高収率の精製熱帯熱マラリア原虫メロゾイト

この手順の全体的な目標は、ヒト抗体によるオプソニン化の定量化のために、純粋な熱帯熱マラリア原虫を高収率で生成することです。これは、まずE 64でSショーン破断を抑制し、膜封入マイト構造を生成することによって達成されます。第2ステップでは、遊離マイトを回収し、最終ステップで定量するためにAUMブロマイドで染色し、マイトをさまざまなヒト血漿サンプルおよびTHP 1ヒト単球細胞とインキュベートします。

最終的に、異なるヒト血漿サンプルによるマイトのオプソニン化は、フローサイトメトリーによって区別することができます。この手法が既存のマラリア免疫に対する機能免疫アッセイよりも優れている点は、無傷のメスが使用され、食作用反応が堅牢で定量化可能であることです。この方法は、ワクチンや自然に曝露した個人のマラリアに対する免疫のための酸化抗体と食作用の重要性など、マラリア免疫学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

E 64のタイミングはメゾの形成を確実にするために不可欠であるため、この手法の視覚化は非常に重要です。また、メゾの調製と計数には技術的に厳しいため、後期熱帯熱マラリアの磁気分離後、栄養型は、寄生虫の薄い塗抹標本を100%メタノールに10秒間固定し、ギザで3分間染色することにより、寄生虫の成熟を評価します。顕微鏡で染色スライドを検査して、寄生虫が赤血球をほぼ満たし、初期の禅段階にあるように見えることを確認します。

寄生虫が適切な成熟段階に達していない場合は、適切に発達するまでインキュベートを続けます。適切に成熟したら、単離したシェーンを10マイクロモルのE 64で処理し、さらに6〜10時間インキュベートします。E 64とのインキュベーションに続いて、処理した寄生虫の塗抹標本を調製します。

スライドを100%メタノールで固定し、Gizaで染色して、寄生虫の少なくとも50%が膜を形成していることを確認します。密閉されたマイテスペレットは、室温で1900Gsで8分間、残りのE 64処理シェーンをペレット化しました。次に、寄生虫を50ミリリットルの室温で洗います。

培地を洗浄して、残っているヒト血清を取り除きます。上清を廃棄した後、寄生虫ペレットを2ミリリットルの洗浄培地に再懸濁し、次に細胞懸濁液を1.2マイクロメートルのシリンジフィルターでろ過し、マイトとヘモン結晶を10ミリリットルのチューブに集めます。次に、磁石に小さな磁気カラムを取り付け、500マイクロリットルのTHP 1媒体で平衡化します。

濾液を磁気カラムに3回通し、毎回フロースルー中のマイトを収集します。次に、カラムを2ミリリットルの室温ですすいでください。残りのメイトを収集するために1つのメディアをTHPします。

ヘミンの除去は、マイトを浄化するための重要なステップです。マイトがヘミンから分離されていない場合、マイテヘミンクラスターが形成され、フローサイトメトリーによるマイテカウントが不正確になります。THPは1つの細胞が貪食ヘミンをcon phagoseので、meiteヘミンクラスターもcetoにすることができます。

したがって、ヘミンが除去されない場合、試験対象の血漿のオプソニン化能も過大評価されます。集めたマイトを、光から保護された室温で、臭化物1ミリリットルあたり10マイクログラムで染色します。30分後、マイトをスピンダウンし、上清を適切な廃棄物容器に捨て、マイテペレットを4ミリリットルのTHP 1メディアペレットマイツで洗浄します。

その後、光から保護された1つの培地であるTPの15ミリリットルで細胞を懸濁します。フローサイトメトリーによるマイトの定量化。100分の1、50分の1、25分の1の希釈でマイトを数えます。

まず、940、930、910マイクロリットルのPBSとBSAを3つの異なるファックスチューブに分注し、各チューブにそれぞれ10、20、および40マイクロリットルの精製マイトを追加します。次に、室温でビーズを30秒間カウントし、希釈したマイトを含む各ファックスチューブに50マイクロリットルのビーズを追加します。希釈した3つのマイトサンプルを488ナノメートルレーザーを搭載したフローサイトメーターで分析し、臭化アテリウムとGFPデュアル蛍光ゲートに基づいてマイトの厳格なゲートを設定し、ビーズを別のチャネルでゲートし、2000ビーズが収集されるまでイベントを取得します。

各希釈でのマイト数を定量化するには、3つのマイト濃度測定値を平均します。その後、1ミリリットルあたり6マイトのTHP 1培地に8×10でマイトを懸濁し、THP 1セルあたり4マイトの最終的な比率を確保して、マイトの食作用を測定する。まず、アッセイに十分なTHP1細胞をペレット化し、THP 1培地に1ミリリットルあたり5番目の細胞の6.7倍でそれらを懸濁します。

次に、150マイクロリットルのTHPで、FCSが96ウェルU底板に試験する各条件に対して、ウェルあたり1細胞を三重に3重にし、最終的にウェルあたり10〜5細胞の濃度にする。メイトを追加する時が来るまで、プレートをインキュベーターに置きます。次に、単離されたマイトの150マイクロリットルを、ウェル濃度あたり6ミリリットルの8倍で、テストする条件ごとに1ウェルで別のFCSブロック96ウェルU底板に加えます。

調製した希釈血漿サンプルをマイツの各ウェルに加え、十分に混合して均質な溶液を確保します。次に、50マイクロリットルのマイトプラズマ溶液をTHPの各ウェルに加え、テストする各プラズマサンプルに対して1つのプレートを3倍にします。サンプルをよく混合し、次に、5%二酸化炭素中の摂氏37度の加湿インキュベーターで覆われた共培養器をインキュベー

40分後、事前に冷却した遠心分離機でサンプルをスピンダウンし、食作用を停止します。次に、2回目の洗浄後、氷冷ファックスバッファーで細胞を2回洗浄します。細胞を90マイクロリットルのファックス固定剤に固定し、氷の上に置きます。

取得するまで光から保護されています。E 64処理前の寄生虫の成熟段階は、膜封入されたマイトを生成するために重要です。寄生虫は大きく、赤血球をほぼ満たし、まだらの宝石の染色を示す必要があります。

この段階でE 64を添加すると、6〜10時間のインキュベーション後に膜封入されたマイトが得られます。栄養型にE64を早期に添加すると、寄生虫の膜は生成されません。E 64を後からショーンに加えると、破裂は抑制されません。

高レベルの寄生虫の同期性が必要です。そうでなければ、E 64治療後に説明されている3つの結果すべての範囲が見られます 臭化オウム蛍光による食作用測定により、GFP蛍光単独よりも寄生虫食作用の優れた分解能が可能になります。TP One細胞に対するマイトの比率を増やすと、THP One細胞に対するマイトの接着が増加します。

マイト特異的抗体がない場合、MEITE対THP1細胞比を増加させると、パプアニューギニアの血漿サンプルを使用して4対1のMAITE対THP1細胞比で、マイトの0〜78%の食作用の増加も観察されています。これらのデータは、パプアニューギニアを代表する4人の個人からのPHA酸性応答の4四分位数の例を示しています。このアッセイを用いて測定されたオプソナイジング抗体は、この手順を試みている間、マラリアに対する臨床的免疫と関連していることが示されています。

PE細胞症を成功させるために覚えておくべき重要なポイントは、高度に同期した寄生虫を持たせて完全に成熟した無傷のマイトを得ること、およびHB1細胞培養を適切に維持することです。この手順で概説されているマイト精製の技術は、マリゾーン、侵入、アッセイ、プロテオミクス、血清学など、高品質のマラリア治療を必要とするあらゆるアプリケーションに適応できます。このビデオを見た後、E 64法を使用してマイトを精製する方法と、THP 1細胞による食作用を測定することによりオプソニン化抗体を調査する方法についてよく理解できるはずです。