Name: 代謝率の測定にショウジョウバエ呼吸計測を使用した (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 31 s
Description: 学ぶショウジョウバエの呼吸計測法による代謝率測定。D. melanogasterを用いた簡便な実験装置でCO2産生量を測定し、実験群と対照群の相対的な代謝率を比較する手法を解説します。

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我々は我々の研究の資金調達のためのマックス·プランク協会に感謝したいと思います。

呼吸計の1。準備<ol><li> 50μlのキャピラリーマイクロピペットの挿入を可能にするためにカミソリの刃で千μlのピペットチップをカットし、できるだけまっすぐピペットチップを取得しよう。 </li><li>ピペットに泡の部分を置き、ピペットチップでそれを押し下げます。 </li><li> CO 2吸収剤を少量添加すると、発泡体の二枚で、それが含まれています。 </li><li>マイクロピペットをピペットチップに挿入されている場所で、接着剤を適用します。 </li><li>接着剤を乾燥させるために、一晩呼吸のままにしておきます。 呼吸計の概略図を図1Aに示されている。 </li></ol>測定所の2。準備<ol><li>目に見えるカラー化になります比でエオシンで水を混合することにより、チャンバ溶液を調製する。 </li><li>チャンバー内にエオシン/水溶液を注ぐ。 </li><li>センチメートルスケールで、チャンバの側面の1にラベルを付けます。 </li></ol><ol><li>マーカーで、個々の呼吸計にラベルを付けます。 </li><li> 2を COと各呼吸計内部の希望する遺伝子型の3-5ハエを配置する別の方法を使用してハエを麻酔。 </li><li>粘土のパテを使用して、上部にしっかりと呼吸計を密封する。 </li><li>ハエは約15分間麻酔から回復することができます。 </li><li>大気中のコントロールとして使用される、ハエなしで1呼吸を準備します。 </li></ol> 4。実験を行う<ol><li>チャンバーの上部に上下に開いて1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブホルダーを取り付けることにより、チャンバ内の呼吸計を掛ける。 </li><li>ダウン先端が着色した溶液に浸すことを可能チャンバ内へのマイクロピペットチップで呼吸計を挿入します。 </li><li>温度および圧力fluctより強い分離を提供する蓋カバーとチャンバーとの間にワセリンを追加uations。 </li><li>ふたを閉め、システムが15分間平衡化することができます。 </li><li> （ 図1Bに示す例を参照）、各マイクロピペット内の液体のレベルが表示されているので、スケールがあることを確認して、チャンバの写真を撮る。 </li><li> 1〜2時間後、別の写真を撮る。 </li><li>実験が終了すると、呼吸計からハエを削除し、必要に応じて、重さや、さらに必要に応じてバイアルに戻ってそれらを転送します。 </li></ol>結果5。分析<ol><li>オープンImageJソフトウェア11を使用して画像を取得しました。 </li><li>各写真にスケールを使用して、ソフトウェアでピクセルスケーリングを設定します。 </li><li>液体は初め（D1）で撮影された画像内の決定された基準点から移動した距離（ΔD）と実験終了（D2）を測定します。概略的な例を図1Cに示されている。 </li><li>式で（μL/ HR /飛ぶ）生成されるCO 2の量を計算します。 </li></ol><img alt="図1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51681/51681eq1.jpg" />センチメートルでマイクロピペット管のRは=半径 液体はセンチメートル単位で測定された試験試料のマイクロピペットで上に移動したΔD=距離 液体が（ハエなし）陰性対照試料のマイクロピペット中に移動した距離=Δcを 使用ハエのN =数 H =時間

<ol><li>Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+%26%2334%3Brate+of+living%26%2334%3B+model%3A+further+evidence+that+longevity+and+metabolic+rate+are+not+inversely+correlated+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Testing the &#34;rate of living&#34; model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster.</a> J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).</li>
<li>Ross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-specific+decrease+in+aerobic+efficiency+associated+with+increase+in+oxygen+free+radical+production+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 46, 1477-1480 (2000).</li>
<li>van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+contribution%3A+long-lived+Drosophila+melanogaster.+lines+exhibit+normal+metabolic+rates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selected contribution: long-lived Drosophila melanogaster. lines exhibit normal metabolic rates.</a> J Appl Physiol. 95, 2605-2613 (2003).</li>
<li>Hulbert, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rate+is+not+reduced+by+dietary-restriction+or+by+lowered+insulin%2FIGF-1+signalling+and+is+not+correlated+with+individual+lifespan+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Experimental Gerontology. 39, 1137-1143 (2004).</li>
<li>Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+modulates+metabolic+rate+and+temperature+sensitivity+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dopamine modulates metabolic rate and temperature sensitivity in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Takeuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+temperature+preferences+and+energy+homeostasis+in+dystroglycan+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Changes in temperature preferences and energy homeostasis in dystroglycan mutants.</a> Science. 323, 1740-1743 (2009).</li>
<li>Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Magliarelli Hde, F., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+muscular+dystrophy%3A+a+genetic+screen+for+dystroglycan+and+dystrophin+interactors+in+Drosophila.+identifies+cellular+stress+response+components%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Stress and muscular dystrophy: a genetic screen for dystroglycan and dystrophin interactors in Drosophila. identifies cellular stress response components.</a> Developmental Biology. 352, 228-242 (2011).</li>
<li>Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Wiek, R., Gopfert, M. C., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperthermic+seizures+and+aberrant+cellular+homeostasis+in+Drosophila+dystrophic.+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Hyperthermic seizures and aberrant cellular homeostasis in Drosophila dystrophic. muscles.</a> Scientific Reports. 1, 47 (2011).</li>
<li>Khazaeli, A. A., Van Voorhies, W., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+and+metabolism+in+Drosophila+melanogaster%3A+genetic+correlations+between+life+span+and+age-specific+metabolic+rate+in+populations+artificially+selected+for+long+life%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Longevity and metabolism in Drosophila melanogaster: genetic correlations between life span and age-specific metabolic rate in populations artificially selected for long life.</a> Genetics. 169, 231-242 (2005).</li>
<li>Elia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+equivalents+of+CO2+and+their+importance+in+assessing+energy+expenditure+when+using+tracer+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Energy equivalents of CO2 and their importance in assessing energy expenditure when using tracer techniques.</a> The American Journal of Physiology. 260, (1991).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Bharucha, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epicurean+fly%3A+using+Drosophila+melanogaster.+to+study+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">The epicurean fly: using Drosophila melanogaster. to study metabolism.</a> Pediatric Research. 65, 132-137 (2009).</li>
<li>Rajan, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+flies+and+men%3A+insights+on+organismal+metabolism+from+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies.</a> BMC Biology. 11, 38 (2013).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

このプロトコルでは、ハエにおけるCO 2産生を測定するための安価で信頼性の高い方法を記載している。我々は、この実験が容易であることが見出さ行うことが迅速かつ他の研究1,6,9と一致して再現性のあるデータを生成する。ここで概説したプロトコルは、簡単に任意の研究室の予算や利用可能な材料に合わせて変更することができます。各個々の呼吸の構成であれば、チャンバは、気密のままであるように適合させることができる。しかし、より長い、より薄いマイクロピペットは短いものより高い精度を提供します。外側チャンバーの使用は、長い実験を侵害する有意な周囲温度および圧力の変化がないように、任意とすることができる。これは、陰性対照および生物学的試料の測定値内の大きな変動性の分析によって決定することができる。また、CO 2吸収剤は、それがfの毒性でないような任意の種々のものであってもよい嘘（ 例えば 、水酸化カリウム）。これは、技術が正常に動作していることを確認するための陰性対照を有することが最も重要である。最も一般的な問題は、完全に密閉されないように呼吸用です。この場合、その後の測定は...

生化学クレブス回路は、CO 2を生成する炭水化物、脂肪、およびタンパク質由来の酢酸酸化によってATPを生成します。 ショウジョウバエでは、O 2入力は直接CO 2の出力と相関し、代謝1のレベルを反映している。これにより、CO 2の出力の測定は、正常老化と代謝2-5に関連研究において使用されている。ここに私たちの研究室では、任意の特別な装置を必要とせずに、最大18サンプル中のCO 2産生を測定することができるように、あらかじめ設計された実験装置を変更しました。その他、我々は以前に筋ジストロフィー関連タンパク質、ジストログリカン（DG）6-8が不足しているハエの代謝率の差を表示するには、このメソッドを使用している。 O酸化的代謝に用いられる2は、呼吸廃棄物として排出されるCO 2に変換される。建設手作りの呼吸計が消費されたTiON O 2の割合の決定を可能にすることが記載されている。ハエを効率的に気相からそれを排除し、CO 2排出された吸収する物質を密閉容器内に配置される。ガス容積（減圧）の変化は、閉鎖呼吸計に取り付けられたガラス毛細管内の流体の変位によって測定される。 他のものよりもこの技術の主な利点はコストです。これまでの研究では、ガス分析と技術的に高度な呼吸計測システム1,9を使用して、ショウジョウバエによるCO 2産生を測定した。より複雑な機器にもかかわらず、ここで説明する方法の感度が報告された値（ 表1）と同様である。さらに、いくつかの他のグループは、 ショウジョウバエ 4-6の相対的な代謝率を決定するために、この技術のバリエーションを使用している。したがって、このアッセイはreliabを生成するために使用することができるル、任意の実験室で設定でき、教育の目的に使用することができる特殊な機器の購入なしに、ショウジョウバエの代謝に関連する再現性のあるデータ。 一般に、生物の代謝を決定するための技術が受け入れを製造CO 2を測定することで、O 2を消費し、または両方3,4,9。しかし、それは、O 2 1当量のCO 2 1当量を生成すると仮定することができ、生成されたCO 2の正確な比は、10を利用代謝基質に依存する。従って、正確にエネルギ単位での代謝速度を決定するためには、O 2消費およびCO 2が生成さの両方を測定する必要がある。このため、ここで説明する方法は、動物ではなく絶対値とCO 2生成の違いを比較するに特に関連のある。私たちの技術は、ティムの期間にわたって複数の動物のCO 2の生産を統合したがって、E（1〜2時間）とは、動物の活動の平均値を返します。実験動物は、測定対照動物よりも活性であることを信じる理由がある場合には異なるレベルの活性を反映し、必ずしも代謝でした。

<table><tbody><tr><td>BlauBrand IntraMark 50 & マイクロ;l マイクロピペット</td><td>VWR</td><td>612-1413</td><td></td></tr><tr><td>ソーダライム</td><td>和光</td><td>CDN6847</td><td></td></tr><tr><td>エオシン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>031M4359</td><td>液体の目に見える着色を作り出すことができる任意の染料を使用することができます</td></tr><tr><td>薄層クロマトーガフィー(TLC) 現像室</td><td>VWR</td><td>21432-761</td><td>蓋で閉じることができる任意の透明なガラスチャンバー</td></tr><tr><td>麻酔器、Lull-A-Flyキット</td><td>Flinn</td><td>FB1438</td><td></td></tr><tr><td>パワージェル接着剤</td><td>プレット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml ピペットチップ</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>泡、</td><td>任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plaesticine、パテ</td><td>、任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>、任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

代謝率の測定に<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;呼吸計測を使用した

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

代謝障害は、人の健康に影響を与え、頻繁に問題となっている。そのため、代謝を調節するメカニズムを理解することは非常に重要な科学的な課題である。ヒトでの多くの疾患の原因遺伝子は、 ショウジョウバエの異なる障害の発症に関与するシグナル伝達経路を研究するための良いモデル作り、フライホモログを持っている。さらに、 ショウジョウバエの扱いやすには、代謝を調節することができる新たな治療標的を同定するのを助けるために遺伝子スクリーニングを簡素化します。このようなスクリーンを行うために、ハエの代謝状態の変化を同定するための簡単​​かつ迅速な方法が必要である。一般に、二酸化炭素生成は基質酸化及び代謝状態に関する情報を提供するエネルギー消費量の良好な指標である。このプロトコルでは、ハエからのCO 2の出力を測定するための簡単な方法をご紹介します。この技術は、潜在的に代謝速度に影響を与える遺伝的摂動の識別を助けることができる。

メソッドが敏感であることを示すために、我々は、野生型（ オレゴンR）からのCO 2の生産は、男性は18、25、および29℃で飛んで測定され、DGと変異体を飛ぶ。ハエは、25℃で昇温し、測定前に5日間実験温度にシフトした。この外温性種について予想されるように、CO 2の量は、温度（ 図2）に増加した産生した。我々は過去に、砂糖を含まない食事は、野生型の代謝率を低下させ、 危険物の変異体は、7を飛ぶことが示されている。 Dgはの損失が増加し、代謝レベル（ 図2）をもたらす。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51681/51681fig1highres.jpg" width="500" /> 図1...

代謝障害はヒトにおいて最も一般的な疾患の1つである。遺伝的に扱いやすいモデル生物D.キイロは、代謝を調節する新規遺伝子を同定するために使用することができる。本稿では、そのCO 2産生を測定することにより、ハエに代謝率を研究することができ、比較的簡単な方法を説明します。

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

この手順の目的は、二酸化炭素の発生量を測定することで、ショウジョウバエの相対的な代謝率を決定することです。まず、ショウジョウバエを特別に準備した呼吸バロメーター（respir barometers）に入れます。次に、ショウジョウバエが入った呼吸バロメーターをクロマトグラフィーチャンバーに挿入し、色付きの水溶液に接触させます。時間の経過とともに、ガス環境の前後の二酸化炭素が除去されることで圧力が低下し、液体が呼吸計へと移動します。実験の画像を用いて、呼吸計キャピラリーの寸法に基づき、生成された二酸化炭素量を算出します。最終的に、このアッセイで得られたデータにより、実験群と対照群のショウジョウバエの間で相対的な代謝率を比較することが可能になります。まず、1000 µL ピペットチップをカミソリでできるだけ直線的に切断し、マイクロピペットをその 1000 µL ピペットチップに挿入します。次に、フォームの破片をピペットの中に入れ、押し込みます。その後、少量のソーダライムを加え、2つ目のフォームの破片で固定します。マイクロピペットをピペットチップに挿入した箇所に接着剤を塗布し、一晩乾燥させます。水とエオシンを1:5の比率で混合してチャンバー溶液を調製します。これにより、目視で確認できる着色が生じます。次に、このエオシン水溶液をチャンバーに注入します。次に、チャンバーの垂直側にセンチメートル目盛りを、水平側に呼吸計のラベルを記入します。呼吸計をそれぞれマーカーで個別にラベル付けして準備します。複数のジェノタイプを分析する場合は、呼吸計の番号と対応するジェノタイプを必ず記録しておいてください。次に、あらかじめ冷却した金属プレートを用いてハエを不動化し、目的の遺伝子型のハエを3〜5匹入れます。各呼吸計の呼吸気圧計の上部をプラスチシンパテでしっかりと密閉し、麻酔から回復させるために15分間静置します。また、大気コントロールとして使用するため、ハエを入れない呼吸計を1つ用意します。次に、1.5 milliliterのエプンドールチューブホルダーを取り付けます。チャンバー上部の両側を開き、色のついた溶液に先端が浸かるようにして呼吸計をチャンバー内に吊るします。温度や圧力の変動からより強力に遮断するため、蓋とチャンバーの間にワセリンを塗布します。次に、蓋を閉め、システムを15分間平衡化させます。その後、各マイクロピペット内の液面とスケールがフレーム内に収まっていることを確認しながら、チャンバーの写真を撮影します。1〜2時間後、解析を開始するために再度写真を撮影します。Image Jソフトウェアを使用して、取得した画像を開きます。次に、ソフトウェア内でピクセルスケールを設定します。各写真を基準として、実験開始時と終了時に撮影された画像において、液体が特定の基準点から移動した距離（delta D）を測定します。最後に、生成された二酸化炭素量を算出します。この手法を用いたところ、ショウジョウバエの二酸化炭素生成量は飼育温度と正の相関があることが観察されました。これらの結果は、野生型ショウジョウバエと比較して二酸化炭素生成量が有意に増加したDistrict Li CcanまたはDG変異体の結果とは対照的です。上述の方法により、代謝の変化を引き起こす可能性のあるショウジョウバエの遺伝子突然変異を一次的に同定することが可能になります。

measurement-of-metabolic-rate-in-drosophila-using-respirometry

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

放射性標識基質からの二酸化炭素生成での測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

本稿で、ショウジョウバエのグリセリン thoraxes...

ショウジョウバエのティッシュの最小限の量を使用してのグリセリンの繊維でミトコンドリアの酸素消費量の測定

回転運動の定量化システム (リクエスト)...

回転運動の定量化システム (リクエスト) を用いたキイロショウジョウバエの運動レベルの測定

ショウジョウバエ幼生及び成体脳における細胞外酸性化と酸素消費量の測定のためのプロトコルを提案します。代謝のアナライザーは、適応し、最適化されたプロトコルで利用されています。マイクロ組織拘束このプロトコルの重要なコンポーネント設計し、特にこの分析での使用のために作成します。...

キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳の代謝解析

電量呼吸法は、小さな生物の代謝率を測定するのに理想的です。本研究においてショウジョウバエ(Drosophila...

電量マイクロレスピロメトリーを用いたショウジョウバエのメラノガスターにおけるO2消費量の測定

ここでは、PINK1B9欠損変異ショウジョウバエの生体エネルギーを解析するための高分解能肺活量測定プロトコルを紹介します。この分析法では、基質-アンカプラー-阻害剤-滴定(SUIT)プロトコルを使用します。...

ショウ ジョウバエのmelanogaster PINK1B9-Null変異体のミトコンドリア機能の解析(高分解能スピロメトリー)

このビデオの記事では、安定かつ制御可能なジオメトリを持つ匂い勾配の構築を可能にする新しい方法を説明します。我々は、簡単にこれらの勾配が嗅覚の欠陥のために画面に使用することができます（フルおよび部分的な臭覚障害）と走化性行動のより微妙な特徴を研究する方法を示しています。...

ショウジョウバエの幼虫の匂い駆動型の動作の高分解能測定

キイロショウジョウバエは寿命調節の分子基盤を探索するための強力なモデル生物である。このプロトコルは、長寿の再現性は、人口ベースの測定だけでなく、潜在的な落とし穴とその回避方法を生成するために必要な手順を説明します。...

における寿命の測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

糸球体濾過率（GFR）の測定は、腎機能の評価のための金本位である。ここでは、二相指数関数的減衰モデルで血漿およびGFRの計算に単一のボーラス注射、フルオレセインイソチオシアネートの判定（FITC）-イヌリンを使用して、意識のあるマウスでGFRを決定することができる高スループット方法を説明する。...

意識マウスにおける糸球体濾過率の測定のためのハイスループット法

ここでは、ハイスループットスクリーニングを可能にする、 ショウジョウバエの飛行性能を迅速かつ正確に測定するための方法を記載している。...

飛行性能の正確かつ迅速な測定のための改善された方法での<em&gt;ショウジョウバエ</em

学ぶショウジョウバエの呼吸計測法による代謝率測定。D. melanogasterを用いた簡便な実験装置でCO2産生量を測定し、実験群と対照群の相対的な代謝率を比較する手法を解説します。

代謝率の測定に

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