Name: 共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 8 s
Description: 学ぶ造血幹細胞と前駆細胞の生体内クローン追跡法。5種類の蛍光タンパク質を用いた共焦点・多光子顕微鏡により、骨髄再生時の細胞運命と空間的クローン進化を可視化する手法です。

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この作業は、国立衛生研究所の国立心臓・肺・血液研究所の学内研究プログラムの支援を受けました。5つのLeGOベクタープラスミドを提供してくださったBoris Fehse氏(University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany)に感謝します。クリスチャン・A・コムズとニール・S・ヤング(NHLBI、NIH)は、この研究全体を通じての議論、サポート、励まし、アンドレ・ラロシェル(NHLBI、NIH)は尾静脈注射の支援を提供してくれました。

全てのマウスを飼育し、取り扱う国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針に従って、およびNHLBI動物実験委員会が承認したプロトコルに登録された。雌B6.SJL-Ptprc（d）は6-12週齢PEP3（b）に/ BoyJ（B6.SJL）およびC57BL / 6マウスを、それぞれ、ドナーとレシピエントとして使用した。 材料、試薬、および機器のリストを表1に提供される。 マウスHSPCs 1。LEGO伝達および骨髄移植認定されたバイオセーフティーレベル2（BSL-2）キャビネット（組織培養フード）に以下の手順を実行します。 <ol><li> LEGOベクターのエンコーディング5FPSの生産<ol><li>レンチウイルス「遺伝子オントロジー」（LEGO）ベクタープラスミドを使用してくださいLEGO-CER2（セルリアン）、レゴ-G2（EGFP）、レゴ-V2（金星）、レゴ-T2などの強力な構成SFFVプロモーターから異なるFPをコードする各（TdTomato）、そして親切に博士ボリスFehse（大学医療センターハンブルク·エッペンドルフ、ハンブルグ、ドイツ）により提供さLEGO-C2（mCherryを）; Addgene 5-7からも利用可能になりました。 </li><li> I10メディア8mlにLEGOベクトル、トランスフェクション前に10cmの皿（各ベクトルのための12の皿を使用）、24時間でのシード5×10 6個の293T細胞を作製するために、（IMDM、10％FCS及びグルタミン/ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した）。 </li><li>わずかに変更されたCAPHOSキットの推奨を使用して、リン酸カルシウムと細胞をトランスフェクション： <ol><li>各プレートミックス15μgのレゴベクトルの場合、12μgのpCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE、4μgのPREV-TAT、および1μgpMD2.G-VSV-Gプラスミドを50μlの2.5MのCaCl 2の存在下で、および水を加える500μlの総容量が得られます。 </li><li> 2×HEBS（HEPES緩衝生理食塩水）500μlのプラスミドDNAを沈殿させ、前293T細胞の各プレートに添加する室温で20分間インキュベートする。 </li><li>のために細胞をインキュベート37℃、5％CO 2インキュベーター中で6時間;メディアを取り出し、新鮮な培養培地6時間後に、トランスフェクションを追加します。 </li></ol></li><li> 3日間、毎日、各プレートからレンチウイルス粒子を含む培養上清を収集します。毎日、以下の上清の収集を各プレートに新鮮I10メディアを追加します。 <ol><li> 0.22μmの細孔を、プールを通して濾過し、71900×gで、4℃で2時間SW28ローターに超遠心分離によって上清を集中。 </li><li>ステムスパン培地1 mlの上清を再懸濁する。 -80℃で200μlの、店舗でのレンチウイルス株を分注し。 </li></ol></li></ol></li><li>レンチウイルス粒子の滴定 NIH3T3細胞を用いて、単位/ mlに形質導入​​の定量を介して収集上清中のレゴベクター粒子の力価を決定します。力価は、実験対象のための感染（MOI）の所望の相対多数になるために必要な各ベクトル上清の体積を計算することができ細胞。 <ol><li>プレート1日滴定前I10メディア2ml中のウェル（12ウェルプレート）当たり5×10 4 NIH3T3細胞。 </li><li> （4 mg / mlのは1,000倍である）、硫酸プロタミンを補充したI10メディアのベクトル上清の5倍連続希釈液を調製する。 </li><li>細胞から培地を除去し、濃縮したウイルスの2、0.8、0.32、及び0.128μlのと同等のものを含む上清の希釈液を500μlと交換してください。 </li><li>うまくつのコントロールを数える、形質導入の際にウェル当たり存在する細胞数（なし）を決定します。 </li><li>形質導入後6時間、I10培地2 mlを追加し、37°C、5％CO 2で3日間インキュベートする。 </li><li>各ウェルトリプシン-EDTAを使用してから細胞を採取し、フローサイトメトリーを介した蛍光細胞の割合（％FP）を決定。 </li><li>無価（ベクター粒子/ ml）= 1〜50％％のFP結果として各ウェル（希釈）について得られた力価の平均を、以下のような力価を計算するベクター上清（ミリリットル）のX％、FP /音量。 FPは1〜50％の間である％あれば各希釈について得られた力価を平均する。 </li></ol></li><li>マウスの細胞採取、精製、形質導入、および移植（模式的に図1Aに示すがMalide ら 4から採用）。 <ol><li>承認された手順により、ドナーマウスを生け贄に捧げる。前部と後部の手足から収穫骨髄：、上腕骨、大腿骨と脛骨を解剖徹底的に骨からすべての筋肉、靭帯および余分な組織を除去し、関節にできるだけ近い各骨の終わりを横断し、外に骨髄をフラッシュI10メディアを入れた注射器に27-0 Gの針を用いて骨。 </li><li> 500×gで、4℃で10分間、全骨髄細胞をペレット化し、50mlのACK緩衝液で2回赤血球を溶解。 10ミリリットルI10培地中の細胞を再懸濁。 </li><li>修正されたキットのprotocoに従って、MACS系統枯渇キットで系統陰性（リニア）前駆細胞を精製L： <ol><li>抗ビオチンマイクロビーズ30μlの代わりに10μlの/ 10 7個の細胞を使用してください。 I2メディア（2％FCSを添加したIMDM）の代わりに緩衝液での洗浄ステップを完了します。 </li><li>ビオチン抗体カクテルとのインキュベーションと抗ビオチンマイクロビーズとのインキュベーションの間に1つの洗浄工程を挿入します。とI10の代わりに緩衝液を用いてカラムを平衡化。 </li></ol></li><li> 10ng / mlのネズミIL-3、100ng / mlのネズミIL-11、100ng / mlのヒト体Flt-3を補充したステムスパン培地中で5×10 5細胞/ mlの出発密度で48時間培養リニア細胞リガンド、および50ng / mlのマウス幹細胞因子。 </li><li>レトロネクチンでコーティングした12ウェルプレートに移す1〜5×10 4個の細胞およびステムスパンの存在下で、それぞれのFPのための50％の発現効率を達成するために6-7のLEGO上清を、感染多重度での各（MOI）で形質導入するメディアやサイトカインは、上記に詳述し、4 / mlの硫酸プロタミン。 </li><li>細胞を形質導入各LEGOベクターによる個別同時にすべて5 LEGOベクター上清と共に形質導入​​（ミックスと呼ばれる）または共形質導入細胞を、次のステップ1.3.5で説明して混合細胞など（株と呼ばれる）。 、24時間後に細胞を除去するサイトカインずにステムスパンメディアで1回洗浄し、移植のためのサイトカインなしにステムスパンメディアで再懸濁し、またはサイトカインで新鮮な培地に転送し、さらに96時間の培養、共焦点顕微鏡の前およびフローサイトメトリー。 <ol><li> 1に対応したマウスあたり細胞用量で、100μlの容量で、11 Gyの単回投与前の放射線照射レシピエント（6-18時間移植前の）レシピエントに尾静脈注射を介して伝達リニアHSPCsを注入することにより、骨髄移植を行います-4×10 5リニアもともと形質導入のためにプレーティングした細胞。各実験において、形質導入されたドナーBM細胞の同じ集団での動物のコホート全体を移植。 </li><li>形質導入されたH のin vitro特徴付けのためSPCはは、文化ステムスパンで追加の4-5日間、細胞がサイトカインを補充し、導入効率のために、フローサイトメトリーによって分析して、色の多様性のための顕微鏡法による。 <ol><li>個別のマウスを犠牲にし、さまざまな時間は、移植後120日までの時点で、イメージングのための組織や臓器を取り出す。 <ol><li>エタノールでマウスの毛皮をスプレーし、髪の普及を回避腹側の皮膚を切開。 </li><li>標準的な手順脾臓、膝窩リンパ節、肺、心臓、皮膚、脂肪組織、骨格筋、腎臓、肝臓だけでなく、頭蓋冠へのアクセスへの​​ヘッドによれば解剖と消費税。 </li><li>または、頭蓋冠を使用するか、またはそのような生きた動物での皮膚やリンパ節などの時間2,8,9-や画像、表在臓器にわたって繰り返し、ライブイメージングのための骨のウィンドウを設定します。 </li></ol></li><li> 50-100で35ミリメートル数0カバーガラス培養皿に、個別の器官を配置56;ステップ2.5で説明したように、切片、固定またはさらなる処理なし無傷でそれらを画像化するためのPBS。 </li><li>ボリュームイメージングのために、冷PBS中で使用するまで臓器をしてください。タイムラプスイメージングのために、20mMのHEPESを含有する10％FBS、37℃でDMEM中で臓器を画像化するに直ちに進む</li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2共焦点と二光子顕微鏡と画像解析<ol><li>マルチラインアルゴン、ダイオード561 nmのヘリウムネオン594ナノメートル、およびヘリウムネオン633nmの可視光レーザーを搭載したライカSP5 5チャンネル共焦点および多光子システムを使用して、顕微鏡イメージングを実行します。 680から分散補正と1,080 nmの励起用サファイアチタン（Ti-SA）レーザー、波長可変：2光子モード、パルス状のフェムト秒チタンで使用してください。 tと共に順次または同時に、1,030-1,300 nmのものであれば、出力波長範囲を拡張するために赤色にシフトしたFP（tdTomatoおよびmCherryを）、光パラメトリック発振器（OPO）レーザーを含む実験で使用のTi-Saのレーザー彼。 </li><li> HCX-IRAPO-L 25X / 0.95 NA水浸漬対物レンズ（WD = 2.5ミリメートル）、HC-PLAPO-CS 20X / 0.70 NA乾燥対物レンズ（WD = 0.6ミリメートル）、またはHC-PL-IRAPO 40Xを用いた画像さまざまな組織/1.1 NA水浸対物レンズ（WD = 0.6 mm）である。 </li><li>コントロールのと同様に、単一のFP LEGOベクターで形質導入骨髄細胞から可視スペクトルの5nmの帯域幅で発光した光のラムダスタック（xyλ）を収集し、共焦点蛍光スペクトルを取得し、BMを移植しない。 <ol><li>ライカLAS-AFのV2.4.1ソフトウェアとプロセスイメージは、すべて5 FPの参照スペクトルだけでなく、自家蛍光のように（ 図2A）を作成する。個別のFPスペクトルおよび蛍光の明るさの差を使用して次のように5シーケンシャルイメージングチャネルを設定セルリアン（79％）、金星（156mg％）、tdTomato（283％）およびmCherryを（47％）の（EGFPの％として表される）。セルリアン（458/468から482 nm）を、EGFP（488/496から514 nm）を、ヴィーナス（514/523から558 nm）で、tdTomato（561/579から597 nm）を、そしてmCherryを（594/618から670 nm）を（ <strオング&gt;図2B）。 </li><li>各個別のFPで形質導入された細胞が残ります（ 図2C）からのみ対応するチャネルに表示して存在しないように、正確なfpsの分離を検証します。また、この定義されたマルチチャネルアプローチは、その後の色分析およびクローン追跡を可能にし、スペクトルイメージングと比較して、取得時間を減少させるという利点を有するユニークな5チャンネル &quot;colorprint」を作成する。 </li></ol></li><li>高効率のカスタムダイクロイックミラーによる2光子モードでの個別の蛍光発光、および以下のように非デスキャン検出器（NDD）、4つのチャネルで収集し、続いて465 nmのダイクロイックミラーに続く568 nmのダイクロイックミラーを、 SHGまたは自己蛍光及びセルリアンための45分の452 nmの発光フィルター、EGFPや金星のための40分の525 nmの発光フィルター、および648 nmのダイクロイックミラーとtdTomatoまたはmCherryをするための60分の620 nmの発光フィルター。 <ol><li>二光子顕微鏡iで構造情報を明らかにするntrinsicコントラストエラスチンからの組織自己蛍光画像化（上述のように）、NADH、（780で励起）であり、第2高調波は、骨および後方散乱収集920 nm以上860 nmでの線維性コラーゲン（興奮からの信号（SHG）を生成し方向）10,11。 </li></ol></li><li> 3Dボリュームレンダリングのために、骨髄およびその他の組織全体の深さの範囲（150〜300ミクロン）上に5μmの間隔で、z軸に沿ってのxyz一連の画像（典型的には1×1×4μmの3ボクセルサイズ）を収集し、大規模な、全体を自動的胸骨窩を備えたステッチのボリュームを生成するために、約2.5×1.2ミリメートル2（XY）と300μmの（z）が（ 図2D-2E）のソフトウエアのタイル機能を利用して地域やムービー1オーバー。 <ol><li>画像は2,8を区画することなく頭蓋骨を介して直接、骨髄頭蓋冠。 </li><li>矢状面（二分）に沿ってセクション胸骨、その後横方向に切断面3,4,12を通じて2胸骨堀と画像の間の共同で（ 図1（b）の概要高久ら 3から採用）。 </li></ol></li><li> 4Dタイムラプスイメージングのために、50〜100μlのDMEM、37℃で20mMのHEPESを含有する10％FBS中、35ミリメートル番号0カバーガラス培養皿上に新たに切除した膝窩リンパ節、脾臓、肺、または頭蓋冠骨サンプルノーカットを配置と〜（Z-スタックを取って、共焦点励起（458 nmの488 nmの514 nmの561 nmの594 nm）であり、ライカレゾナントスキャナ（8000ヘルツ/秒）と組み合わせた2光子のTi-Saの励起（860 nm）を使用し最大で1時間20秒間隔で80程度）。 <ol><li> （ 動画2）同時3色2Pイメージング用のTi-Saが860 OPOの（または1140 nmのmCherryをtdTomatoのための1,130 nmのチューニング）レーザーと同時にnmでチューニングしてください。 </li></ol></li><li> 3Dボリュームと4Dの時間シーケンスの再構築と分析<ol><li> Imaris x64のSOFTWを使用して、バージョン7.6、または代替ソフトウェアパッケージ骨髄および異なる組織内部の蛍光細胞のボリュームレンダリング（3D）データへの生画像のタイル張り·スタックを変換すると、以前に3,4に記載されているように、3D回転ムービーとして書き出すべきである（ 動画1）ステップバイステップの例： <ol><li> Imarisでは、zスタック画像を開きます。選択3Dボリューム視覚化を表示するために「サーパス」。 </li><li> 360°の周りにボリュームを回すために、「ナビゲート」を使用します。 </li><li>アニメーションを作成する「アニメーション」を選択します。選択したビュー、ズーム、ボリュームの回転を追加するために、キーフレームを使用します。ムービーをプレビュー、必要に応じて編集し、目的のムービー形式でファイルを保存します（例：AVI、MOV）。 </li></ol></li><li> 3D細胞とクローン周波数、位置、大きさや分布の定量的評価、さらにプロセスの場合、距離MEASを実行するMATLABアプリケーションを統合Imaris XTモジュールを使用してのzスタック以前3,4に記載のように（距離変換アルゴリズムを使用して）urementsおよびクラスター分析。 Imaris x64のソフトウェアとボリュームレンダリング四次元（4D）ムービーに時間をかけて画像スタックのシーケンスを変換し、自己回帰移動アルゴリズムを用いて3次元的に細胞運動の半自動トラッキングスポットと表面解析を使用しています。 </li><li>次のように細胞のマルチスペクトル分析を実行します。新しいチャネルにImaris XTのチャンネル演算を介してすべての5つのチャネルを追加することによって、マルチカラーラベルスポットを抽出する。全てのスポット（セル）5成分のチャネルのそれぞれの平均輝度蛍光を決定する。個別のセル内の各FP（図2Eグラフ）の相対％ すなわちユニークな「colorprint」を表示するグラフをプロットするためにExcelソフトウェア内の値をエクスポートします。組織ドリフトを設定されたデータを修正して、セル速度と変位時間をかけて、トラックの長さ、パス、および距離を計算。 ExcelのSOFにおける輸出額グラフをプロットするtware。 Adobe PhotoshopのCSS 5ソフトウェアを使用して複合図形を組み立てます。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).</li>
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<li>Weber, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGB+marking+facilitates+multicolor+clonal+cell+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking.</a> Nat Med. 17, 504-509 (2011).</li>
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</ol>

著者らは、競合する金融利益を宣言しません。

私たちは、生きた組織で、体積とダイナミックイメージングを実現するために、タンデム共焦点および2光子顕微鏡で5FPコードLEGOベクトルおよびイメージングマーキング組合せにより発生する大きな多様性を組み合わせて、ここ最近、クローン細胞の追跡のために考案強力な方法論の詳細を説明します。これは5 &quot;個別の&quot; 8ビットのチャネルでの共焦点分光身元を記録することにより、マーキング、FPベースのカラーの使用を拡張した。従って、各セル内のセルリアン、EGFP、金星、tdTomato、mCherryをの相対比は、クローンの子孫を識別するためのユニークな &quot;colorprint」を作成します。 5FPSによる多色標識は、細胞又は高密度組織サンプル内の同じタイプの細胞群のうち流通、連絡先、タイル張りの手配と競争力の相互作用を研究する場合に特に有用であることが示されたより多くの多様性を、ラベルパレットを向上させます。さまざまな組織の固有の構造的特徴の2光子励起と組み合わせて、臓器は、私たちは、固定および物理的切片を必要とせずに、そのネイティブな環境での色とマーククローン細胞を追跡することができます。個別の前駆細胞に由来した娘細胞...

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

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Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

血液細胞の産生、造血と呼ばれるが、造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）の小集団によって維持される。これらの細胞はすべて、自己再生および分化1,2の制御に関与し、骨芽細胞、間質細胞、脂肪組織、及び血管構造からなる複合微小環境ニッチにおける骨髄（BM）内に存在する。無傷のBMは直接観察に伝統的にアクセスできなくなっているように、HSPCとその微小環境との相互作用は、生体内での大部分は未同定のまま。以前は、私たちは共焦点蛍光および反射顕微鏡3を使用して、無傷のBMの3次元構造を可視化する方法論を確立した。私たちは、BM中のEGFP-マークHSPCsの拡大を特徴とするが、単一のFPの使用は、クローンレベルでの再生の分析を排除。ごく最近、私たちは、構成的にFLを発現するレンチウイルス遺伝子オントロジー（LEGO）ベクターを利用しました効率的に細胞4,5をマークするuorescentタンパク質（FPS）。 3または5ベクターとHSPCの共同形質導入は、複数の個別HSPCクローンの追跡を可能にする、組み合わせの色の多様なパレットを生成します。 マークの新しいイメージング技術と組み合わせたHSPCは、照射されたマウスのBM中の個別のHSPCホーミングおよび生着をトレースすることを許可。 LEGOベクターは、骨やその他の明確な可視化を可能にする、（セルリアン、EGFP、金星、tdTomato、およびmCherryをから）3または5異なるのFPにHSPCをマークし、共焦点および2光子顕微鏡によるBM中の時間をかけて彼らの生着に従うために使用されたマトリックス構造、及びそれらの微小環境の成分にHSPCクローンの関係。 HSPCはLEGOベクターで形質導入したC57BL / 6マウスのBMからの系統陰性細胞、のように精製し、そして骨髄アブレーションコンジェニックマウスに尾静脈注射によって再注入された。胸骨骨髄組織を大量に監視することにより、私たちは、初めに発生した骨内膜移植を可視化BMの再生。多様な色のスペクトルを有する細胞クラスターは、骨に近接して、最初に登場し、時間をかけて集中的に進行した。興味深いことに、3週間以上後に骨髄ではなく、血流を介してHSPCsの広範な普及よりも、連続して骨髄中の個別HSPCsから派生造血の広がりを示唆し、巨視的なクローンのクラスタで構成されていた。後半の時点ではあまり色の多様性は、複数のベクターとの長期的な再増殖細胞に形質導入​​することが困難で示唆がありました。 また、HSPCsは、脾臓において、マウスにおける造血を担う臓器をクラスターを形成した。 HPSC由来の個体の細胞は、同様に、胸腺、リンパ節、脾臓、肝臓、肺、心臓、皮膚、骨格筋、脂肪組織、および腎臓において解決することができる。 3D画像は、組織の最小限の摂動を有する細胞の分布を理解するために定性的および定量的に評価することができる。最後に、説明共振スキャニング多光子共焦点タイムラプスイメージングを組み合わせることにより、4Dでのライブの動的試験のdの実現可能性。この方法論は、組織再生および病理学の研究で​​強力なツールを提供し、彼らの無傷の3Dアーキテクチャでスペクトル的にマークされた細胞集団の非侵襲的な高解像度、多次元細胞運命のトレースを可能にします。

<table><tbody><tr><td colspan="4">ウイルスの産生</td></tr><tr><td>LeGO-Cer2</td><td>Addgene</td><td>27338</td><td>セルリアン</td></tr><tr><td>LeGO-G2</td>の発現 <td>Addgene</td><td>25917</td><td>eGFP</td></tr><tr><td>LeGO-V2</td>の発現 <td>Addgene</td><td>27340</td><td>Venus</td></tr><tr><td>LeGO-T2</td>の発現 <td>Addgene</td><td>27342</td><td>tdTomato</td></tr><tr><td>LeGO-C2</td><td>の発現Addgene</td><td>27339</td><td>mCherryリン酸</td></tr><tr><td>カルシウムトランスフェクションキット</td><td></td>の発現 <td>Sigma CAPHOS-1KT</td><td></td></tr><tr><td>組織培養皿</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco, Life Technology</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清熱不活性化</td><td>Sigma</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pen 連鎖球菌グルタミン</td><td>Gibco, Life技術</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離管</td><td>ベックマン・コールター</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>SW28 超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>L60</td><td></td></tr><tr><td>Millex シリンジ駆動フィルター ユナイト (0.22 & マイクロ;m)</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Mouse Cell Collection, Purification, Transduction, and Transplantation</td></tr><tr><td>ACK Lysing buffer</td><td>Quality Biologicals Inc.</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>系統細胞枯渇キット(マウス)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>LSカラム+チューブ</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>Pre-Separation Filters(30 &micro;m)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>造血細胞の培養および増殖のためのStemSpan SFEM無血清培地(500 ml)</td><td>StemCell Technologies Inc.&nbsp;</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>マウスIL-11 CF</td><td>R&Dシステムズ株式会社</td><td>418-ML-025 / CF</td><td>100 & マイクロ;g/mlは1,000倍</td></tr><tr><td>組換えマウスSCF</td><td>RDI部門、フィッツジェラルド・インダストリーズ・インターナショナル&nbsp;</td><td>RDI-2503</td><td>100 & マイクロ;g/ml は 2,000x</td></tr><tr><td>組換えマウス IL-3</td><td>R &Dシステムズ株式会社</td><td>403-ML-050</td><td>20 & マイクロ;g/ml は 2,000x</td></tr><tr><td>FLT-3 Ligand</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-096-480</td><td>100 & micro;g/mlは1,000×</td></tr><tr><td>12ウェルプレート、Costar</td><td>Corning Inc.</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>レトロネクチン</td><td>タカラ バイオ インク</td><td>T100A/B</td><td>50 & マイクロで再懸濁;g / ml</td></tr><tr><td>プロタミン硫酸シ</td><td>グマ</td><td>P-4020</td><td>4 & マイクロ;g/ml is 1,000x</td></tr><tr><td colspan="4">Confocal and Two-photon Microscopy</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro, Mediatech Inc.</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底培養皿 P35G-0-20-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底培養皿 P35G-0-14-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek チャンバーカバーグラス #1 ホウケイ酸カバーガラス; 4 ウェル</td><td>Thermo Scientific</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス 22 mm No 2</td><td>Thomas Scientific</td><td>6662-Q55</td><td></td></tr><tr><td>ライカ TCS SP5 AOBS 5チャンネル 共焦点顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カメレオンビジョンII-TiSaphレーザー範囲 680-1,080 nm</td><td>コヒーレント</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カメレオンコンパクトOPOレーザー範囲 1,030-1,350 nm</td><td>コヒーレント</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA 水浸対物レンズ (WD=2.5 mm)</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA ドライ対物レンズ (WD=0.6 mm)</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA 水浸対物レンズ (WD=0.6 mm)</td><td>ライカ マイクロシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ Imaris ソフトウェア バージョン 7.6</td><td>ビットプレーン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

私たちは、開発し、マウスの骨髄移植実験モデルを用いたin vivoでの造血に勉強する高い空間および時間分解能で、造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）のクローン追跡のための方法論を蛍光マーキングを検証しました。蛍光タンパク質をコードするレンチウイルスベクターを用いてマーキング遺伝子コンビナトリアル（FPS）は、高度な顕微鏡撮影により細胞運命マッピングを可能にした。五つの異なるFPをコードするベクター：セルリアン、EGFP、金星、tdTomato、そしてmCherryをカラーマークされたセルの多様なパレットを作成し、同時にHSPCsを伝達するために使用された。共焦点/ 2光子ハイブリッド顕微鏡を用いて画像化は、同時高解像度一意にマークされた細胞の評価と組織の構造部品に関連してその子孫を可能にします。スペクトル的に符号化されたHSPC由来細胞は、骨髄（BM含むさまざまな無傷の組織に非侵襲的に検出することができる体積が大きい面積にわたって分析明らかにする）、移植後の時間の広範な期間について。 4Dにビデオレートの多光子共焦点タイムラプスイメージングを組み合わせたライブの研究では、定量的にダイナミックな細胞およびクローン追跡の可能性を実証している。

胸骨骨髄時間経過の全体マウント3D共焦点/ 2光子顕微鏡再構成が顕著な特性を有するパターンにおける移植共同5FPSの生着·拡大を明らかにした：クローンは、均一に広い、最初は色のパレットと進歩が付いて、線引きを明確に現われ時間をかけて優先的に主に一つの色のセルが含まれています。共焦点顕微鏡のセットアップ及び胸骨の骨髄における撮像5FPSマーキングHSPCの代表例を図2及びビデオが1及び2に示されている。 無傷の組織の3次元共焦点/ 2光子顕微鏡の再構成を全載色の運命を追跡する可能性が生組織における長期間のための骨髄由来の細胞をマークし実証する。移植後の造血および非造血器官における骨髄由来細胞の代表的な例は、Fiが示されている<html>グレ3。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" s...

造血幹細胞および前駆細胞のマーキングコンビナトリアル5蛍光タンパク質は、再生中に、骨髄の造血アーキテクチャへの洞察を提供し、共焦点および2光子顕微鏡を経由して、生体内のクローン追跡になります。この方法は、移植後の時間の大規模な期間、無傷の組織におけるスペクトル的にコード化されたHSPCs由来細胞の非侵襲的な運命のマッピングが可能になります。

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

本手順の全体的な目的は、新規の共焦点および2光子顕微鏡戦略を用いて、骨髄を含む生体組織内の蛍光標識された造血クローンを追跡することである。このため、マウスの造血前駆細胞および幹細胞を単離し、5種類の蛍光タンパク質（Ian、EGFP、Venus、TD tomato、m cherry）をコードするレンチウイルス遺伝子オントロジーまたはLegoベクターを用いて共導入する。導入された細胞を骨髄破壊したレシピエントマウスに移植し、最大120日間の経過後、レシピエントマウスから骨髄および臓器を採取し、共焦点顕微鏡と2光子顕微鏡を組み合わせて解析を行う。得られた画像は3Dで再構成され、蛍光標識された移植クローンおよび細胞の経時的な位置追跡が行われます。これにより、造血過程におけるクローン進化や、骨髄由来細胞の他臓器における運命の解析が容易になります。組織の物理的な切片作成に対する本手法の主な利点は、共焦点顕微鏡による光学切片化を用いた高解像度イメージングの利点と、2光子顕微鏡による構造成分の可視化を組み合わせられる点にあります。この手法は、初期生着からの骨髄再生における造血の空間的および時間的なクローン解析や、時間の経過に伴う拡大クローンの地理的な維持など、血液学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。また、非常に大量の無傷で高密度な組織を検査することが可能です。例えば、胸骨の骨髄腔における色標識されたクローンを可視化するために、約3000枚の画像が計算によって再構成されました。この手法は、正常および摂動を受けた造血におけるクローン構造への洞察を提供できるだけでなく、臓器再生、免疫応答、または腫瘍の転移パターンの研究にも応用可能です。本手順では、5つの蛍光タンパク質（EGFP、Venus、tdTomato、およびmCherry）をコードするレンチウイルス遺伝子オントロジー（Lego）ベクターを使用します。各蛍光タンパク質は、強力な構成的Spleen Focus Forming Virus（SFFV）プロモーターから発現します。蛍光タンパク質をコードするLegoベクターを作製し、ウイルス粒子をタイターした後、ドナーマウスを犠牲にし、上腕骨、大腿骨、および脛骨を解剖して、前肢および後肢から骨髄を採取します。メスを使用して、骨からすべての筋肉靭帯および余分な組織を完全に除去します。次に、各骨の末端を関節のできるだけ近くで切断します。I 10 mediumを入れたシリンジに27ゲージの針を装着し、骨髄を50 mLコニカル遠心チューブ内に洗い出します。その後、500 G、4 °Cで遠心分離し、細胞をペレット化します。赤血球を溶血させるために上清を廃棄した後、50 mLのCKバッファーを加え、前と同様に遠心分離します。その後、上清を廃棄し、2回目の上清を廃棄した後にもう一度この操作を繰り返します。細胞を10 mLのI 10培地で再懸濁してください。次に、付属文書に詳述されている改変キットプロトコルに従い、Max lineage depletion kitを用いてリネージ陰性前駆細胞を精製します。リネージ陰性細胞を精製した後、マウスIL-3、マウスIL-11、ヒトFlt3リガンド、およびマウス幹細胞因子を添加したStemSpan培地を用い、5×10⁵ cells/mLの密度でT75フラスコに播種し、37°C、5% CO2で48時間培養します。2日後、セルスクレーパーを用いて細胞を再懸濁し、12ウェルプレートに1〜4×10⁵ cells/wellの密度で分注します。サイトカインを含むStemSpan培地と4 µg/mLのプロタミン硫酸を加え、各ベクターをMOI 6〜7で細胞に導入します。各ウェルの全量を1 mLにするため、各蛍光タンパク質について単色コントロールを必ず準備してください。24時間後、スクレイパーを用いて細胞を再懸濁し、5 mL遠心チューブに移します。その後、遠心分離を行い、サイトカインを含まないStemSpan培地で再懸濁します。再度遠心分離を行い、注入用、または共焦点顕微鏡観察もしくはフローサイトメトリー用に、細胞をサイトカインを含まないStemSpan培地100 µLで再懸濁します。これらをサイトカインを含む新鮮な培地が入った12ウェルプレートに移し、さらに96時間培養します。骨髄移植の準備として、照射済みのレシピエントマウスを保温ライトの下にあるケージに入れ、マウスを温めます。マウス1匹あたり100 µLのStemSpanに1〜4 × 10⁵個のリネージ陰性細胞を懸濁し、注入用のシリンジを準備します。マウス1匹につき1本の注射器を用意します。尾静脈が拡張していれば、注射可能な状態です。注射するマウスをマウス拘束具に入れ、70% ethanolを浸したパッドで尾部を消毒します。このステップにより、尾静脈の視認性が向上します。次に、細胞を尾静脈に注入します。移植後120日までの様々な時点で、同一の導入済みドナー骨髄細胞集団を動物のコホート全体に移植してください。切片を作成せずに、そのままの状態でイメージングを行うため、組織および器官を回収します。タイムラプスイメージングを行う場合は、個々の器官を35 mmのNo. 0カバーガラス底培養皿に入れ、50 〜 100 µLの冷PBSで満たします。臓器を20 millimolar HEPESを含むDMEM 10%FBSに浸し、37 °Cで保持して直ちに撮影します。ここでの顕微鏡観察には、マルチラインアルゴンダイオード561 nm、ヘリウムネオン594 nm、およびヘリウムネオン633 nmの可視レーザーを備えた倒立型Leica SP5 5チャンネル共焦点・マルチフォトシステムを使用します。単一のLego導入サンプルを1つ顕微鏡ステージに載せ、焦点を合わせます。全光スペクトルにわたって5 nmの間隔でλイメージスタックを収集します。次に、ソフトウェアを使用して画像内の関心領域を選択し、参照スペクトルのヒストグラムを表示します。このデータを保存してください。次に、実験で使用する各蛍光タンパク質についてこのプロセスを繰り返します。続いて、個々の蛍光タンパク質から収集したスペクトルを使用して、チャンネルモードの帯域幅を設定します。各チャンネルについて、黒いスライダーをクリックし、使用する帯域幅を入力してください。選択する帯域幅は、各蛍光タンパク質の励起スペクトルのピーク領域を包含しつつ、蛍光チャネル間に重複がないようにする必要があります。各検出器のゲインとオフセットを設定し、試料出力のダイナミックレンジが検出可能なレベルであり、蛍光タンパク質間で同程度で、かつ飽和していない状態にします。例えば、M cherryタンパク質はEGFPの約半分の明るさであるため、両者が同程度のダイナミックレンジとなるようにゲインとオフセットを調整する必要があります。最後に、チャンネルモードで、5つの全チャンネルを用いて各単色コントロールサンプルの画像を撮影し、各蛍光タンパク質が対応するチャンネルでのみ観察され、他のチャンネルでは消失していることを確認します。全チャンネルのスペクトルが検証されたら、設定を保存します。これらの設定は、同じ蛍光タンパク質とサンプル組織を使用する今後の実験でインポートして利用することが可能です。ここでは、メスとピンセットを用いて胸骨を正中面で切断し、胸骨骨髄を用いた共焦点顕微鏡と二光子顕微鏡の併用法を実演します。次に、2つの胸骨窩の接合部で横断的に切断します。切断した骨を、50〜100 µLの冷PBSを含む35 mmのNo.0カバーガラス培養皿に切断面を下にして配置します。撮像は切断面を通して行います。解剖顕微鏡で骨の位置を確認します。試料を顕微鏡ステージ上に配置します。次に、イメージングソフトウェアを設定し、2光子励起信号と第二高調波発生信号を順次キャプチャします。次に、5色共焦点励起を行います。Zスタック収集領域の境界を、150～300 µmの範囲で5 µmステップサイズに設定します。タイル関数を使用して、XY方向に約2.5×1.2 mm²の胸骨窩全体を含むステッチ済みボリュームをソフトウェアで自動的に生成させます。4Dタイムラプスイメージングのため、全5チャンネルでのX、Y、Z画像の順次収集に加え、骨および線維性コラーゲンからの第2高調波発生信号を用いた2光子顕微鏡観察を開始します。新鮮に摘出し、切断していない膝窩リンパ節、脾臓、肺、または頭蓋骨のサンプルを、10% FBSおよび20 mM HEPESを含むDMEM 50〜100 µLを入れた35 mmのNo. 0カバーガラス培養皿に、37 °Cで配置します。サンプルを加熱顕微鏡ステージ上に配置します。次に、ソフトウェアでキャプチャパラメータを切り替え、860 nanometersの2光子チタンサファイア励起と、共焦点励起および8, 000 hertz per secondのLeicaレゾナンススキャナーを併用するように設定します。最大1時間、22秒間隔で80 micronのZスタックを撮影し、同時に3色の2光子イメージングを行うには、860 nanometersに調整したチタンサファイアと、TD tomato用の1, 130 nanometersまたはM cherry用の1, 140 nanometersに調整したOPOレーザーを同時に使用するようにソフトウェアに指示します。最後にキャプチャを開始し、4つのD画像を収集します。前と同様に、すべての画像の収集が完了したら、Amer 64 bit版または同等のソフトウェアを使用して、3Dおよび4Dの再構築と解析を行います。Zack画像を開き、surpassを選択して3Dボリュームビジュアライザーを表示させます。次に、「Navigate」を使用してボリュームを360度回転させます。続いて、「animation」を選択します。キーフレームを使用して、選択したビュー、ズーム、およびボリュームの回転を追加します。動画をプレビューし、必要に応じて編集します。最後に、蛍光標識した造血幹細胞および前駆細胞のクローン履歴を追跡するため、希望の動画形式でファイルを保存します。5種類の異なるLegoベクターを共導入したドナー細胞をレシピエントマウスに移植し、本ビデオで説明した通りに胸骨骨髄の撮像および解析を行いました。移植から4日後、白で示された骨端の至近距離に、多彩な色で標識された細胞クラスターが観察されました。31日目までに、特有の緑黄色をした巨大なクローンが、マージ画像およびシングルチャンネル画像に示されている通り、窩全体を占めるまで拡大しました。FPSコンテンツ解析により、2つのFPSバリアントであるEGFPとVenusによって均一に標識されていることが実証されました。この3D再構成ビデオでは、胸骨内に封入された標識クローンの空間的構造を示します。この画像は、移植から120日後の膝窩リンパ節における骨髄由来細胞の例を示しています。散在する細胞の多くは黄色と赤色で標識されており、心外膜側から見た心臓において、白色で示されるコラーゲン繊維に末梢側で囲まれています。780ナノメートルの二光子自家蛍光により白く可視化された心筋細胞の間に、多数の個別の細胞が点在しているのが見えます。この手法を習得すれば、適切に実施することで数日で完了させることができます。開発後、この手法は器官の再生と発生分野の研究者に道を開き、多色ラベリングおよび共焦点・二光子イメージングを通じて、クローン的に複雑な細胞および構造要素の時空間的な配置を探索するさらなる生物学的なアプローチを可能にしました。このビデオを視聴することで、生体器官内における造血幹細胞および前駆細胞のクローン標識を追跡するための、蛍光標識法の構築方法について十分に理解することができます。

in-vivo-clonal-tracking-hematopoietic-stem-progenitor-cells-marked

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶ造血幹細胞と前駆細胞の生体内クローン追跡法。5種類の蛍光タンパク質を用いた共焦点・多光子顕微鏡により、骨髄再生時の細胞運命と空間的クローン進化を可視化する手法です。

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