP精製の最終ラウンドの処理のさらなる容易さを提供するプロテアーゼELP融合体による消化によって達成することができる単一のステップ24、25中のタンパク質。次のプロトコルは、その熱的特性によってのELPとペプチドまたはタンパク質のELP融合のための精製法について説明し、特徴づけるための基本的なテクニックについて説明しますELP製品の熱応答。

<table><tbody><tr><td>pET-24a(+) pET-25b(+)</td><td>Novagen</td><td>69749-3 69753-3</td><td>T7-lac カナマイシン(pET-24)またはアンピシリン(pET-25)に対する耐性を持つ発現ベクター。</td></tr><tr><td>Ultra BL21 (DE3) コンピテントセル</td><td>Edge BioSystems</td><td>45363</td><td>組換えタンパク質発現のためのコンピテントE. coli。</td></tr><tr><td>Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media</td><td>MO BIO Laboratories</td><td>12105</td><td>培地は、DI H2Oに再溶解され、使用前にオートクレーブ処理されます。</td></tr><tr><td>イソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C</td><td>IPTGをDI H2Oに再構成し、滅菌ろ過し、培養物に添加して発現増強を誘導します。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)錠剤</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td>これらのPBS錠剤は、DI H2Oの1 Lに溶解すると、140 mM NaClを含む10 mMリン酸緩衝液と、25°CでpH 7.4の3 mM KClが得られます。</td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン(PEI)溶液(~50%w/v)</td><td>MP Biomedicals</td><td>195444</td><td>PEIは、脱イオンH2O中の10%(w/v)溶液として調製されます。</td></tr><tr><td>Nalgene Oak Ridge 高速遠心分離チューブ、50 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>3138-0050</td><td>これらの丸底チューブは、30-50 ml の高速遠心分離に耐えます。</td></tr><tr><td>トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩 (TCEP-HCl)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20491</td><td>TCEP-HCl のストック溶液を 100 mM の DI H2O で調製し、pH 7.0 に調整します。システイン含有量が高いELPの場合、この還元剤のストック溶液をELPペレットに添加して、H2Oで10 mMに到達します。</td></tr><tr><td>レディゲルTris-HClゲル、4-20%リニアグラジエントポリアクリルアミドゲル、10ウェル、30 &mu;l</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>161-1105</td><td>これらの線形グラジエントゲルは、さまざまなMWでELPを良好に視覚化します。</td></tr><tr><td>塩化第二銅二水和物(CuCl2&#183;2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C454-500</td><td>ろ過された0.5 M溶液は、Tris-HClポリアクリルアミドゲルのネガティブ染色用に調製されます。</td></tr><tr><td>Anotop 10シリンジフィルター: 0.02 &mu;m 0.1 &mu;m 0.2 &mu;m</td><td>Whatman</td><td>6809-1002 6809-1012 6809-1022</td><td>これらの直径10mmのシリンジフィルターは、DLS測定のための少量の調製を可能にします。</td></tr><tr><td>Millex-HVフィルター: 0.45 &mu;m</td><td>EMDミリポア</td><td>SLHVX13NK</td><td>直径13mmのシリンジフィルターは、DLS測定用の大きなナノ粒子集合体を持つ少量の溶液を調製することができます。</td></tr></tbody></table>

からのペプチドおよびタンパク質との組換えエラスチン様ポリペプチドおよびその融合の非クロマトグラフィー精製<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

エラスチン様ポリペプチドは、特徴的な転移温度以下のような可溶性ユニマー既存およびそれらの転移温度以上のミクロンスケールのコアセルベート中に凝集、下限臨界溶液温度相転移挙動を示し、反復的なバイオポリマーである。遺伝子レベルでのエラスチン様ポリペプチドの設計は、それらの熱的性質を規定するそれらの配列と長さの正確な制御を可能にする。エラスチン様ポリペプチドは、ELPの転移温度とバイオポリマーアーキテクチャーは、関心のある特定の用途のために調整することができるバイオセンシング、組織工学、薬物送達、を含む種々の用途に使用される。さらに、エラスチン様ポリペプチドの下限臨界溶液温度相転移挙動は、コアセルベーションおよびそれらの選択的可溶化は、可溶性および不溶性の両方の汚染物質の除去を可能にするような、それらの熱応答によってそれらの精製を可能にする大腸菌で発現後のS。このアプローチは、単独で、エラスチン様ポリペプチドの精製のために、または遺伝的にエラスチン様ポリペプチドタグに付加組換えペプチドまたはタンパク質は、クロマトグラフィーなしに精製することができるペプチドまたはタンパク質融合物の精製のためのツールと​​して使用することができる。このプロトコルは、エラスチン様ポリペプチドおよびそれらのペプチドやタンパク質融合物の精製を記載し、純粋なエラスチン様ポリペプチド産物の熱挙動を評価するための基本的な特性評価技術について説明します。

ここでは、ELPホモポリマー及びELPジブロック共重合体の精製および特性評価のための代表的な結果について説明します。 Eの式の24時間に続いて大腸菌、細胞を遠心分離によって回収し、超音波処理により溶解される。一般的に、色の微妙な変化は、十分な細胞溶解（ 図1A）を確認、超音波処理後に発生します。 PEIの添加後、ゲノム成分および細胞破片を、上清中の可溶性ELP（ 図1B）からの不溶性汚染物の大規模なペレットを分離し、遠心分離によって収集される。 ELPは、さらに、可溶性および不溶性の両方の汚染物質（ 図2）28からのELPを分離するためにLCST挙動を利用し、逆転移サイクリング（ITC）により精製する。 ELPの相転移は、熱および/または塩の添加によってトリガされる。 ELP Aで構成され、チューブの底にペレットを形成する際の遠心分離の結果NDいくつかの不溶性汚染物質（ 図1C）。 ELPペレットを保持し、冷緩衝液に再懸濁されている間、この上清中にホットスピン破棄可溶性の汚染物質をステップは、と呼ばれる。再溶解ELPを4℃で再び遠心分離するこの可溶性ELPを含む上清を保持したまま冷たい不溶性夾雑物のペレットをスピン·破棄の手順は、と呼ばれる。残留ELPが遠心管の各ITCのラウンド中やピペットチップで失われているように、ホット＆コールドスピンを交互にサイクルを繰り返すことは、ELPの純度を増加させるが、やや収量が減少するコストで。 のELPとペプチドまたはタンパク質ELP融合体の精製は成功したSDS-PAGEにより確認される。精製プロセス全体を通じて行わ小分けは、 大腸菌からのELPの漸進的な精製を実証大腸菌溶解液。 ELPて粗Eに過剰発現している大腸菌溶解物および汚染物質は、ウィットを下げるITCのH連続ラウンド（ 図3）。精製されたELPは、予測された理論MWに近い単一バンドとして表示されます。 ELP T tは、温度プログラム濁度によって特徴付けられる。 ELPホモポリマーの濁度プロファイルは、（約2.0単位、25μMのELP濃度のベースライン上の）350でのODの単一の急激な増加（ 図4A）を示す。 ODは、温度がT tを（ 図4B）よりも低下したときにベースラインに戻り、冷却濁りスキャンはELP遷移の可逆性を確認する。 ELPジブロックコポリマーは、ホモポリマーのELPと比較して、より複雑な濁度プロファイルを示す。 ODは、通常、最初のベースラインの上に0.1〜0.5台に増加し、その後、ベースラインより2.0台と急激に外径が大きくなる（ 図5A）。 DLS測定は、温度に対するR Hの変化、共に関する情報を提供<html>濁度プロファイル（ 図5B）から得られた情報をrroborating。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig1highres.jpg" width="600" /> 図1。予備のELP精製。式の24時間後に、E.大腸菌細胞を遠心分離により回収し、PBS中に再懸濁する。A）細胞を、溶解物が超音波処理した後に暗くなるように微妙な色の変化を伴う超音波処理によって溶解される。B）PEIの添加後、DNA汚染物質を凝縮するために、溶解物は遠心分離し、不溶性デブリの大ペレットを上清中に可溶性ELPから分離されているC）ELP転移は、熱および/ ​​またはその塩および遠心分離の形態の添加透光ELPペレットを用いて誘導される。ANK &quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" width="600" /> 図2逆転移サイクリング。ELPは、可溶性および不溶性の両方の汚染物質からのLCST挙動により精製する。 ELP-リッチ溶解物（1）ELP転移は、熱および/またはその塩を添加して誘導され、ELPを遠心分離（ホットスピン）（2）により分離されるで始まる。溶解性汚染物質を含有する上清を廃棄しながらELPペレット（図3a）に保持される（図3b）。 ELP（4）冷緩衝液に再懸濁し、4°C（コールドスピン）〜（5）で再度遠心分離する。可溶性ELPを含有する上清を（図6b）に保持されている間に、不溶性汚染物質を含有するペレット（図6a）が廃棄される。により求められる所望の純度が達成されるまでホットとコールドスピンを交互のサイクルが繰り返されるSDS-PAGE。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" width="600" /> 図3 ELP精製産物のSDS-PAGE分析を示す。ELPの精製は成功したSDS-PAGEにより確認される。過剰発現されたELPが原油Eに明らかである超音波処理後の大腸菌溶解物（2）。いくつかのELP不溶性汚染物のペレットを捨てで失われるが、PEIの添加及び遠心分離後に可溶性ELPは、主に、上清（3）に保持される（4）。最初のホットスピン後の上清は、可溶性の汚染物質の有意なレベルが含まれている（5）。最初の冷たいスピン後の上清は、不溶性の汚染物質からのELPの良好な分離を示している（6）。ホット（7）、Cの追加のサイクル古いは、最終的なホット（9）および冷スピン（10）上清を無関係の汚染バンドを示さなくなるまで（8）ELP生成物の良好な純度を確認し、それぞれ、残留可溶性および不溶性汚染物を除去回転させる。 SKGPG - （VGVPG）の配列と、このELPホモ、80-Yは、33.37 kDaで予想される分子量を有している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" width="600" /> 図4。温度プログラム濁によるELPの単独重合体のキャラクタリゼーション 1℃/分であって、a）ELPホモポリマーの割合で温度を上昇させながら。ELPのT tは 350nmでODを監視することによって決定された単一の急激な増加を示すODそのDEFイネス所与の濃度BでのそれらのT tは ）ELP転移の可逆性は、可逆性がベースラインに戻りODによって確認される温度を低下させながら25μM溶液の350nmでのODをモニタリングすることによって確認される。このELPホモポリマーは、シーケンスSKGPG-（VGVPG）80-Yを持っています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" width="600" /> 図5昇温比濁法と動的光散乱によるELPジブロックコポリマーのキャラクタリゼーション。ELPはナノスケール自己集合を起こし、このような球状ミセル、展示より複雑な濁度プロファイルに自己集合ELPジブロックコポリマーである。 <stronODのG&gt; A）の緩やかな増加を前にミクロンスケールの凝集体にELPの完全な凝集を示し、外径が急激に増加し、ミセルのユニマーからの移行を示している。B）DLS測定は、濁度プロファイルから推測動作を確認温度に対するR、Hの変化についての情報を提供することにより、25μmとソリューションを提供します。ここでのELPユニマーは、R、H〜8ナノメートルがあり、ミセルは、R、H〜25ナノメートルを持っています。このELPジブロック共重合体は、配列を有するGCGWPG - （VGVPG）60 - （AGVPGGGVPG）30-PGGS。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

エラスチン様ポリペプチドは、組換えタンパク質の精製からの薬物送達に至るまでのアプリケーションとの刺激応答性のバイオポリマーである。このプロトコルは、クロマトグラフィーへの単純な代替手段としての下限臨界溶液温度の相転移挙動を使用して大腸菌のエラスチン様ポリペプチドおよびそれらのペプチドやタンパク質融合物の精製および特性について説明します。

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

本手順の全体的な目的は、逆転移サイクリングを用いて、大腸菌から組換えエラスチン様ポリペプチドを精製することです。まず、組換えエラスチン様ポリペプチドを発現させた大腸菌細胞から溶解物を回収し、遠心分離によって不溶性の細胞残渣を除去します。次に、塩の添加または加熱によってエラスチン様ポリペプチドの転移を誘導し、可溶性の不純物を除去します。次に、遠心分離によってエラスチン様ポリペプチドのコーティングを回収し、上澄み液を廃棄します。この工程はホットスピンと呼ばれます。続いて、再懸濁させたエラスチン様ポリペプチド溶液を遠心分離し、不溶性の不純物を除去します。上清に含まれる可溶性エラスチン様ポリペプチドを回収し、ペレットは廃棄します。この工程はコールドスピンと呼ばれ、エラスチン様ポリペプチドが十分な純度に達するまで、ホットスピンとコールドスピンのサイクルを繰り返します。最終的に、逆転移サイクリングによって高純度のエラスチン様ポリペプチドが得られ、これをさまざまな生物医学的応用に利用するための特性評価を行うことができます。この手法で精製されたエラスチン様ポリペプチドは、バイオセンシング、組織工学、ドラッグデリバリーなど、多くの有用なアプリケーションに活用でき、それぞれの用途に合わせてエラスチン様ポリペプチドの転移温度やバイオポリマー構造を特異的に調整することが可能です。まず、付属のテキストプロトコルに記載された条件を用いて、目的のELPコードプラスミドをe coliで発現させます。1 Lの培養液をインキュベーター内で37 °Cで24時間振盪培養した後、培養液を1 L遠心ボトルに移し、4 °Cで2000 Gsで15分間遠心分離します。次に、上清を除去し、ペレットをPBSまたは任意のバッファーで再懸濁し、全量を45 millilitersにします。その後、細胞懸濁液を50 milliliterのコニカルチューブに移します。細胞懸濁液を氷上に置き、冷却後、10秒間の処理と20秒間の休止のサイクルで、計9分間超音波処理を行います。出力は85 wattsに設定してください。1回目の超音波処理の後、サンプルを氷上で約10分間冷却し、その後、再び9分間の超音波処理サイクルを繰り返します。溶解物を50 mLのラウンドボトム遠心チューブに移します。次に、培養液1 Lあたり2 mLの10% (w/v) ポリエチレングリコールを加え、チューブを振って混合します。その後、チューブを4°Cで16,000 ×gにて10分間遠心分離します。続いて、上清を清潔な50 mLのラウンドボトム遠心チューブに移し、ペレットを廃棄します。結晶性の塩化ナトリウムをサンプルに添加し、ELP転移を誘導します。塩が溶解すると溶液が濁りますが、これは溶液からELPが相分離したことを示しています。その後、サンプルを16,000 GSで10分間遠心分離し、ELPをペレット化します。室温では、ELPペレットは最初不透明に見える場合があります。上清を捨て、冷却後、目的のバッファーを1〜5 mL添加します。ELPペレットは半透明で茶色に見えることがあります。4 °Cでピペッティングまたはチューブを回転させて、ペレットを再懸濁します。次に、再懸濁したELP溶液を1 mLずつ清潔な1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。チューブを4 °Cで16,000 ×g、10分間遠心分離します。その後、上清を清潔なチューブに移し、ペレットを廃棄します。塩化ナトリウムを添加してELPの相転移を誘導します。塩のみでは誘導できない高い転移温度を持つELPの場合、サンプルをヒートブロックを用い、ELP転移温度以上の温度で15分間インキュベートしてください。その後、ELP転移ステップで使用した温度以上の温度で、サンプルを16,000 GSで10分間遠心分離します。上清を捨て、ピペッティングまたはチューブを4°Cで回転させ、ペレットが再溶解するまで、目的のバッファー 500 to 750 µLでELPペレットを再懸濁します。次に、不溶性不純物を沈殿させるため、サンプルを 16,000 ×g、4°Cで10分間遠心分離します。その後、上清を清潔なチューブに移し、ペレットを捨てます。不純物のペレットが見られなくなるまで、逆転相転移サイクルを繰り返します。通常、これには2〜5サイクルの操作が必要です。PBSまたはその他の任意のバッファーを用いて、ELP溶液の希釈系列を調製します。次に、温度制御機能付きUV-vis分光光度計を用い、サンプルを1 °C/minの速度で加熱しながら、さまざまな温度範囲における350 nmでの吸光度を測定します。吸光度の増加が見られない場合は、転移温度が上限温度を超えている可能性があります。次に、1分間に1°Cの冷却速度で、同じ温度範囲における吸光度の減少を測定します。ELP転移プロット（温度に対する吸光度）の可逆性を確認し、ホモポリマーELPの転移温度を決定します。この濁度プロファイルの変曲点を特定することで、LPの精製が成功したことが確認され、その結果をここに示すSDS pageで確認できます。1回の逆転移サイクリング後のサンプルと比較して、初期のE. coli溶解物に含まれる不純物の数は大幅に多くなっています。ELPホモポリマーのELP転移温度は、温度プログラム濁度測定によって特性評価されます。濁度プロファイルは、光学密度の単一かつ急激な上昇を示し、これにより特定の濃度における転移温度が定義されます。ELP転移の可逆性は、冷却濁度スキャンによって確認されます。ELPダイブロック共重合体は、ホモポリマーLPよりも複雑な濁度プロファイルを示します。その後、動的光散乱測定を行うことで、濁度プロファイルファイルから推測されたこれらのLPの挙動を確認できます。このビデオを視聴することで、逆転移サイクリングを用いて大腸菌から組換えエラスチン様ポリペプチドを精製する方法について十分な理解が得られたはずです。いいえ、いいえ、いいえ、いいえ、いいえ。

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有機溶媒を用いた抽出・沈殿法を用いた大 腸菌 からのエラスチン様ポリペプチド(ELP)の効率的な精製

学ぼう、逆相転移サイクリングを用いたエラスチン様ポリペプチドの非クロマトグラフィー精製法。Escherichia coli由来の組換えELPを塩・熱誘導で精製し、創薬や組織工学への応用を可能にする効率的なバイオポリマー精製技術です。

からのペプチドおよびタンパク質との組換えエラスチン様ポリペプチドおよびその融合の非クロマトグラフィー精製

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