からのペプチドおよびタンパク質との組換えエラスチン様ポリペプチドおよびその融合の非クロマトグラフィー精製エシェリヒア·コリ
2014年6月9日
エラスチン様ポリペプチドは、組換えタンパク質の精製からの薬物送達に至るまでのアプリケーションとの刺激応答性のバイオポリマーである。このプロトコルは、クロマトグラフィーへの単純な代替手段としての下限臨界溶液温度の相転移挙動を使用して大腸菌のエラスチン様ポリペプチドおよびそれらのペプチドやタンパク質融合物の精製および特性について説明します。
この手順の全体的な目標は、逆遷移サイクルによって大腸菌から組換えエラスチン様ポリペプチドを精製することです。これは、まず、組換えエラスチン様ポリペプチドを発現した大腸菌細胞からライセートを収集し、遠心分離によって不溶性の細胞破片を除去することによって達成されます。第2のステップは、塩または熱を添加してエラスチン様ポリペプチド転移を誘導することにより、可溶性汚染物質を除去することです。
次に、エラスチン様ポリペプチドコートを遠心分離により収集し、上清を廃棄します。このステップはホットスピンと呼ばれます。次に、再懸濁したエラスチン様ポリペプチド溶液を遠心分離機にかけ、不溶性汚染物質を除去する。
上清中の可溶性エラスチン様ポリペプチドは保持され、ペレットは廃棄されます。このステップはコールドスピンと呼ばれ、エラスチン様ポリペプチドの十分な純度が達成されるまでホットスピンとコールドスピンのサイクルを繰り返します。最終的に、逆遷移サイクリングは、さまざまな生物医学的アプリケーションで使用するために特性評価できる純粋なエラスチン様ポリペプチド製品を生成します。
この技術によって精製されたエラスチン様ポリペプチドは、バイオセンシング、組織工学、薬物送達など、多くの有用な用途があり、エラスチン様ポリペプチドの転移温度と生体高分子構造を各用途に特異的に調整することができます。まず、添付のテキストプロトコルに記載されている条件を使用して、目的のELPコードプラスミドを大腸菌で発現します。1リットルの培養物をインキュベーターで37°Cで24時間振とうした後、培養液を1Lの遠心分離器ボトルに移し、次いで2000Gで4°Cで15分間遠心分離する。
次に、上澄みを捨てて再排泄します。ペレットをPBS水または他の所望の緩衝液に総容量45ミリリットルまで懸濁します。次いで、細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐管に移した。
細胞懸濁液を氷の上に置き、冷却したら、10秒オンと20秒オフのサイクルで合計9分間超音波処理します。出力電力は85ワットです。最初の超音波処理の後、サンプルを氷上で約10分間冷却し、その後、9分間の超音波処理サイクルを繰り返します。
ライセートを50ミリリットルの丸底遠心チューブに移します。次に、培養物の各リットルに体積ポリエチレンあたり10%重量の2ミリリットルを追加し、次に混合するためにチューブを振って、チューブを16, 000GSで摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、上清をきれいな50ミリリットルの丸底遠心分離管に移し、ペレットを廃棄します。
結晶性塩化ナトリウムをサンプルに添加して、ELP遷移を誘導します。塩が溶けると、溶液は濁り、これはELPが溶液から相分離していることを示しています。次に、サンプルを16, 000 GSで10分間遠心分離してELPをペレット
化します。室温では、ELPペレットは最初は不透明に見え、上清を捨て、冷却後に1〜5ミリリットルの所望の緩衝液を添加することがあります。ELPペレットは、半透明で茶色に見える場合があります。Resusは、チューブを摂氏4度でピペッティングまたは回転させることにより、ペレットを懸濁します。
次に、再懸濁したELP溶液の1ミリリットルアリコートをきれいな1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにピペットで移します。チューブを16, 000GSで摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、上清をきれいなチューブに移し、ペレットを捨てます。
塩化ナトリウムの添加によりELP転移を誘導します。ELPの転移温度が高く、塩だけでは誘導できない場合は、ELP転移温度を超える温度でサンプルをヒートブロック上で15分間インキュベートします。次に、ELP遷移ステップに使用した温度を超える温度で、サンプルを16, 000GSで10分間遠心分離します。
上清を捨て、ペレットが再可溶化されるまでチューブを摂氏4度でピペッティングまたは回転させることにより、ELPペレットを500〜750マイクロリットルの所望の緩衝液に再懸濁します。次に、サンプルを16, 000GSで摂氏4度で10分間遠心分離し、不溶性汚染物質をペレット化します。次に、スナットをきれいなチューブに移し、ペレットを廃棄します汚染物質のペレットが観察されなくなるまで逆遷移サイクルを繰り返します。
これには通常、2〜5サイクルが必要です。希釈系列のELP溶液をPBSまたは他の所望のバッファーで調製します。次に、温度制御されたUVV分光光度計を使用して、サンプルを1分あたり摂氏1度の速度で加熱しながら、温度範囲にわたって350ナノメートルの光学密度を測定します。
光学密度の増加が見られない場合、転移温度は温度の上限を超える可能性があります。次に、1分あたり摂氏1度の冷却速度で、同じ温度範囲での光学密度の減少を測定します。ELPトランジションプロットの可逆性、光学密度対温度を検証するには、ホモポリマーELPの転移温度を決定します。
この濁度プロファイルの変曲点を特定することにより、LPの精製が成功したことは、ここで見ることができるようにSDSページで確認されます。汚染物質の数は、逆遷移サイクルの1ラウンド後のサンプルと比較して、最初の大腸菌ライセートの方がはるかに多くなっています。ELP転移温度は、ELPホモポリマーの温度プログラムされた濁度によって特徴付けられます。
濁度プロファイルは、光学密度の単一の急激な増加を示し、これが特定の濃度での転移温度を定義します。ELPダイブロック共重合体は、ホモポリマーLPよりも複雑な濁度プロファイルを示します。
その後、動的光散乱測定を行って、濁度プロファイルファイルから推測されるこれらのLPの動作を確認できます。このビデオを見れば、逆遷移サイクルを使用して大腸菌から組換えエラスチン様ポリペプチドを精製する方法を十分に理解できるはずです。いえいえいえいえいえ。
概要
このプロトコルでは、逆転移サイクル法を用いてEscherichia coliからエラスチン様ポリペプチド（ELPs）を精製し、特性評価する方法について詳しく説明します。ELPsは、ドラッグデリバリーや組織工学など、多様な用途を持つバイオポリマーです。
研究の主要構成要素
科学分野
- バイオポリマー
- タンパク質精製
- 生物医学的応用
背景
- エラスチン様ポリペプチドは、刺激応答性バイオポリマーである。
- これらは、さまざまな生物医学的用途に利用できる。
- 効果的に利用するためには、精製技術が不可欠である。
- 逆転移サイクリングは、精製のための新しい手法である。
研究目的
- E. coliから組換えELPを精製する。
- 生物医学的応用のために、精製したELPの特性評価を行う。
- 逆転移サイクリングの効率を実証する。
使用した手法
- E. coli溶解液の回収および不溶性デブリの除去。
- 塩または加熱によるELPの相転移の誘導。
- 精製のための加熱・冷却遠心分離の繰り返し。
- 吸光度測定によるELPの特性評価。
主な結果
- 逆転移サイクリングによるELPの精製成功。
- ELPの転移温度の特性評価。
- ELP転移の可逆性の実証。
- バイオセンシングおよびドラッグデリバリーにおける応用の可能性を認めた。
結論
- 逆転相転移サイクルは、ELPを精製するための効果的な手法である。
- 精製されたELPは、特定の生物医学的用途に合わせて調整することが可能である。
- 本プロトコルにより、溶液中におけるELPの挙動への理解が深まる。
よくある質問
産業的関連性の概要
逆転移サイクルを用いることで、組換えエラスチン様ポリペプチド（ELP）およびその融合タンパク質をクロマトグラフィーなしで精製でき、ダウンストリームプロセスの複雑さとコストを削減することが可能です。この手法は、不純物を除去するための固有の熱応答性を活用することで、ELPベースの治療薬やバイオマテリアルの迅速な製造を支援します。また、アッセイ開発やスクリーニングに適した、精製済みで機能的に関連性のあるバイオポリマーを提供することにより、初期探索段階におけるターゲットの信頼性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
早期発見とターゲットバリデーション
- 科学的価値：ペプチドまたはタンパク質の活性を機能的に検証するための純粋な材料を提供し、ELP融合構築物の解析を可能にする。
- 実用的価値：クロマトグラフィーを用いることなく、E. coliライセートから可溶性および不溶性の不純物を除去し、タンパク質製造の初期段階におけるタイムラインを短縮する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 定義された転移温度を持つELP産物を生成し、相転移を検出可能な信号として利用する信頼性の高いバイオセンサ設計を可能にします。
- 運用の価値： 一貫したバイオポリマーの挙動を必要とするハイスループットスクリーニングプラットフォームの標準化に適した、再現性と拡張性のあるELPバッチを生成します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 調整可能な構造と放出キネティクスを持つ精製キャリアを提供することで、ELP薬物輸送システムの前臨床評価を支援します。
- 運用上の価値： in vivoでの有効性およびバイオディストリビューション研究に適したELP融合体を得ることで、創薬から前臨床研究への円滑な移行を促進します。
パイプラインおよびワークフローの統合
逆転移サイクリングは、E. coliでの組換え発現からリード同定に至るディスカバリの連続的なプロセスに適合し、クロマトグラフィーによるボトルネックを回避して、下流評価用の精製済みELP融合タンパク質を提供します。
- 発見生物学：結合および活性アッセイ用の不純物を含まない材料を提供することで、ELP-ペプチドまたはELP-タンパク質融合体の仮説検証を可能にします。
- スクリーニング：精製効率とバッチの一貫性をモニタリングするための定量的な濁度ベースの読み出しを備えた、アッセイに使用可能なELP製品を提供します。
- 分析：ELPベース製品の重要な品質特性である転移温度を定義する、温度プログラム化された光学的密度測定を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：ドラッグデリバリーや組織工学スキャフォールドの製剤に適した精製ELPを通じて、前臨床アプリケーションへと繋げます。
- エンタープライズでの再利用：多様なELP配列や融合パートナーに適用可能な、再利用可能でプラットフォーム互換性のある精製法を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： クロマトグラフィーによる変動を排除し、天然に近いバイオポリマーの挙動を維持することで、ELP融合機能の予測信頼性を向上させる。
- 運用の価値： 標準的なラボ用遠心分離機で対応可能な、塩または熱による相転移を利用することで、再現性とスケーラビリティを向上させる。
- 戦略的価値： クロマトグラフィー樹脂およびそれに伴うバリデーションの負担を排除することで、精製に関連する損失と資本支出を削減する。
- ポートフォリオへの影響： Go/No-go決定に不可欠な、一貫した高純度材料を確保することで、ELPベースの候補物質のリスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の留意点
- 組換えタンパク質の発現および相転移生物物理学に関する専門知識が必要です。
- 16,000 × g の遠心分離機および加熱・冷却スピン用の温度制御モジュールの利用が可能です。
- ELPの転移挙動の再現性を確保するため、チーム間で塩濃度および温度プロファイルの標準化を行う必要があります。
- 塩の溶解度限界を超える加熱誘導を必要とする、転移温度の高いELPへの適応検討が含まれます。
- 複数サイクルの処理時間や、繰り返しの遠心分離工程における潜在的な収率低下などの実用上の制限が伴います。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:05
Title
1:37
Expression of Elastin-like Polypeptides (ELPs)
2:22
Purification of ELPs by Inverse Transition Cycling
4:17
Removal of Contaminants from ELP through Subsequent Rounds of ITC
5:22
Characterization of ELP Tt by Temperature-programmed Turbidimetry
7:13
Conclusion
6:16
Results: Characterization of ELPs Purified from E. coli through ITC
