Name: 高収率の精製熱帯熱マラリア原虫メロゾイト (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学ぶ高収率のPlasmodium falciparumメロゾイト精製法。E64処理とフローサイトメトリーによるオプソニン化依存性貪食測定で、マラリア免疫応答を定量的に解析する革新的アプローチを習得できます。

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著者は、子供や大人の血漿ドナー、および医学研究のパプアニューギニア研究所のスタッフを認識したい。著者らは、この技術の開発への貢献のためにアマンディーヌB Carmagnac、キャサリンQニエ、ダニー·W·ウィルソン、イヴォミューラーとダイアナSハンセンに感謝したいし、血液、血清パックのオーストラリア赤十字に感謝だろう。この作品は、ビクトリア朝の州政府運用インフラストラクチャのサポートおよびオーストラリア政府NHMRC IRIISSによって可能になりました。この作品は、国立保健医療研究評議会によってサポートされていました＃1031212および＃637406を付与し、国立衛生研究所は、＃AI089686を付与します。

注：すべてのステップは、遠心分離およびフローサイトメトリーに加えて、無菌性を維持するために、層流フード内で行われるべきである。適切な予防措置がヒトのサンプルの取り扱いに関する取られることを確認してください。アッセイは、血漿の少量のために非常に敏感である。パプアニューギニア（PNG）から半免疫子供からプラズマで78％ - 提供希釈を5に至るまでの応答を解決するために最適である。最適な希釈は、プラズマセットがテストされていると異なる場合がありますので、それがプラズマは、各アプリケーションのための実験条件を決定するために調べられることをお奨めします。 2陰性コントロール血漿の非存在下でのメロゾイトを用いたTHP-1細胞の混入を確認してください。およびメロゾイトを用いたTHP-1細胞は、マラリアナイーブ個体からの血漿のプールでオプソニン化。これは、THP-1細胞へのメロゾイトの遵守のための制御を可能にし、食作用のイベントの厳密なフローサイトメトリーティングを可能にする。 PNG血漿試料を用いた医学研究諮問委員会、パプアニューギニア保健省、ウォルターとエリザホール研究所ヒューマン研究倫理委員会（プロジェクト番号4月4日）で承認されました。書面による同意は、すべての参加者の両親/保護者から得られた。 1。THP-1培養<ol><li> 5％CO 2加湿インキュベーター中、10％ウシ胎児血清（FCS）、55μM2 - mercapthoethanol（THP-1培地）を補充したRPMI-1640培地中で37℃でのヒト単球細胞株THP-1を維持する。 </li><li> 5×10 5細胞/ ml以下の濃度で細胞を維持する。注：過成長付着細胞へとダウンレギュレーションのFc受容体の分化になります。細胞が約10回継代された後、細胞表現型を維持するために新しいバイアルを解凍。 </li></ol> 2。抗体サンプル調製と希釈<ol><li> 56℃でインキュベートすることによってテストされ、マラリアナイーブ管理血漿ことへの熱不活性化プラズマ; 30分間C </li><li>直列THP-1培地中で1/2、000に、血漿試料を希釈する。 </li><li> -20℃で保存希釈した血漿</li></ol>高度同期Pの3。文化熱帯マラリア 注：GFP発現寄生虫ラインD10-PfPHG 27が原因寄生虫の同期とE64添加の制御されたタイミングをアシストする、その48時間のライフサイクルに利用された。この行は、細胞質ゾル中のGFPを発現しているためさらに、この行は、GFPのフローサイトメトリー検出によって寄生虫で無料のメロゾイトの検出を可能にする。しかし、GFPの蛍光強度がTHP-1細胞内で視覚化を提供するのに十分ではないため、メロゾイトはエチジウムブロマイド（EtBrを）で対比されている。他の寄生虫株は、タイトな同期が達成可能であることを条件として、利用することができる。侵入15を阻害するために成熟型28とヘパリンを溶解し、ソルビトール、治療の組み合わせを使用して、寄生虫を同期させる</sアップ&gt;。 <ol><li> Pを維持25 mg / mlのHEPES、50μg/ mlのヒポキサンチン、10％プールヒト血清、2 mg / mlの重炭酸ナトリウムを補充したRPMI-1640培地（pH7.4）中3％のヘマトクリットにおけるO +ヒト赤血球（RBC）中の熱帯熱マラリア原虫 、および20μg/ mlのゲンタマイシン（寄生虫培地）。 GFP +寄生虫を選択するために培養液に5 mg / mlのブラストサイジンS塩酸塩を追加します。 </li><li> 1％O 2、4％CO 2及び95％N 2の雰囲気下で37℃で気密ボックスまたは代替的に密封された二重培養フラスコ中で培養物をインキュベートする。 </li><li>寄生虫血をモニターするために10分間リン酸緩衝液（ギムザ溶液）6.7 mMの液（pH7.1）中で調製し、薄い塗抹スライドを、10秒間100％メタノールで固定し、10％ギムザ液で染色する。染色後、水と空気乾燥でスライドをすすぐ。 100倍油浸レンズを用いて寄生虫を評価する。 </li><li>文化を分割し、感染していない追加することにより、5パーセント感染RBC以下の寄生虫の寄生虫の文化を維持する必要に応じて、RBC。 </li><li>ヘパリンと同期するように、リング段階の培養に医療グレードのヘパリン20 IU / mLを加え。 </li><li>寄生虫の大半は分裂の段階にある場合には、5分間300×gでペレット細胞は、分裂の破裂およびメロゾイト侵入を可能にするために寄生虫の培地中のヘパリン含有培地で再懸濁を削除します。 </li><li> 4時間後、それ以上のメロゾイト侵入をブロックし、バックの文化に20 IU / mlのヘパリンを追加します。 NOTE：寄生虫が十分に同期される前に、ソルビトールおよびヘパリン治療のいくつかのサイクルが必要とされ得る。 5％の寄生虫 - メロゾイトの適切な数を生成するには、3から寄生虫の文化の150ミリリットルを用意。 </li></ol>後期Pの4。分離熱帯熱マラリア栄養型<ol><li>三十六時間の培養液にヘパリンを戻した後、5分間300×gで培養した細胞をペレット化し、25％のヘマトクリットで寄生虫培地中でペレットを再懸濁。 </li><li>大型磁気カラム（6.3のマトリックス容積を添付ml）を磁石にし、全ての気泡が除去されることを確認しながら、寄生虫媒体でカラムを平衡化させます。 </li><li>再懸 ​​濁Pを追加熱帯熱マラリアの列に文化、毎秒1滴に流量を調整します。 </li><li>文化がカラムを通過した後、フロースルーが明確実行されるまで、寄生虫媒体でカラムを洗浄。 </li><li> 37℃の寄生虫培地30ミリリットルの列から寄生虫を溶出する。 </li><li> 、寄生虫の薄汚れを準備し10秒間100％メタノールで固定し、3分間のギムザ液で染色。顕微鏡下でスライドを調べ、寄生虫はほとんどの赤血球を埋めていることを確認し、初期の分裂段階にあるように見える。寄生虫は、適切な成熟段階に達していない場合は、適切に開発されるまで、1％O 2、4％CO 2及び95％N 2の雰囲気下、37℃のインキュベーターに精製された寄生虫を返す。 NOTE：90％以上の感染した赤血球の純度はRを確実にするために必要とされるBCSがメロゾイト準備を汚染しない。 </li><li> 。10μMのE64 6（エポキシスクシニル-L-leucylamido（4 - グアニジノ）ブタン（E64）で孤立シゾントを扱う - 10時間注：E64とのより長いインキュベーション時間が可能であり、しかし、生産メロゾイトはもはや侵襲的なことはありません。 </li></ol> Pの5。分離熱帯熱マラリア原虫メロゾイト<ol><li> E64とのインキュベーション後、100％メタノールで細胞を固定し、膜に囲まれたメロゾイトの形成を評価するためのギムザ溶液で染色、寄生虫を汚す。注：寄生虫の50％より多くが膜囲まメロゾイトを形成している場合は、メロゾイトの良好な収率が得られる。 </li><li> 8分間1900×gでペレットE64処理シゾント。残りのヒト血清を除去するために25 mg / mlのHEPES、50μg/ mlのヒポキサン​​チン、2 mg / mlの重炭酸ナトリウム、および20μg/ mlのゲンタマイシン（洗浄媒質）を補充したRT RPMI-1640培地（pH7.4）を50mlで洗浄する。 </li><li>洗浄培地2mlにペレットを再懸濁。注：FCS含有THP-1メディアは濾過中に泡立ちが生成されます使用する。 </li><li>再懸濁したE64-シゾント2mlの1.2μm/32ミリメートルシリンジフィルターでろ過する。 10ミリリットルチューブにろ液を集める。注：ろ液をフィルターに集め、未破裂シゾントや破片で、メロゾイトおよびヘモゾイン結晶が含まれています。 </li><li>磁石に小さな磁気カラムを取り付け、500μlのTHP-1培地で平衡化させます。 </li><li>磁気カラムにろ液を渡します。フロースルーを収集します。注：メロゾイトは通過するヘモゾインは、カラムに結合します。 </li><li>毎回通る流れを集め、ヘモゾインを除去してカラムに2回以上、フロースルーを渡す。 </li><li>残りのメロゾイトを収集するために、RT、THP-1培地2mlでカラムを洗浄します。 </li><li> 10μg/ mlの（最終濃度）で処理し、室温で30分間染色でのEtBrを追加します。光退色を防止するために、光から保護してください。注：すべてのEtBrを汚染ていることを確認した液体とpラスチック廃棄物は、細胞毒性化学物質に適した方法で処分される。メロゾイトは、このインキュベーション後に、もはや侵襲的ではありません。 </li><li> 10分間4000×gでメロゾイトをスピンダウン。 </li><li>適切な廃棄容器に上清を捨てる。 </li><li> 4ミリリットルTHP-1培地でメロゾイトペレットを再懸濁し、10分間4000×gでスピンダウン。 </li><li> 15ミリリットルの容量にしたTHP-1培地を追加し、光から保護します。 </li></ol>フローサイトメトリーによる6。定量化メロゾイト濃度<ol><li> RTにカウントビーズを持参してください。 </li><li>メロゾイトを希釈するため、0.5％BSAを含むPBSを準備します。 </li><li> 3希釈でメロゾイトを数える。 100中1; 50と25での1の1はそれぞれ、PBS +0.5％BSAを940、930および910μlの3 FACSチューブを準備します。それぞれ、チューブあたり精製されたメロゾイトの10、20および40を添加する。 </li><li>渦は30秒間ビーズをカウントし、希釈されたメロゾイトを含むFACSチューブあたりのビーズの50μlを加える。 </li><li> 3 DILを実行488nmレーザーを備えたフローサイトメーターでサンプルをメロゾイトuted。 EtBrをおよびGFP蛍光のデュアル蛍光に基づいてメロゾイトの厳しいゲートを設定し、ゲートが別々のチャンネルで蛍光によってビーズを数える。 2000ビーズが収集されるまでのイベントを取得する。注：これらの命令は、EtBrで対比染色されたカウントのGFP +メロゾイトを参照してください。寄生虫GFP発現を利用しない場合には、側方散乱とのEtBrの蛍光に基づいてメロゾイトゲートを設定します。 </li><li> 2000カウントのビーズイベントによってメロゾイトイベントの数で除してビーズ、各希釈用の比率を計算します。メロゾイトの比率を決定する。チューブ毎に添加ビーズ50μlのビーズの数を決定するために、計数ビーズバッチの仕様を使用してください。 </li><li>希釈係数をとメロゾイトで50μlのビーズの数を掛ける：その希釈倍率のためのビーズの比率を。この数は、1mlあたりメロゾイトの濃度に相当します。目を実行する各希釈するためのステップをESE。 </li><li> 3希釈液の両端で測定メロゾイト濃度を平均する。 50で100、1で1のために測定された濃度が10％を超える標準偏差を、そして1 25内の希釈液を、カウントのサンプルを作成する際に、技術的に不適切な記述を示します。注意して​​ください。 </li><li> THP-1細胞あたり4メロゾイトの最終比を確保するために、THP-1培地中に8×10 6メロゾイト/ mlで再懸濁メロゾイト。 NOTE：THP-1比率に対する他のメロゾイトを使用してもよく、および濃度に応じて修正すべきである。 </li></ol> 7。食作用アッセイ<ol><li> 96ウェルU底プレートのウェルあたりの熱非アクティブのFCS 200μl加え、プレートをブロックするために、RT、O / Nで去る。インキュベーションに続いて、FCSを削除し、200μlの滅菌PBSで2回、ウェルを洗う。必要になるまで4℃で、PBSと店舗プレートを取り外します。 </li><li> 1×10で試料あたり三連のウェルを可能にする、血漿サンプルおよびコントロールをテストするために必要なTHP​​-1細胞の数を計算する<suP&gt; 5 THP-1細胞ウェルあたり。 </li><li>血球計スライド上に文化の10μlをロードすることによって、THP-1培養濃度を測定。顕微鏡下で血球計の16の角の正方形の4組の中に存在する細胞の数をカウントし、カウントを平均する。ミリリットル当たりの細胞の数を計算するために万で平均回数を掛けます。 </li><li> 5分間500×gでTHP-1細胞の必要数をスピンダウンし、そしてTHP-1培地中の6.7×10 5細胞/ mlで再懸濁する。 </li><li> 10 5細胞/ウェルで、その結果、FCSでブロックされた96ウェルU底プレートにウェル当たりのTHP-1培地中のTHP-1細胞を150μlを加える。テストされる試料あたり3ウェルを準備します。メロゾイトを追加する準備ができるまで、インキュベーターにプレートを返します。 </li><li>よく別々のFCSでブロックされた96ウェルU底プレートに8×10 6 / ml当たりのメロゾイト準備150μlのを追加します。テストサンプルあたり1をよく準備する</li><li> tに、ウェルごとに調製した希釈血漿サンプルを10μlを追加彼はメロゾイトが含まれているプレートと、均一な溶液を確保するために、よく混ぜる。 </li><li>インキュベーターからのTHP-1プレートを取り外し、よく血漿サンプルあたり三連ウェルで、THP-1細胞を含むあたりのメロゾイト/血漿溶液50μlを加える。 </li><li>よく混ぜて、5％CO 2、40分間加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートする。光から保護するためにホイルでカバーしています。 </li><li> 40分後、4℃、500×gで5分間遠心分離サンプルが食作用を逮捕する遠心機を予備冷却。 </li><li>上清を除去し、氷冷PBS +0.5％BSA 2のEDTA（FACS緩衝液）中で細胞を2回洗浄します。 NOTE：EDTA、フローサイトメトリー分析のための単一細胞懸濁液を維持するのが容易になる。 </li><li> PBS中の2％パラホルムアルデヒド（PFA）+0.5％BSA 2のEDTA（FACS固定液）の90μLで細胞を固定します。光から保護して取得、まで氷上のままにしておきます。 </li></ol> 8。フローサイトメトリー<ol><li>装備WIフローサイトメーターを用いて、サンプルを取得する488nmレーザー、高スループットプレートリーダーアタッチメントを番目。注：これは1メロゾイトの準備からテストされる400血漿サンプルまで可能になります。細胞はまた、マニュアルサンプルローディング用のチューブに転送することができます。 </li><li>前方および側方散乱によるゲート可能なTHP-1細胞。 </li><li>コントロールのメロゾイトなしプラズマを用いたTHP-1細胞のに基づいてEtBrを正のゲートを設定します。 </li><li>サンプルあたり10,000事象の最小値を取得する。 </li></ol> 9。データ解析<ol><li>解析ソフトにフローサイトメトリーを使用してデータを分析し、EtBrを正のイベントのために厳格なゲートを設定します。 </li><li>非免疫血漿を試料マイナス％陽性細胞についてのEtBr +細胞の％：各サンプルのパーセント食作用を計算します。 </li><li>三重全体の平均の結果。注：10％を超える三連の標準偏差は、実験的な不正確さを示している。いくつかの背景のEtBr陽性事象はmerozoiの結果として観察されることがあるTE THP-1細胞の表面への付着が、メロゾイトを含むすべてのサンプル間で一貫している必要があります。 「メロゾイトを用いたTHP-1細胞および無血漿 &#39;制御に基づいてゲートを設定し、[コントロール&#39;非免疫血漿を用いたTHP-1細胞のいずれかのバックグラウンドを差し引くことにより、内部化する蛍光を反射％の貪食になります/のみメロゾイトを貪食。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

メロゾイト食作用を測定するために、2技術の習熟が必要です。メロゾイトおよびTHP-1食作用アッセイの精製を。これら2つの手法を組み合わせるための最も重要なステップは次のとおりです。1）高同期さ寄生虫; 2）膜囲まメロゾイトを得る正しい時刻にE64を追加する。 3）凝集を避けるために、ヘモゾインの取り外し;フローサイトメトリーによる4）正確メロゾイトカウント; 5）使用されるプラズマの希釈;および6）低細胞密度およびTHP-1細胞の継代数を維持する。これらの重要な側面を慎重に検討、堅牢な貪食応答が観察されるようになります。 ここで説明したが食作用を評価するためのメロゾイトの調製は、技術は、広範囲の用途に利用することができる。にかかわらず、下流の方法論、最適なメロゾイト準備が正しくメロゾイトを生成するために、E64のほか、タイミングに依存しています。ここで説明する方法は、E64 yに示されている侵入イベントおよび薬剤感受性アッセイ、15〜20の高解像度顕微鏡で使用するための侵襲性のメロゾイトをield。メロゾイト生存率は食作用に必須ではないが、メロゾイト表面被膜の完全性が要求される。したがって、ここで説明E64の方法は、高品質のメロゾイト表面コートに抗体応答を評価するために生成されることを可能にする。 E64があまりに早く添加されるか、または遅すぎる膜封入メロゾイトが形成されていない場合は、 図1に概説される。この理由のために、高度に同期寄生虫培養物が必要とされる。ここで、緊密にソルビトールおよびヘパリン治療の使用は、2時間のウィンドウにD10-GFP寄生虫培養物を同期化について説明する。ヘパリンは、他の研究室の分離株でgametocytogenesisを促進することができ、従って慎重に使用する必要があります。例えば、アラニンのような代替の同期方法はまた、緊密に同期した寄生虫が29を産生していることを条件として、使用することができる。 E64非同期寄生虫に追加された場合、下側支柱膜に囲まれたメロゾイトのortionが生成され、残りの寄生虫に感染した赤血球は通常、破裂、異常な形態を開発するのどちらか。メンブレン囲まメロゾイトに発展していない寄生虫の存在は、フィルタの目詰まりが生じ、大幅に得メロゾイト収量が減少します。 膜に囲まれたメロゾイトの濾過中、ヘモゾインは、消化液胞から遊離され、溶液中の遊離結晶として存在している。ヘモゾインは非常に炎症誘発性であり、単球およびマクロファージの食作用の応答30,31を調節することが報告されている。 図2に示すように、食作用を調節することに加えて、ヘモゾインは、溶液中メロゾイトを有する凝集体を形成することができる。 THP-1細胞は、これらの凝集体を貪食することができるように、これは抗体媒介性食作用を解決するための主要な交絡因子であることができる。そのため、ヘモゾインの除去はAVにこのアッセイで必要となる食細胞生物学にヘモゾインのOIDさらに複雑。メロゾイト定量化が必要とされる場合に特に、他の用途のための自由なメロゾイトを生成するためにこの技術を使用する場合に加えて、ヘモゾインを削除するという失敗も有害であり得る。 図4に概説したように、メロゾイトの数はTHP-1細胞による食作用の程度に影響を与えることができるアッセイに加えた。フローサイトメトリーは、メロゾイト濃度の列挙を可能にする慎重なピペット操作およびメロゾイトの数を複製するものの、精度を向上させるために必要である。複数の寄生線が並んで試験される場合、これは特に重要である。それは、以前の応答が23を辞退する前に、PNGから半免疫子供からプラズマを大幅に希釈することができることが実証されている。 phagocytの大規模な範囲を生産し12歳のPNG子供 - 5のコホートのためのプラズマの最適な希釈（1/120、血漿の000最終希釈）が、ここで説明した（ - 19％、20から39パーセント、40から59パーセントと60 - 0〜79％の食作用） を図5に記載されてOSIS応答は、この範囲は、4つのグループに応答の層別に許可され、回帰モデリングはオプソニン応答が関連していたことを明らかにしたそれはTHP-1細胞による食作用が飽和または検出レベル以下れないように血漿希釈を調整する必要があり得る異なるコホート研究のために臨床的疾患及び高密度寄生虫10からの保護。 フローサイトメトリー顕微鏡よりも改善された精度で、迅速かつ定量化可能な食作用を可能にする。このプロトコルは、高スループット、自然に獲得した体液性免疫を研究する96ウェルプレートのプレートベースで自動化された買収である。この方法は、しかしながら、そのような代替SYBRGREEN、DAPIおよびプロピジウムヨウ素などのDNAの汚れ、膜の汚れやタンパク質汚れを利用することができる、エチジウムブロマイドでメロゾイトの染色を必要とする。このアッセイは、primarの影響を受けやすいだろうY単球または好中球、および食細胞またはFcRは生物学に関心があった場合に適応させることができた。 PMAとインビトロで分化初代細胞またはTHP-1細胞は、マラリアおよび他の病原体12、32-34に食作用を研究するために使用することができる。これらの細胞は接着性であり、また非抗体媒介貪食35を表示しかし初代細胞を使用することは困難な場合があります。また、純度、生存率および機能性の変動は、主食細胞の使用にいくつかの重要な制限があります。メロゾイト食作用に関与するFc受容体は、特徴付けされていないままであり、したがって、特定のFc受容体への遮断抗体を使用すると、食作用をメロゾイトする各FC受容体の寄与を明らかにできた。 THP-1食作用のFcR依存しているように、これは観測され、食作用の直接的な解釈を可能にします。このアッセイはまた、utilにすることによって達成することができるオプソニン抗体の抗原特異性に対処に役立つメロゾイト表面抗原にノックアウト寄生虫izing、または表面タンパク質をメロゾイトするアフィニティー精製されたヒト抗体を使用する。また、深さメロゾイト食作用、以下のサイトカイン応答の研究が欠けており、このアッセイを用いて達成することができる。 これらの2つの技術は、官能antimerozoite抗体の研究に相当な進歩を構成する。高品質のメロゾイトの精製は、凍結保存メロゾイト、またはメロゾイト抗原でコーティングされた蛍光ミクロスフェアを使用することが有利である。このアッセイは、自然に獲得免疫を評価するためのツールと​​して使用されてきたが、ワクチン接種に応答して、免疫の獲得に対処するための重要なツールを証明することができる。それは最近、食作用またはオプソニン化メロゾイトは、臨床マラリアからの保護と関連していることが示されたが、 インビボ phagocytoにインビトロ THP-1食作用から直接結論を引き出すことは不可能であるこのアッセイにおいて、食作用などのメロゾイトのSISは、静的な条件の下で、赤血球を、競合が存在しない場合に発生します。このアッセイの潜在的な適応は、したがってマラリアおよびメロゾイト食作用のさらなる理解のための多目的ツールを提供することができる。

熱帯熱マラリア原虫マラリアに対する免疫のための抗体の重要性は、高度免疫大人からの免疫グロブリンを受動的に緩和する疾患1、その結果重症マラリアに苦しむ子どもたちに移したとき、40年前に示された。その結果、かなりの努力は主にELISAによりペプチドまたは細菌で発現するタンパク質に対する抗体価を測定を通じて、保護マラリア免疫の標的を同定するために努めてきた。 ELISAに基づく血清学も研究間の非常に変化が証明されたし、抗体の機能2には対応していません。多くのマラリア抗原は細胞親和性IgG1およびIgG3抗体プロファイル、特にメロゾイト表面抗原3を誘導する。このサブクラスバイアスは、食細胞による抗体のFc受容体（FcRで）相互作用がantimerozoite抗体4をオプソニン化のエフェクター機能にとって重要であることを示唆している。開発中のいくつかのメロゾイト抗原ワクチンをするように設計されてい食細胞のエフェクター機能5,6を誘発し、齧歯類マラリアモデルにおける抗体のFcR相互作用の重要性のための重要な証拠が7-9が存在し、いくつかの最近の研究は、ヒトにおけるマラリアに対する免疫のための機能的抗体および食細胞のエフェクター機能の重要性を支持するものの10、11、この領域が不十分な研究されたままになります。メロゾイト特定のオプソニン抗体への研究は、2つの要因によって制限されていた。良質のメロゾイトを分離することが困難。初代細胞から、変数貪食応答。 最近まで、高速遠心分離又はパーコール密度勾配は、シゾント培養物を破裂の培養上清からのメロゾイトを単離するために利用された。これらのメロゾイトはほとんど生存可能であった、と多くの場合、さらに密度遠心分離によって操作し、複数のウォッシュアッセイで使用する前に12、または凍結保存11を繰り返します。これらのPROCessesは、潜在的にメロゾイト表面から多くの末梢に関連するタンパク質、マラリア免疫13の抗原性標的であることが知られているタンパク質を切り離す。最近、システインプロテアーゼ阻害剤トランス-エポキシスクシニル-L-leucylamido（4 - グアニジノ）ブタン（E64）は、生存可能なメロゾイトを生成するために使用されている。 E64は、生存メロゾイト15,16を遊離濾過によって破壊することができる膜封入メロゾイト14を生成する、シゾントの破裂を防止する。この手法は、赤血球侵入15、17〜19の間の多数のタンパク質の空間分解能につながったといくつかの抗マラリア薬16、20の段階特定の効果を明らかにした。しかし、実行可能なメロゾイトの生成は技術的に困難なままです。免疫の機能アッセイ、中の生存メロゾイト精製およびそれらの使用のための詳細なプロトコルには、この技術とアプリケーションの普及を支援するために抗体の標準化された機能アッセイ：オプソニン化および食作用における細胞の協力は、ここで説明されている。 この技術は、好中球呼吸バースト、抗体依存性細胞阻害（ADCI）、および代替メロゾイト食作用アッセイなどメロゾイトオプソニンの以前のin vitroアッセイ、上の有意な進歩を示しています。これらのアッセイは、寄生虫の入力の変化と主食細胞11、21の活性に再現性に乏しい。ヘモゾインを汚染することも深く食細胞機能22に影響を及ぼす可能性があります。最近報告された、堅牢で再現性のメロゾイト食作用アッセイ23は、前単球細胞株THP-1 24を利用しています。それは非接着性であり、特異的Fc受容体媒介性食作用25,26を実行するので、これはハイスループットフローサイトメトリーアッセイのための理想的な細胞型である。さらに複雑投資家間食作用をtigatingする食作用の程度は、THP-1細胞および血漿濃度に対してメロゾイトの数に依存することである。実験間の再現性を確保するために、メロゾイトが列挙されるべきであると規定された濃度を用いる。その小さなサイズのために、フローサイトメトリー定量化が必要とされる。 ここで説明する手順は、ヘモゾインが削除され、実行可能なメロゾイトを生成し、オプソニン化および食作用に続いてメロゾイトのフローサイトメトリーの列挙のためにこれらのメロゾイトの適用について説明します。技術的に要求が、説明された技術は、自然免疫を獲得し、ワクチンが誘導するメロゾイト表面特異的抗体応答の寄与を解明するのに有用であることを証明し得る。

<table><tbody><tr><td>THP-1細胞株</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>2-mercapthoethanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td>ヒュームフード</td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌溶液に使用 (100x)</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SAFC</td><td>90909C</td><td>細胞培養グレード</td></tr><tr><td>ヒポキサンチン</td><td>Calbiochem</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清&nbsp;</td><td>オーストラリア赤十字社</td><td></td>からの寄付 <td>市販品(Invitrogenなど)重</td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>ファイザー</td><td>61022027</td><td>注射品質</td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム BP (5000 IU/ml)</td><td>ファイザー</td><td></td><td>豚由来</td></tr><tr><td>ブラストサイジン S-塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15205</td><td></td></tr><tr><td>D-ソルビトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-70-4</td><td></td></tr><tr><td>E64 プロテアーゼ阻害剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132-10MG</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>98281-100G</td><td>リン酸緩衝液に使用</td></tr><tr><td>Na2HPO4.2H20</td><td>Merck</td><td>10383.4G</td><td>リン酸塩緩衝液</td></tr><tr><td>に使用 Giemsaのアズールエオシンメチレンブルー溶液</td><td>メルク</td><td>1.09204.0500</td><td>1:10 希釈 6.7 mN リン酸緩衝液で (各染色を新鮮にする)</td></tr><tr><td>EDTA 二ナトリウム塩</td><td>メルク</td><td>10093.5V</td><td>0.1 M、pH 7.2</td></tr><tr><td>アクロディスク シリンジ フィルター 1.2-&mu;m/32-mm</td><td>ポール・ライフサイエンス</td><td>4656</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS セパレーター (スモールカラム用)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-091-051</td><td>MidiMACSと交換可能&nbsp;</td></tr><tr><td>VarioMACS セパレーター (大型カラム用)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-090-282</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>LS カラム (小型磁気カラム)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>大型磁気カラム</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-041-305</td><td></td></tr> 臭<tr><td>化エチジウム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1510433</td><td>Cytotoxic</td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads</td><td>Invitogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二ナトリウム塩</td><td>Merck</td><td>10093.5V</td><td>0.1 M, pH 7.2</td></tr><tr><td>FlowJo サイトメトリー解析ソフトウェア</td><td>Tree Star</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

高収率の精製<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</emオプソニン抗体アッセイにおける使用のための&gt;メロゾイト

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

熱帯熱マラリア原虫のメロゾイト抗原は、潜在的なマラリアワクチンとして開発が進められている。マラリアに対する免疫の一態様は、貪食細胞による血液からの遊離メロゾイトの除去である。しかしメロゾイト特定オプソニン抗体の機能的有効性を評価することにより、メロゾイトの短い半減期および一次貪食細胞の変動に困難である。本明細書に詳細に記載プロ単球細胞株THP-1を用いてE64プロテアーゼ阻害剤を使用して実行可能なメロゾイトを生成するための方法、およびメロゾイトのアッセイオプソニン食作用に依存している。 E64は、治療シゾントの濾過によって放出されたメロゾイトの開発を可能にしながらシゾントの破裂を防止する。臭化エチジウム標識されたメロゾイトは、ヒト血漿試料でオプソニン化し、THP-1細胞に添加する。食作用は、標準化ハイスループットプロトコルによって評価される。実行可​​能なメロゾイトはNUMERを評価するための貴重な資源であるPの組織単位（OU）の側面免疫機能の評価に熱帯熱マラリア生物学。このアッセイで測定した抗体レベルが自然に暴露された個体におけるマラリアの臨床免疫と関連している。アッセイはまた、ワクチン誘発された抗体を評価するために有用であり得る。

前E64処理に寄生虫の成熟段階は、膜で囲まれたメロゾイトを生成するために重要である。 図1AIは E64を追加するためのシゾントの適切な成熟段階を示している。寄生虫が大きくなり、ほとんどの赤血球を埋める必要があります。ギムザ染色のまだら外観は卵片発生が開始されたことを示し、およびE64は膜で囲まれたメロゾイト（ 図1Aii）を得加えるべきである。 E64は、期寄生虫を栄養する前に追加された場合、膜囲まメロゾイトさえE64の12時間後に生成されていません。代わりに、寄生虫は、消化液胞（ 図1BIと1Bii）の拡大などの異常な形態を取ること、およびメロゾイトが形成されていない。 E64は、後にシゾントに追加された場合、膜に囲まれたメロゾイトはシゾントの破裂として生成されていない（ 図1CIと1Cii）使用禁止解除されます。寄生虫同期高いレベルが要求される、他の賢明記載された全ての3つの結果の範囲は、E64処理後に分かるであろう。 ヘモゾインの除去は、精製メロゾイトのためのもう一つの重要なステップです。メロゾイトはヘモゾインから精製されていない場合は、メロゾイト-ヘモゾインクラスタはピペッティングで外れできない形成している。これらの凝集体は、フローサイトメトリー（ 図2A）による不正確なメロゾイトカウントで、その結果、単一のメロゾイトは異なるフォワード散乱および側方散乱特性を持つとはいえ、一つのイベントとしてサイトメーター上で実行されます。 THP-1細胞はまた、ヘモゾインを貪食することができるように、これらのメロゾイト-ヘモゾインクラスターはまた、（ 図2B）を貪食することができる。彼らは複数のメロゾイトが含まれているように、これらの凝集体は、高度のEtBr蛍光性である。複数の個々のメロゾイトの食のために観察されたものと、THP-1のEtBr蛍光プロファイル換算で集計結果の貪食。ヘモゾインが除去されない場合は、したがって、THP-1細胞のEtBr蛍光はOであろうテストされているプラ​​ズマのためのオプソニン化ポテンシャルのverestimate。ヘモゾインも大幅に食細胞機能を変化させることが報告されている。 GFP陽性のメロゾイトは、カウンタTHP-1細胞による貪食メロゾイトの視覚化を高めるためにEtBrで染色する。このプロトコルに記載されている条件を使用して、すべてのGFP陽性メロゾイトは明るい蛍光強度（ 図3A）を有するEtBrで対比染色される。 EtBrを蛍光による食作用の評価は、GFP蛍光（ 図3B）よりもメロゾイト食作用の優れた分解能を可能にします。 アッセイに加えメロゾイトの数を観察し、食作用の量を調節します。このため、フローサイトメトリーによる正確なカウントが非常に重要です。メロゾイトの増加割合：THP-1は、血漿の非存在下でのTHP-1細胞（ 図4A）にメロゾイトの増加遵守になります。増加メロゾイト：THP-1の比率も増加してpHをもたらしメロゾイトが（ 図4B）オプソニンされたときの応答をagocytosis。 4時01メロゾイト：THP-1比率は、堅牢な食細胞の応答をお勧めします。この比、および示された血漿の希釈液を用いて、このアッセイは、抗体のオプソニン化、低、中および高レベルを解決することができる。 0〜78％の食作用の応答は、PNG血漿サンプルと記載された他の条件を用いて観察されている。このような応答は、最近、マラリア10に自然に獲得した臨床免疫に関連することが示されている。 図5は、PNG形式の個人からの貪食応答の4四分位数の例を示している。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig1highres.jpg" width="500" /> E64添加の図1。タイミング膜に囲まれたメロゾイトを生成するために重要である。 （A）適切なmaturatio。E64が未熟寄生虫に追加された場合、n個のI）の前にE64処理に寄生虫の段階と、ii）E64処置の6時間後に製造された膜で囲まれたメロゾイト（B）膜囲まメロゾイトは生成されません。 I）後期栄養型、およびE64は後半シゾントをセグメント化するために追加された場合II）E64の12時間後に（C）分裂破裂を阻害しない。 I）後期シゾントと、ii）E64の6時間後。スケールバーは10μmで表しています。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。ヘモゾイン除去がヘモゾインが磁気メロゾイトから分離されている場合を除きます。メロゾイト-ヘモゾインの凝集体は、膜囲まれたメロゾイトのろ過次の形式単細胞メロゾイトサスペンションを生成することが重要である。（A）メロゾイトの前方散乱及び側方散乱プロットでヘモゾイン削除そしてヘモゾインを保持していた（B）ヘモゾイン-メロゾイト凝集物がTHP-1細胞によって貪食することができる。 PNG血漿と共にインキュベートTHP-1細胞のディフクイック染色したインサイトスピンスライドをヘモゾインの有無にかかわらずメロゾイト調製物をオプソニン。スケールバーは10μmで表しています。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig3highres.jpg" width="500" /> 図3。ジウムブロマイド染色は、（A）GFP陽性メロゾイト上のゲーティングで精製されたメロゾイトのhistrogramフローサイトメトリー。D10-GFPを精製したメロゾイトは、蛍光強度を向上させるためにEtBrで対比されています。メロゾイト食作用の優れた分解能を可能にし、EtBrをを示すドットブロットこのゲート付きのGFP陽性集団内の蛍光（B）、GFPに対する前方散乱とGFPとのEtBrデュアル蛍光メロゾイトの貪食次のTHP-1細胞のEtBrを対前方散乱。ゲイツはDだった<html> rawnという形式メロゾイトなしプラズマ制御を用いたTHP-1細胞に基づく。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" width="500" /> 図4メロゾイト：THP-1比率は観察食作用の程度に影響を与えます。 （A）ファイブメロゾイト：THP-1比率が描かれている。 50:1 20:1 10:1、4:1、1:1である。細胞のみの対照は、THP-1細胞によるバックグラウンド蛍光を示す。各比率のためのTHP-1のEtBr蛍光は、（B）は、異なるメロゾイトのためのTHP-1細胞の平均蛍光強度のPNG血漿のプールに、または非免疫オーストラリアプラズマでオプソニンメロゾイトのために示されている：THP-1の比率、プールでオプソニンPNG形式の血漿または非免疫オーストラリアプラズマ（平均±SEM）の。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> ove_content「FO：キープtogether.withinページ= &quot;常に&quot;&gt; <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" width="500" /> 図5オプソニン抗体の大きな範囲を測定することができる。メロゾイトはPNG個体からの血漿でオプソニン化し、THP-1細胞と共にインキュベートした。 4つの代表的な食作用応答が示されている。ゲートはメロゾイトなしプラズマ制御を用いたTHP-1細胞に基づいて描かれた、と数字は非免疫プラズマ制御を用いたTHP-1細胞を差し引いた後％の食作用を示してた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

抗体機能を測定することは、 熱帯熱マラリア原虫マラリアに対する免疫を理解するうえで重要です。この方法は、生存可能なメロゾイトの精製を記載し、フローサイトメトリーによるオプソニン化依存性食作用を測定する。

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

本手順の全体的な目的は、ヒト抗体によるオプソニン化を定量化するため、高収量で純粋な Plasmodium falciparum のマイト（maite）を調製することです。まず、E 64 を用いてシゾント（schizont）の破裂を抑制し、膜に包まれたマイト構造を生成させます。次に、遊離したマイトを回収し、AUMブロマイドで染色します。最終ステップでは、マイトをさまざまなヒト血漿サンプルおよび THP-1 ヒト単球細胞とともにインキュベートし、定量化を行います。最終的に、異なるヒト血漿サンプルによるマラリア原虫のオプソニン化は、フローサイトメトリーによって区別することができます。マラリア原虫に対する機能的免疫の既存のアッセイと比較して本手法の利点は、無傷の原虫を使用すること、および食作用の応答が強固で定量可能であることです。この手法は、ワクチン接種者や自然感染した個体におけるマラリア免疫に対するオプソニン化抗体と食作用の重要性は何か、というマラリア免疫学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。mezoの形成を確実にするにはE 64の投与タイミングが不可欠であるため、本手法の視覚化は極めて重要です。また、mezoの調製と計数は技術的に困難であるため、後期段階のP falciparum栄養体に磁気分離を行った後、寄生虫の薄い塗抹標本を100% methanolで10秒間固定し、Giemsa液で3分間染色して寄生虫の成熟度を評価してください。染色したスライドを顕微鏡で観察し、寄生虫が赤血球のほぼ全体を占め、初期シゾント段階にあることを確認します。寄生虫が適切な成熟段階に達していない場合は、適切に発達するまでインキュベートを継続します。十分に成熟したら、単離したシストを10 micromolarのE 64で処理し、さらに6〜10時間インキュベートします。E 64によるインキュベーション後、処理した寄生虫の塗抹標本を作成します。スライドを100%methanolで固定し、Giemsaで染色して、寄生虫の少なくとも50%が膜を形成していることを確認します。残りのE 64処理済みの検体を、室温にて1900 Gsで8分間遠心分離してペレット化します。その後、室温の50 millilitersで寄生虫を洗浄します。洗浄用培地を用いて、残存しているヒト血清を除去します。上清を捨てた後、寄生虫のペレットを2 mLの洗浄用培地で再懸濁し、次いで細胞懸濁液を1.2 µmのシリンジフィルターでろ過して、maitesおよびhemon結晶を10 mLチューブに回収します。次に、小型の磁気カラムをマグネットに取り付け、500 µLのTHP one培地で平衡化します。ろ液を磁気カラムに3回通し、その都度フロースルー中のmaitesを回収します。その後、室温のTHP one media 2 mLでカラムを洗浄し、残っているmaitesを回収します。ヘミンを除去することは、マイトを精製するための重要なステップです。マイトがヘミンから分離されていない場合、マイト・ヘミンクラスターが形成され、フローサイトメトリーによるマイトの計数が不正確になります。THP-1細胞はヘミンを食作用で取り込むことができるため、マイト・ヘミンクラスターも細胞内に取り込まれる可能性があります。したがって、ヘミンを除去しない場合、テスト対象である血漿のオプソニン能も過大評価されることになります。回収したmaitesを、室温・遮光条件下で10 micrograms per milliliterのahy bromideを用いて染色します。30分後、maitesを遠心分離し、上清を適切な廃棄容器に廃棄して、maiteペレットを4 millilitersのTHP one mediaで洗浄してmaitesをペレット化します。次に、遮光下で細胞を15 millilitersのTP one mediaに再懸濁します。フローサイトメトリーでmaitesを定量するため、1/100、1/50、1/25の希釈段階でmaitesをカウントします。まず、3本の異なる FACSチューブに、BSA添加PBSをそれぞれ 940 µL、930 µL、および 910 µL 分注し、各チューブに精製した maites をそれぞれ 10 µL、20 µL、および 40 µL 加えます。次に、室温のカウンティングビーズを30秒間ボルテックスし、希釈した maites が入った各 FACSチューブにビーズを 50 µL ずつ加えます。488 nm レーザーを搭載したフローサイトメーターでこれら3つの希釈 maites サンプルの測定を行い、atherium bromide と GFP の二重蛍光ゲートに基づいて maites の厳格なゲートを設定し、ビーズを別のチャンネルで設定して、ビーズが 2000 個収集されるまでイベントを取得します。各希釈段階におけるmaiteの数を定量するために、3回のmaite濃度測定値の平均を算出します。次に、maiteの食作用を測定するため、最終比率がmaite 4個に対しTHP-1細胞1個となるよう、maiteをTHP-1培地中で8×10⁶ maites/mLに再懸濁します。まず、アッセイに必要な量のTHP-1細胞をペレット化し、THP-1培地中で6.7×10⁵ cells/mLに再懸濁します。次に、テストする各条件について、FCSでブロッキングした96ウェルU底プレートに、最終濃度が10⁵ cells/wellとなるように、THP-1細胞を150 µLずつ3連（triplicate）で分注します。プレートをインキュベーターに入れ、マクロファージを添加するまで静置します。その後、分離したマクロファージを8×10⁶ cells/mLの濃度で150 µLずつ、別途FCSでブロッキングした96ウェルU底プレートのテスト条件ごとに1ウェルに添加します。調製した希釈プラズマサンプルを10 µLずつ各ウェルに加え、均質な溶液にするため十分に混合します。次に、テストする各プラズマサンプルについて、THP-1プレートの各ウェルにプラズマ溶液を50 µLずつ3連（triplicate）で加えます。サンプルをよく混合し、その後、共培養物を加湿インキュベーター内で37 °C、5% CO2の条件下でカバーをしてインキュベートします。40分後、あらかじめ冷却した遠心機でサンプルを遠心分離し、食作用を停止させます。次に、氷冷したfax bufferで細胞を2回洗浄します。2回目の洗浄後、90 µLのfax fixativeで細胞を固定し、氷上に置いたままにします。採取まで遮光保存してください。E 64処理前の寄生虫の成熟段階は、膜に包まれたmaitesを生成させるために極めて重要です。寄生虫は大きく、赤血球をほぼ満たしており、斑状のgems染色を示す必要があります。この段階で E 64 を添加し、6〜10時間インキュベートすると、膜に包まれたmaitesが得られます。トロフォゾイト期の寄生虫に E 64 をより早い段階で添加しても、膜に包まれたmaitesは生成されません。一方、schizontの破裂後に E 64 を添加しても、破裂を抑制することはできません。高いレベルの寄生虫の同期が必要です。そうでない場合、E 64処理後の食作用測定において、上述した3つの結果が混在して観察されます。acridine orange蛍光による測定は、GFP蛍光単独よりも寄生虫の食作用をより高い解像度で検出することを可能にします。mitesとTHP-1細胞の比率を高めると、THP-1細胞へのmitesの接着が増加します。maite特異的抗体が存在しない場合、MEITEとTHP-1細胞の比率を上げると、食作用も0%から78%まで増加します。パプアニューギニアの血漿サンプルを用いたMAITEとTHP-1細胞の4:1の比率において、maiteのオプソニン化が観察されています。これらのデータは、パプアニューギニアの代表的な4名の個体から得られたPHA酸性反応の4つの四分位数の例を示しています。このアッセイを用いて測定されたオプソニン化抗体は、マラリアに対する臨床的な免疫と関連していることが示されています。この手順を試行する際は、PE細胞による食作用を成功させるための重要なポイントは、完全に成熟し、無傷のメロゾイトを得るために寄生虫を高度に同期させることと、THP-1細胞の培養を適切に維持することです。本手順で概説するメロゾイト精製の手法は、マラリアの運動性、浸入アッセイ、プロテオミクス、または血清学的検査など、高品質なマラリアメロゾイトを必要とするあらゆるアプリケーションに適応させることができます。このビデオを視聴することで、E 64法を用いてメロゾイトを精製し、THP-1細胞による食作用を測定してオプソニン化抗体を調査する方法について、十分な理解を得ることができるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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