共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

造血幹細胞および前駆細胞のマーキングコンビナトリアル5蛍光タンパク質は、再生中に、骨髄の造血アーキテクチャへの洞察を提供し、共焦点および2光子顕微鏡を経由して、生体内のクローン追跡になります。この方法は、移植後の時間の大規模な期間、無傷の組織におけるスペクトル的にコード化されたHSPCs由来細胞の非侵襲的な運命のマッピングが可能になります。

この手順の全体的な目標は、新しい共焦点顕微鏡と 2 光子顕微鏡法を使用して、骨髄を含む生体組織中の蛍光標識造血クローンを追跡することです。これを行うには、murn造血前駆細胞および幹細胞を単離し、レンチウイルス遺伝子オントロジーまたは5つの蛍光タンパク質(Ian、EGFP、Venus、TDトマト、およびmチェリー)をコードするLegoベクターと共形質導入します。次いで、形質導入細胞を骨髄切除レシピエントマウスに移植し、最大120日間の期間後に、レシピエントマウスから骨髄および臓器を採取し、共焦点顕微鏡と2光子顕微鏡を組み合わせて行う。

得られた画像は3Dで再構築され、蛍光標識が付けられた移植されたクローンと細胞の位置を経時的に追跡します。これにより、造血中のクローンの進化や他の臓器の骨髄由来細胞の運命の研究が容易になります。この技術が組織の物理的切片化と比較した場合の主な利点は、高解像度イメージングの利点と、共焦点顕微鏡による光学切片化、および顕微鏡による構造コンポーネントの可視化を組み合わせたことです。

この方法は、血液学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます、例えば、骨髄再生中の造血の特別かつ時間的なクローン分析のような、早期の生着から、時間の経過とともに拡大するクローンの地理的な維持を伴う、非常に大量の無傷の密な組織を調べることができます。たとえば、約3000枚の画像が計算で再構築され、胸骨ファウでカラーマークされたクローンが視覚化されました。この方法は、正常造血および攪乱造血におけるクローン構造に関する洞察を提供しますが、臓器再生、免疫応答、または腫瘍転移パターンの研究にも適用できます。

この手順では、レンチウイルス遺伝子オントロジーまたはレゴベクターが、Ian EGFP、Venus、TD tomato、M Cherryの5つの蛍光タンパク質をコードしています。各蛍光タンパク質は、強力な構成的脾臓焦点形成ウイルスまたはSFFVプロモーターから発現します。蛍光タンパク質をコードするレゴベクターを作製し、ウイルス粒子を滴定した後、ハム眼大腿骨と脛骨を解剖することにより、犠牲ドナーマウスの前肢と後肢から骨髄を採取します。

メスを使用して、骨からすべての筋靭帯と余分な組織を完全に取り除きます。次に、各ボーンの端をできるだけ関節に近づけてカットします。I 10培地が入ったシリンジに27ゲージの針を使用して、骨髄を500 G、摂氏4度の50ミリリットルの円錐形遠心チューブ遠心分離機に洗い流し、細胞をペレット化します。

上清を廃棄して赤血球を溶解した後、前回と同様にCK緩衝遠心分離機を50ミリリットル加え、上清を廃棄し、2番目の上清を廃棄した後に繰り返します。細胞を10ミリリットルのI 10培地に再懸濁します。次に、max lineage depletion kitを使用して、添付の文書に詳述されている修正キットプロトコルに従って、系統陰性前駆細胞を精製します。

系統陰性細胞が精製されたら、マウスIL 3匹マウスIL 11、ヒトFL3リガンドおよびマウス幹細胞因子を37°Cで48時間インキュベートした幹スパン培地で、1ミリリットルあたり5倍から5細胞の密度でT 75フラスコにプレートします。2日後、セルスクレーパーを使用して細胞を再懸濁し、12のウェルごとに10の1〜4倍を5つの細胞に移します。ウェルプレートは、サイトカインと細胞に1ミリリットルあたり4マイクログラムの硫酸プロタミンを含むステムスパン培地にそれぞれ6〜7のMOIでベクターを添加します。

各ウェルの総容量を1ミリリットルにするには、各蛍光タンパク質に対して単一のカラーコントロールを必ず調製してください。24時間後、スクレーパーを使用して細胞を再懸濁し、5ミリリットルの遠心分離チューブに移します。その後、サイトカインを含まないステムスパン培地で遠心分離し、再度遠心分離して、サイトカインを含まない100マイクロリットルのステムスパン培地に細胞を再懸濁します。

それらをサイトカインを含む新鮮な培地を含む12ウェルプレートに移し、さらに96時間培養します。骨髄移植の準備として、放射線を照射したレシピエントマウスをケージに入れ、マウスが温めている間に温めた光の下に置きます。マウス100マイクロリットルの幹スパン中に10〜5系統の陰性細胞を1〜4回1回注射用の注射器を調製します。

マウスごとに1つのシリンジを準備します。尾静脈が拡張すると、マウスを注入する準備が整います。注入するマウスをマウス拘束具に置き、70%エタノールを染み込ませたパッドで尾部を消毒します。

このステップにより、尾静脈の視覚化も容易になります。次に、細胞を尾静脈に注入します。形質導入されたドナー骨髄細胞の同じ集団を持つ動物のコホート全体を、移植後120日までのさまざまな時期に移植します。

切片化せずに無傷のイメージングのために組織と臓器を回収します。個々の臓器を35ミリメートルのゼロに配置します。ガラス培養皿を50〜100マイクロリットルの冷たいPBSで覆い、タイムラプスイメージングを行います。

臓器を摂氏37度の20ミリモルヒープを含むDMEM 10%FBSに入れ、すぐに画像化します。ここでは、マルチラインアルゴンダイオード561ナノメートル、ヘリウムネオン594ナノメートル、ヘリウムネオン633ナノメートル可視レーザーを搭載した倒立ライカSP 5 5チャネル共焦点および多光子システムを使用して顕微鏡検査が行われます。レゴ形質導入した1つのサンプルの1つを顕微鏡ステージに置き、焦点を合わせます。

ラムダ画像スタックを、全光スペクトルにわたる5ナノメートルの帯域幅間隔で収集します。次に、ソフトウェアを使用して画像内の関心領域を選択し、参照スペクトルのヒストグラムを表示します。このデータを保存します。

次に、実験中の各蛍光タンパク質についてこのプロセスを繰り返します。次に、個々の蛍光タンパク質から収集したスペクトルを使用して、チャネルモードの帯域幅を設定します。各チャンネルでこれを行うには、黒いスライダーをクリックして、使用する帯域幅を挿入します。

選択する帯域幅は、各蛍光タンパク質励起スペクトルのピーク領域を包含し、蛍光チャネル間に重複がないようにする必要があります。サンプル出力のダイナミックレンジが検出可能なレベルにあり、蛍光タンパク質間で類似し、飽和がないレベルになるように、各検出器のゲインとオフセットを設定します。たとえば、M cherry タンパク質は EGFP の約半分の明るさであるため、ゲインとオフセットを調整して、両方で同様のダイナミック レンジを実現する必要があります。

最後に、チャネルモードで、5つのチャネルすべてで各単一カラーコントロールサンプルの画像をキャプチャし、各蛍光タンパク質が対応するチャネルでのみ見え、残りのチャネルには存在しないことを確認します。すべてのチャンネルのスペクトルが検証されたら、設定を保存します。これらはインポートして、同じ蛍光タンパク質とサンプル組織を使用する将来の実験で使用できます。

ここでは、共焦点顕微鏡と2光子顕微鏡の組み合わせが、メスとピンセットを使用して胸骨骨髄を使用して、矢状面に沿って胸骨を切片にして示しています。次に、2つの胸骨の化石の間の接合部で横方向の切り込みを入れます。35ミリメートルの番号ゼロカバーガラス培養皿に下向きにカットされた骨を置き、50〜100マイクロリットルの冷たいPBSイメージングが切断面を通じて行われます。

解剖顕微鏡で骨の位置を確認します。サンプルを顕微鏡ステージに置きます。次に、イメージングソフトウェアが、2番目の高調波生成信号で2つの光子を順次キャプチャするように設定します。

次に、5色共焦点励起。ザックコレクションエリアの境界を、150〜300ミクロンを超える5ミクロンのステップサイズで設定します。タイル機能を使用して、XY方向に約2.5 x 1.2平方ミリメートルの胸骨フォッセ全体を構成するステッチボリュームを自動的に生成するようにソフトウェアに指示します。

キャプチャを開始して、5つのチャネルすべてでX、Y、Zの画像を順次収集し、さらに骨と原線維性コラーゲンから2番目の高調波生成信号を使用して2つの光子顕微鏡を収集し、4つのDタイムラプスイメージングを実現します。切除したばかりの、切開されていない膝窩リンパ節、脾臓、肺、または頭蓋骨のサンプルを35ミリメートルのゼロに配置します。50〜100マイクロリットルのDMEMでガラス培養皿を10%FBSと摂氏37度の20ミリモルヒープで覆います。

サンプルを加熱された顕微鏡ステージに置きます。次に、ソフトウェアでキャプチャパラメータを切り替えて、860ナノメートルの2光子チタンサファイア励起と共焦点励起、および毎秒8、000ヘルツのライカ共振スキャナーを組み合わせて使用します。80ミクロンのZスタックを22時間間隔で最大1時間撮影し、3色2光子イメージングを同時に行うと、TDトマトの場合は1,130ナノメートルに調整されたOPOレーザーと同時に860ナノメートルに調整されたチタンサファイアを使用するようにソフトウェアに指示しますまたはMチェリーの場合は1,140ナノメートル。

最後に、キャプチャを開始して 4 つの D イメージを収集します。以前と同様に、すべての画像が収集されたら、ソフトウェア内のAmer 64ビットバージョンまたは同様のソフトウェアを使用して、3Dおよび4Dの再構成と分析を実行します。Zack画像を開き、surpassを選択して3Dボリュームビジュアライザーを表示します。

次に、ナビゲートを使用してボリュームを360度回転させます。次に、アニメーションを選択します。キーフレームを使用して、選択したビュー、ズーム、ボリュームの回転を追加します。

ムービーをプレビューし、必要に応じて編集します。最後に、ファイルを目的の動画形式で保存し、蛍光標識された造血幹細胞および前駆細胞のクローン履歴を追跡します。5種類のレゴベクターで形質導入したドナー細胞をレシピエントマウスに移植し、このビデオで説明しているように胸骨骨髄を画像化および分析しました。

移植後4日目には、さまざまな色でマークされた細胞のクラスターが、白で示されている骨の端のすぐ近くに見えました。31日目までに、ユニークな緑色、黄色の大きなクローンが、マージされた画像と単一チャネルの画像に示されているように、フォッシー全体を占めるように拡大しました。FPS含有量解析では、EGFPとVenusの2つのFPS分散による均質なマーキングが実証されました。

この3D再構成ビデオは、胸骨に包まれたマークされたクローンの空間構造を示しています。この画像は、移植後120日目の膝窩リンパ節の骨髄由来細胞の例を示しています。散在する細胞は、ほとんどが黄色と赤色でマークされており、心外膜側から見た心臓では白で示されるコラーゲン線維に周辺的に囲まれています。

白で示された心筋細胞の間には、多数の個々の細胞が点在して見え、780ナノメートルでそれらの2光子自家蛍光によって視覚化されると習得されます。この手法は、開発後に適切に実行すれば、数日で実行できます。この技術は、臓器の再生と発生の分野の研究者、そしてより多くの生物学の研究者が、マルチカラーラベリングと共焦点および2光子イメージングを通じて、クローン的に複雑な細胞および構造要素の空間的時間的配置を探求する道を開きました。

このビデオを見れば、生体臓器の造血幹細胞および前駆細胞のクローン性マーキングを追跡するための蛍光標識法の開発方法について十分に理解できるはずです。