Name: 培養哺乳動物細胞での超並列レポーターアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 学ぶ超並列レポーターアッセイ（MPRA）を用いた遺伝子調節活性の解析手法。数千のDNA配列を並列的に検定し、ディープシーケンスと計算解析で配列と遺伝子発現制御の関係を解明する。

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この作品は、受賞数R01HG006785下の国立衛生研究所の国立ヒトゲノム研究所によってサポートされていました。

1配列設計と合成<ol><li>調節活性についてアッセイすべき配列の設計と合成にMPRAを開始します。 pMPRAベクターシリーズとの互換性のために、次のテンプレートを使用して、各シーケンスを設計する：5&#39;-ACTGGCCGCTTCACTG-のVAR -GGTACCTCTAGA- タグ -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 varはアッセイすべき配列を意味し、 タグは 、1つまたは複数の識別タグを表す&#39;。 </li><li> 2つの可変領域（varとタグ ） は 、それらの間のレポーター遺伝子断片の方向性ライゲーションを容易にするためにKpnI（GGTACC）およびXbaI（TCTAGA）制限部位の対によって分離されている。さらに、2つの別個のSfiI（GGCCNNNNNGGCC）部位はpMPRA骨格に指向性ライゲーションを可能にするPCRによって追加される。可変領域は、これらの制限部位のいずれかの追加のコピーを含んではならない。必要であれば、これらの制限酵素の1つ以上が置換され得る限り代替品として1）に近いDNA分子の末端への効率的な切断を可能にし、2）ベクター配列の他の場所で切断しない。追加の詳細についての説明を参照してください。 </li><li>商用ベンダーから、表1にリストされている必要なプライマーを入手します。 </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="381"><tbody><tr><td> MPRA_SfiI_F </td><td> GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG </td></tr><tr><td> MPRA_SfiI_R </td><td> GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC </td></tr><tr><td> TAGseq_P1 </td><td> AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT </td></tr><tr><td> TAGseq_P2 </td><td> CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [インデックス] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG </td></tr></tbody></table> 表1プライマー配列。[インデックス]多重化された配列決定のために使用される6〜8ヌクレオチドのインデックスシーケンスを示している。異なる屈折率を有する少なくとも8 TagSeq-P2プライマーを取得します。すべてプライマーのHPLCまたはPAGEによって精製されるべきである。 <ol start="4"><li>オリゴヌクレオチドライブラリーは、商業ベンダーまたはコア施設から得られた、または製造者によって記載されるようにプログラム可能なマイクロアレイに基づくオリゴヌクレオチド合成機を用いて生成することができる。 100μlのTE 0.1バッファにOLSの製品を再懸濁します。 </li><li> 10％TBE-尿素変性ポリアクリルアミドゲル上のオリゴヌクレオチドライブラリーを実行します。その品質（ 図2A）を評価するのssDNA感受性蛍光染色でレーンや汚れ当たり約1ピコモルをロードします。 </li><li>完全長のオリゴヌクレオチドに対応する離散的なバンドが可視化することができる場合（ 図2A、レーン1および2）、対応するアクリルアミドゲルスライスを切り出し、振盪しながら室温で一晩、100μlのTE 0.1にオリゴヌクレオチドを溶出する。そうでなければ、生のOLS懸濁液を用い進みます。 </li><li>エマルジ ​​ョンPCR 9を使用して、オリゴヌクレオチドライブラリーへのSfiI尾を増幅し、追加</<html> SUP&gt;。 </li><li> 表2に記載したように、50μlのPCR反応混合物をセットアップします。その後、4℃で5分間、300μlのMicellula DNAエマルジ ​​ョンからの油と界面活性剤の混合物および精製キットおよび渦と組み合わせる。 </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="368"><tbody><tr><td>試薬</td><td> 1倍容量（μL） </td></tr><tr><td>ヘラクレスII融合DNAポリメラーゼ</td><td> 0.5 </td></tr><tr><td>ヘラクレスII反応緩衝液を5倍</td><td> 10 </td></tr><tr><td>のdNTP（それぞれ10mM） </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> BSA（20 mg / ml）を</td><td> 1.25 </td></tr><tr><td>プライマーMPRA_SfiI_F（25μM） </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td>プライマーMPRA_SfiI_R（25μM） </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> OLSテンプレート（1-10 attomol） </td><td>変わる</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 50 </td></tr></tbody></table>ve_content &quot;&gt; 表2エマルジ ​​ョンPCR反応混合物（水相）。 <ol start="9"><li>アーティファクトの出現なしに増幅産物の最大収量が得られる濃度を使用してください（セクション1.12を参照）。 </li><li> PCRチューブに得られたエマルジョンを分配し、95℃（2分20サイクルのPCRを行い、20×[95℃で20秒、55°C、72°Cで30秒、20秒]、95℃で3分間°C）。 </li><li>プールDNA精製カラムを用いて増幅産物を精製し、次いでイソブタノールを1ml添加​​し、短時間ボルテックスし、そしてにより各350μlのエマルジョンPCR反応を破壊する。 </li><li>アーチファクトのない増幅（ 図2B）を確認するために、2％または4％アガロースゲル上でアリコートを実行する。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig2highres.jpg" /> オリゴヌクレオチド合成ライブラリーの調製図。A） </s·チョン&gt;三つの異なる生のオリゴヌクレオチド合成ライブラリ（OLS）は、10％TBE-尿素変性ポリアクリルアミドゲル上で実行されます。完全長オリゴヌクレオチド（*）に対応するバンドを可視化し、ライブラリ1から切り出し、2ライブラリ3は、PAGE精製を妨害する汚染物質が含まれていることができます。この場合は、アガロースゲル上で同一のオリゴヌクレオチドライブラリーのランの開放およびエマルジ ​​ョンPCR増幅のPCR増幅。B）製品に直接進む。複雑なオリゴヌクレオチドライブラリーのPCR増幅は、頻繁に上位と下位のバンドとして表示されることがあり、キメラ製品、その他の成果物を作成します。エマルジョンPCRは、これらの成果物を最小限に抑えることができます。 2ライブラリー構築<ol><li> 1％アガロースゲル上で泳動し、2時間、50℃でのSfiIを有するベクターpMPRA1を消化することによって線状化プラスミドバックボーンを準備し、（この場合、2.5キロバイト）をバックボーンバンドを切り出し、ゲル精製スピンカラムを用いて精製する。 </li><li>ダイジェスト2時間、50℃でのSfiIとステップ1.4からのエマルジ ​​ョンPCR産物およびDNA精製カラムを用いて精製する。 </li><li> 、線状化ベクターバックボーンにプロモーター - タグライブラリを連結するために消化したPCR産物100ngの、直線化ベクター骨格およびT4 DNAリガーゼ50ngのを含む反応を設定します。 16℃で一晩インキュベートし、次にリガーゼを不活性化するために20分間65℃で加熱する。 </li><li> E.トランスフォームライゲーション反応で大腸菌 。ライブラリの複雑さを維持するために、設計されたライブラリ内の個別のプロモーター - タグ組み合わせが存在するよりも、少なくとも10倍以上のCFUを得ることを目指しています。 </li><li>タグの合計数​​は約10万である場合、ターゲットのcfuは、典型的には、ライブラリごと6-8パラレル変換を実行することによって達成することができる。 </li><li>各形質転換のために、50μlのエレクトロコンピを組み合わせる氷上の連結混合物2μlを持つ大腸菌細胞 。エレクトロポレーションによりトランスフォーム、800μlのSOCの細胞を回収1時間37℃で振とうによって培地、その後、パラレル変換から細胞を兼ね備えています。 </li><li> 50〜100 / mlのカルベニシリンを含むLB寒天プレート上で回収された細胞のalinquotから、プレート連続希釈を形質転換効率を評価し、37℃で一晩インキュベートする。 / V、Vが回収された細胞とvの全容積で連続希釈に要した一定分量の体積である-総CFUとして（観測CFU）×（希釈倍率）×（V V）を推定する。 </li><li>同時に、回収された細胞の残りは100μgの/ mlのカルベニシリンを補充した200ミリリットルのLBに接種するために使用する。シェーカーインキュベーター内で37℃で一晩、細胞を成長させ、その後、標準的な手順に従って、プラスミドDNAを単離する。 </li><li> 2時間50℃でのSfiIを有する単離プラスミドライブラリーのアリコートを消化し ​​、インサートの存在を確認するために1％アガロースゲル上で泳動。 </li><li> cでプラスミドライブラリーを直線化KpnI及びXbaIでを使用して、プロモーター変異体とタグの間にウッティング。消化効率を最大化するために、シリアル消化を実行します。 </li><li>まず、1時間、37℃でKpnIで消化し ​​た磁気ビーズを用い精製する。第二に、2時間、37℃で1 Uエビアルカリホスファターゼを添加したXbaIで消化、熱は、5分間65℃で不活性化し、その後、磁気ビーズを用いて精製する。 </li><li>完全な線形化を確認するために1％アガロースゲル上でアリコートを実行する。ノーカットプラスミドが表示されている場合は、線形化された断片をゲル精製しなければならない。 </li><li>哺乳動物細胞へのトランスフェクションに適しMPRAライブラリを生成するには、線形化された中間ライブラリにのKpnI / XbaIで互換の端部とのORFを連結。 </li><li> pMPRAdonor1から互換luc2 ORF断片を調製し、1時間37℃でKpnI及びXbaIでこのプラスミドを消化し ​​、1％アガロースゲル上で泳動。 ORFのフラグメントを切り出し（1.7 Kこの場合、b）およびゲル精製スピンカラムを用いて精製する。 </li><li>ステップ2.3から2.8に記載されているように線形化された中間ライブラリにORFのフラグメントをクローニングします。 </li><li> 1時間、37℃でKpnIでMPRAライブラリ（1-2μgのに対応）分量を消化し ​​、1％アガロースゲル上で実行されます。消化されたライブラリが単一のバンドとして実行する場合、追加のバンドが認められた場合には、（通常は中間の構築物のキャリーオーバーに相当）のセクション3に進んで次のように、ライブラリは、さらに精製することができる。 </li><li> 1時間、37℃でKpnIで汚染されたライブラリの3-5μgのを消化し ​​、4℃で一晩0.8％アガロースゲル上で実行されます。 </li><li> 、正しいライブラリバンドを切り出し、ゲル精製スピンカラムを用いてDNAを精製し、1時間37℃で高濃度T4 DNAリガーゼを使用してセルフライゲーションを行う。ステップ2.8で説明したようにその後転換および最終ライブラリーDNAの単離を繰り返します。 </li></ol> 3 Transfection、摂動、およびRNAの単離<ol><li>それぞれ独立したトランスフェクション、文化、適切な培地中の細胞に必要な数（MPRAライブラリの複雑さによって決定されるように、ディスカッションを参照）。例えば、DMEM中で培養HEK293T / 17細胞を、10％FBSおよびL-グルタミン/ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した。各ライブラリおよび実験条件について、少なくとも2つの独立したトランスフェクションのための培養細胞。 </li><li> MPRAプラスミドを用いて培養細胞をトランスフェクション。トランスフェクション方法および条件は、各細胞型について最適化されなければならない。各トランスフェクトサンプルについて、一致させた対照として、プラスミドDNAの一部（50〜100 ngの）を保持。 </li><li>例えば、1ミリリットルのOpti-MEM中10μgのプラスミドDNAを用いた10cmの培養皿内の約50％コンフルエンスまで増殖させた0.5×10 7 HEK293T / 17細胞をトランス私は30μlのリポフェクタミンLTXと10μlのPLUS試薬を使用した低血清培地。 5時間後、トランスフェクション混合物を削除し、許可する細胞は24〜48時間回復する。 </li><li>必要に応じて、設計されたライブラリ内の文脈や信号依存調節配列を活性化するために必要な摂動を行う。 </li><li>細胞を採取し、そのメーカーの指示を使用して、標準的なオリゴ（dT）セルロースカラムやビーズを使用してポリ（A）+ mRNAを単離する。 </li><li>カラムやビーズの最大結合容量は採取された細胞から期待するmRNAの総量を超えていることを確認してください。例えば、セクション3.3から予想される収量は約0.5〜2.5μgのmRNAである。 </li></ol> 4。タグ配列<ol><li>トランスフェクトされた細胞溶解物からベクターDNAのキャリーオーバーをなくすために、で2.4μlのターボDNアーゼ不活性化試薬を、1時間、37℃で1μlのターボのDNase（2U）と、2.3μlの10倍のターボのDNaseバッファーで各20μlのmRNA試料を扱う追加その後、混合、90秒10,000 gで遠心分離し、新しいチューブにソリューションを移すとの5分間のRT。 </li><li>確認する<html>各mRNAサンプルの60〜100 ngの上のセクション4.6で説明した後、アガロースゲル上で製品を実行するようにしてPCRを行うことにより、純度。 （luc2でpMPRA1を使用している場合は0.25キロバイト）特定のアンプリコンが表示されている場合、その列は、処理されたmRNAを精製した後、DNase処理を繰り返します。 </li><li> 、タグ配列のシーケンシングライブラリーを作製cDNAにレポーターmRNAを変換して、PCRによる配列決定アダプターを追加します。 </li><li> 表3に記載したようにmRNAを/ RTプライマー混合物をセットアップします。その後、氷上に置き、5分間65℃でインキュベートする。 表4に記載したように並行して、cDNA合成反応をセットアップする。 </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td>試薬</td><td> 1倍容量（μL） </td></tr><tr><td> mRNAサンプル（400〜700 ngの合計） </td><td> 8 </td></tr><tr><td>オリゴ0dT（50μM） </td><td> 1 </td></tr><tr><td>のdNTP（それぞれ10mM） </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>cDNA合成のため ove_content &quot;&gt; 表3 RNA /逆転写プライマーミックス。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td>試薬</td><td> 1倍容量（μL） </td></tr><tr><td> 10倍のスーパースクリプトIII RTバッファー</td><td> 2 </td></tr><tr><td>のMgCl 2（25mMの） </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT（0.1M） </td><td> 2 </td></tr><tr><td> RNaseOut（40 U /μl）を</td><td> 1 </td></tr><tr><td>スーパースクリプトIII（200 U /μl）を</td><td> 1 </td></tr></tbody></table> 表4 cDNA合成反応混合物。 <ol start="5"><li>ゆっくりするmRNA / RTプライマーがcDNA合成ミックスと混合兼ね備えています。 50分、5分、85℃、50℃でインキュベートした後、氷上に置きます。最後に、20分間37℃で2 UリボヌクレアーゼのHでインキュベートする。 </li><li> 4-6μlの表5に記載したようにPCR反応をセットアップしますcDNA反応混合物または鋳型として50 ngのレポータープラスミド。そして（3分間、72°C [30秒間、30秒間、30秒間95°C 72°Cで55°C]を2分間、26 xに対して95°C）PCR増幅を行う。 </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td>試薬</td><td> 1倍容量（μL） </td></tr><tr><td> PfuUltra II HotStartのPCRマスターミックスの2倍</td><td> 25 </td></tr><tr><td>プライマーTagSeq_P1（25μM） </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td>プライマーTagSeq_P2（25μM） </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td>テンプレート（mRNAは、cDNAの混合物またはプラスミドDNA） </td><td>変わる</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 50 </td></tr></tbody></table> 表5タグ配列のPCR反応ミックス。 <ol start="7"><li> 2％アガロースゲルでPCR産物を実行し、タグ配列のライブラリアンプリコンに対応する物品のバンド（0.25キロバイト使用している場合luc2とpMPRA1）、これらを用いてゲル精製スピンカラムを精製する。 </li><li>プール、イルミナシーケンシング装置と直接、精製タグ配列アンプリコンを変性させ、配列決定する。 </li><li>低品質a）はシーケンスされたタグ内に30未満のスコアまたはb）正確に設計されたタグと一致していないのPhred品質で一つ以上の位置が含まれているすべてのことを削除することで読み込みフィルター。残りの各タグは、各ライブラリに表示された回数をカウントします。 TPMに（百万配列を決定したタグごとにタグ）タグ数を正規化した後、シーケンシングライブラリの各ペアのためのプラスミド由来のタグカウントオーバーのmRNA由来のタグカウントの比を計算する。複数の異なるタグが各配列変異体に結合させた場合には、下流の解析のために彼らの中央値の比率を使用しています。 </li></ol>

<ol><li>Kinney, J., Murugan, A., Callan, C. G., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+deep+sequencing+to+characterize+the+biophysical+mechanism+of+a+transcriptional+regulatory+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Using deep sequencing to characterize the biophysical mechanism of a transcriptional regulatory sequence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (20), 9158-9163 (2010).</li>
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<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
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<li>Mogno, I., Kwasnieski, J. C., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+synthetic+promoter+assays+reveal+the+in+vivo+effects+of+binding+site+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Massively parallel synthetic promoter assays reveal the in vivo effects of binding site variants.</a> Genome Research. 23 (11), 1908-1915 (2013).</li>
<li>Schütze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410 (1), 155-157 (2011).</li>
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</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

MPRAは、遺伝子調節要素における配列活性関係を解析するための柔軟で強力なツールです。MPRA実験の成功は、少なくとも3つの要因にかかっています:1)配列ライブラリの慎重な設計、2)増幅およびクローニング中のアーティファクトの最小化、および3)高いトランスフェクション効率。 
レポーターコンストラクト内の可変領域の可能な長さは、使用される合成またはクローニング技術によって大きく決定されます。標準のOLSは一般的に約200 ntに制限されていますが、このプロトコルは少なくとも1,000 ntまでのインサートと互換性があります。反復性の高い可変領域や強力な二次構造を含む可変領域は、PCRおよびクローニングバイアスにより過小評価される可能性があることに注意してください。各可変領域を識別するタグの長さは10〜20 ntである必要があり、タグのコレクションは、任意のペア間に少なくとも2つのヌクレオチド差があるように理想的に設計する必要があります。既知のマイクロRNAのシード配列またはmRNAの安定性に影響を与える可能性のあるその他の因子を含むタグも、可能な限り避ける必要があります。
MPRA実験の設計における重要なパラメータは、ライブラリに含まれる個別のレポーターコンストラクトの総数です(設計の複雑さ、CDで示されます)。実際には、CDはトランスフェクトできる培養細胞の数によって制限されます。経験則として、トランスフェクトされた細胞の総数は、CD.の少なくとも50〜100倍である必要があります。たとえば、2,000万個の細胞を50%のトランスフェクション効率でトランスフェクトできる場合、CDは~200,000以下である必要があります。CDは、異なる調節配列バリアントの数に配列ごとの異なるタグの数を掛けたものに等しいことに注意してください。各調節配列にリンクされている個別のタグが多ければ多いほど、その配列の活性の推定がより正確になりますが(異なるタグからの測定値を平均化できるため)、1回の実験でアッセイできる個別のバリアントは少なくなります。最適な選択は、実験計画によって異なります。集計された測定値に数学的モデルが当てはめられる単純な「プロモーターバッシング」実験では、通常、バリアントごとに1つのタグで十分です。調節活性の変化を引き起こす一塩基多型のスクリーニングでは、対立遺伝子の各ペアを比較するには個別の仮説検定が必要なため、統計的に堅牢な結果を得るために対立遺伝子ごとに20以上のタグを使用する必要がある場合があります。
アッセイする配列に転写開始部位が含まれていないことが予想される場合は、同じフラグメントに定数プロモーターを追加することもできます。例えば、pMPRAdonor2(Addgene ID 49353)には、上流の可変領域が有意なエンハンサー活性を有することが予想される場合に有用な最小限のTATAボックスプロモーターが含まれていますが、pMPRAdonor3(Addgene ID 49354)には、可変領域にサイレンサー活性またはその他の負の調節要素が含まれると予想される場合に有用な、修飾された強力なSV40ウイルスプロモーターが含まれています。 
生のOLS製品には、多くの場合、かなりの割合の切断されたオリゴヌクレオチドが含まれています。これらは、特に配列間に有意な相同性がある場合、設計された配列の正確なPCR増幅を妨げる可能性があります。PAGE精製を使用して切断された合成産物を除去し、エマルジョンPCRを使用して増幅アーティファクトを最小限に抑えることは、高いライブラリ品質を確保するための効果的な手法です。いずれかのステップが実用的でない場合は、各増幅ステップで使用されるPCRサイクル数を最小限に抑えることが不可欠です。一般に、液体培養におけるクローンライブラリの選択と増殖は、設計の複雑さを維持するのに十分ですが、組換えが起こりやすいベクターを使用する場合、または有意な表現バイアスが観察される場合は、回収された細胞を代わりに大きなLB寒天プレートに直接播種し、個々のコロニーとして増殖させてから、DNA単離のために掻き取ることができます。また、通常、OLSで1:100〜500の割合で見られる合成エラーの潜在的な影響を考慮することも重要です。トランスフェクション前のレポーターコンストラクトの全長シーケンシングは、そのようなエラーを特定して修正するために推奨されます。
トランスフェクション培養のすべての細胞にレポーターコンストラクトを導入する必要はありませんが、トランスフェクション効率が~50%未満の場合、S/N比が低下する可能性があります。新しい細胞型でMPRA実験を行う前に、トランスフェクション条件を最適化することをお勧めします。トランスフェクションが困難な細胞タイプを扱う場合、トランスフェクションされた細胞を事前に選択することでMPRAシグナルをブーストできます。pMPRAベクターシリーズには、RNA単離前にトランスフェクトされた細胞を物理的に濃縮するために使用できる切断された細胞表面マーカーを構成的に発現するバリアントが含まれています(たとえば、Addgene ID 49350および49351)。

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Erratum: Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

超並列レポーターアッセイ（MPRA）DNA配列1〜7の数十万人に何千もの転写調節活動の多重化された測定を可能にする。その最も一般的な実装では、多重化は、オープンリーディングフレーム（; 図1 ORF）の下流に識別するシーケンスタグを含む合成レポーター遺伝子に関心のある各シーケンスを結合することによって達成される。トランスフェクション、RNA単離およびレポーター遺伝子転写物の3 &#39;末端の深いシーケンシングの後、結合された配列の相対的活性は、それらの識別タグの相対存在量から推測することができる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig1highres.jpg" /> MPRAの図1。概要。MPRAレポーター構築物のライブラリーは、合成に推定される調節配列に結合することによって構築される（例えばGFP又はルシフェラーゼのような）「不活性」、ORFから成るレポーター遺伝子は、識別配列タグが続く。ライブラリーは、培養細胞の集団に一斉にトランスフェクトされ、転写レポーターmRNAはその後回収される。ディープシークエンシングは、レポーターmRNAおよびトランスフェクトプラスミドの間で、各タグの出現回数をカウントするために使用される。プラスミドカウント上のmRNAのカウントの比率が、対応する調節配列の活性を推測するために使用することができる。メルニコフの許可を得て適応さら 2。 MPRAは、対象の遺伝子座を横切っ新規調節エ​​レメントに対する個別の遺伝子調節要素の1）総合的突然変異誘発、2）スキャンを含む、実験デザインの多種多様に適合させることができる、3）推定上の一組の天然の遺伝的変異の効果を試験するプロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー、合成調節要素の4）の半合理的なエンジニアリング。リー配列変異体のbrariesは、プログラマブルマイクロアレイ2,3,6,7、縮重オリゴヌクレオチド1,4のアッセンブリー、コンビナトリアルライゲーション8およびゲノムDNA 5の断片化に対するオリゴヌクレオチドライブラリー合成（OLS）を含む、さまざまな方法を用いて生成することができる。 （それぞれAddgene IDが49349と49352、; http://www.addgene.org）このプロトコルはOLSとpMPRA1とpMPRAdonor1ベクターを用いて、変異型プロモーターのライブラリーの構築について説明し、培養された哺乳動物細胞へのこのライブラリの一過性トランスフェクションおよびその後の定量それらに関連するタグ（タグ配列）の深い配列決定によるプロモーター活性の。このプロトコルの以前のバージョンでは、（2013）研究23、800から811メルニコフらネイチャー·バイオテクノロジー30、271-277（2012）およびKheradpour らゲノムに報告され、研究で使用した。

<table><tbody><tr><td>オリゴヌクレオチドライブラリ合成</td><td>Agilent、CustomArray、またはその他のOLSベンダー</td><td>カスタム</td><td>OLS構築方法を使用する場合</td></tr><tr><td>pMPRA1</td><td>Addgene</td><td>49349</td><td>MPRAプラスミドバックボーン</td></tr><tr><td>pMPRAdonor1</td><td>Addgene</td><td>49352</td><td>luc2 ORFドナープラスミド</td></tr><tr><td>TE 0.1 Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)</td><td>汎用</td><td>n/a</td><td>OLSバッファー</td></tr><tr><td>NovexTBE-尿素ゲル、10%</td><td>Life Technologies</td><td>EC6875BOX</td><td>PAGEのOLS製品の精製</td></tr><tr><td>Novex TBA-尿素サンプルバッファー</td><td>Life Technologies</td><td>LC6876</td><td>PAGEのOLS製品の精製</td></tr><tr><td>SYBR金核酸ゲル染色</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td>PAGEのOLS製品の</td></tr><tr><td>精製 Micellula DNAエマルジョン&精製キット</td><td>EURx/CHIMERx</td><td>3600-01</td><td>エマルジョンPCRによるライブラリー増幅</td></tr><tr><td>ハーキュラーゼII 融合DNAポリメラーゼ</td><td>Agilent</td><td>600675</td><td>エマルジョンPCR用ポリメラーゼ</td></tr><tr><td>SfiI</td><td>ニューイングランド・バイオラボ</td><td>ス R0123S</td><td>pMPRAベクターによるライブラリークローニング</td></tr><tr><td>KpnI-HF</td><td>ニューイングランド・バイオラボ</td><td>R3142S</td><td>pMPRAベクターによるライブラリークローニング</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NewEngland Biolabs</td><td>R0145S</td><td>pMPRA ベクター</td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ (2,000,000 units/ml)</td> によるライブラリクローニングNew <td>England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>pMPRA ベクターによるライブラリクローニング</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>C4040-50</td><td>pMPRA ベクターによるライブラリクローニング</td></tr><tr><td>LB 寒天培地およびカルベニクリンを含む液体培地</td><td>ジェネリック</td><td>n/a</td><td>成長培地クローニング</td></tr><tr><td>E-Gel EX Gels 1%</td><td>Life Technologies</td><td>G4010-01</td><td>ライブラリの検証と精製</td></tr><tr><td>E-Gel EX Gels, 2%</td><td>Life Technologies</td><td>G4010-02</td><td>ライブラリの検証と精製</td></tr><tr><td>MinElute Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>ライブラリとバックボーンの精製</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>ライブラリ DNA 単離</td></tr><tr><td>細胞培養培地</td><td>n/</td><td>a n/a</td><td>実験特異的</td></tr><tr><td>トランスフェクション試薬</td><td>n/</td><td>a n/a</td><td>実験特異的</td></tr><tr><td>MicroPoly(A)Purist Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1919</td><td>mRNA 単離</td></tr><tr><td>TURBO DNAフリーキット</td><td>Life Technologies</td><td>AM1907</td><td>プラスミドDNA除去</td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Lifeテクノロジー</td><td>18080-051</td><td>cDNA 合成</td></tr><tr><td>PfuUltra II Hotstart PCR マスターミックス</td><td>Agilent</td><td>600850</td><td>Tag-Seq PCR プライマー用ポリメラーゼ</td></tr><tr><td>(本文参照)</td><td>IDT</td><td>カスタム</td><td>PAGE 精製 Tag-Seq プライマー</td></tr></tbody></table>

培養哺乳動物細胞での超並列レポーターアッセイ

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

遺伝子レポーターアッセイは、DNA配列とその遺伝子調節活性との関係を解剖するための確立された強力なツールです。しかし、このアッセイの潜在的なスループットは、タンパク質蛍光または酵素活性を調節活性の代理として使用して、目的の各配列の活性を個別にクローニングし、アッセイする必要性によって制限されています。ハイスループットDNA合成およびシーケンシング技術の進歩により、近年、レポーターコンストラクトの大規模ライブラリの構築と調査を多重化することにより、これらの制限を克服することが可能になりました。このプロトコルは、単一細胞培養皿中の数十万の推定調節配列を直接比較できるMassively Parallel Reporter Assay(MPRA)の実装を説明しています。

MPRAは、高解像度、転写調節エレメントの配列 - 活性関係の定量的な切開を容易にする。成功MPRA実験は、一般的にトランスフェクトライブラリ（ 図3A）中の配列の大部分を再現性の高い測定結果が得られます。乏しい再現性（ 図3B）が観察される場合、これは、アッセイされた配列のうち、1）低い絶対活性、または2）低いトランスフェクション効率のいずれかに、回収されたRNA試料中のレポーターmRNAの低すぎる濃度の指標である。 図4は 1,2センダイウイルスへの曝露の有無にかかわらず、HEK293細胞におけるヒトIFNB遺伝子の上流145 bpの配列の〜37000のランダムな変異型を分析することによって生成された代表「情報フットプリント」を示しています。プロモーターTATAボックスと知られている近位エンハンサー10は、明らかに情報豊富なレジとして識別することができるウイルス依存的にアドオン。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig3highres.jpg" /> 図3。タグ配列の再現性。高い（A）と低（B）再現性を持つ2つの独立した複製のトランスフェクションからのタグ配列データの例を示す散布図。後者のプロットは、2つの複製の一方のみに高いmRNAのカウントを持つ多くの外れ値のタグを表示します。このような成果物は、一般的に、レポーターmRNAの濃度によるレポーター構築物のうち、低い絶対活動、または低トランスフェクション効率のいずれか、定量的PCR増幅のために低すぎることを示している。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig4highres.jpg" /> 人間IFNB転写開始部位および近位エンハンサーの図4の情報フットプリント。 </strオング&gt;人間IFNB遺伝子の上流145ヌクレオチド（nt）の地域の約37000のランダムな変異体は、（A）とし、センダイウイルスに（B）の露出せずにHEK293細胞にMPRAを使用してアッセイした。青いバーは、レポーター出力し、各位置のヌクレオチド間の相互情報を表示します。近位エンハンサーおよびTATAボックスは、ウイルス感染時に高い情報コンテンツの領域として際立っている。

遺伝子レポーターアッセイは、DNA配列とその遺伝子調節活性との関係を解剖するための確立された強力なツールです。候補の調節要素を、同定配列タグを持つレポーター遺伝子に結合させることで、これらのアッセイの大規模な並列化が可能になります。

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

この手順の全体的な目標は、数千のDNA配列の遺伝子調節活性を並行してアッセイすることです。これは、まず、目的のDNA配列が、その3つの主要なURに1つ以上の識別配列タグを持つレポーター遺伝子に連結されているレポーターライブラリーを構築することによって達成されます。手順の2番目のステップは、このレポーターライブラリを細胞集団にトランスフェクションすることです。最後のステップは、レポーターmRNAおよび対応するレポーターライブラリーにおける各同定配列タグの出現回数をディープシーケンシングによってカウントすることです。最終的には、結果を使用して、配列タグカウントの計算分析を通じて、DNA配列と遺伝子調節要素の活性との関係を推測できます。この手法は、ルシフェラーゼやGFPベースのレポーターアッセイなどの既存の方法と比較した場合の主な利点として、培養細胞の1つの皿で数千の調節配列をアッセイできることです。この方法は、プロモーターまたはエンハンサー内のどのヌクレオチドが必須ベースの活性を持つかなど、遺伝子調節分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、特定の細胞状態での活性について推定される調節要素の大規模なライブラリをスクリーニングするなど、他のさまざまな実験デザインに使用できます。レポーターライブラリの構築手順を実演するのは、バイオテクノロジー研究所の上級研究員であるPeter Rugo氏で、レポーターライブラリのTRANSFECTとRNA回収の実演は、私のグループの上級研究員であるLee Wang氏で、超並列レポーターアッセイ(以下、NPRAと呼びます)は、調節活性のためにアッセイされる配列の設計と合成から始まります。また、tag は 1 つ以上の識別タグを示します。KPN oneとXBA oneの制限サイトは、その間に位置しています。合成したオリゴヌクレオチドライブラリーを100マイクロリットルのTE 0.1バッファーに再懸濁します。オリゴヌクレオチドライブラリーを10%TBE尿素変性ポリアクリルアミドゲル上で分析します。各レーンに約1つのoleをロードし、1本の鎖DNA感受性蛍光染色でゲルを分析します。全長オリゴヌクレオチドに対応する目立たない禁止事項がある場合は、それを切り取り、オリゴを100マイクロリットルのTE0.1に室温で一晩溶出し、精製したゲルまたは生のオリゴヌクレオチドライブラリーを使用して振とうします。エマルジョンPCRをセットアップしてライブラリーを増幅し、SIワンテールを添加します。表2に示すように、50マイクロリットルの反応を設定します。次に、50マイクロリットルの反応混合物を、my DNAエマルジョンおよび精製キットの300マイクロリットルのオイルと界面活性剤の混合物と組み合わせ、摂氏4度の渦で5分間エマルジョンに混合します。次に、エマルジョンを50マイクロリットルの反応としてPCRチューブまたはプレートに分配し、PCR後に20サイクルのPCRを実行します。350マイクロリットルのエマルジョンを元に戻します。次に、1ミリリットルのイソブタノールとボルテックスを混合物に加えます。DNA精製カラムを使用して増幅産物を短時間精製し、2%または4%agrosゲル上でEloquaを実行してその品質を評価します。複雑なオイルライブラリの血清増幅は、表現バイアス、RICアプリケーション、およびその他のアーティファクトを導入する可能性があります。追加の品質管理に使用されるPCRサイクルの数を最小限に抑えることが不可欠です。次のステップに進む前に、完全なシーケンシングライブラリを実行することをお勧めします 直鎖状プラスミドバックボーンを調製するため。まず、50°CでSFI1と1つのベクターを2時間消化します。次に、消化産物を1%ゲル上に流し、ゲル精製スピンカラムを使用して2.5 KILOBASEバックボーンバンドからDNAを回収します。次に、同様にエマルジョンPCR産物を消化し、DNA精製カラムで生成物を回収します。次に、100ナノグラムの消化済みPCRと50ナノグラムの直鎖状プラスミドでライゲーション反応を設定します。T 4 リガーゼを使用し、翌日 16°C で一晩反応を実行します。ライゲーション反応を65°Cで20分間加熱して不活性化します。次に、ライゲーション反応生成物の2マイクロリットルアリコートを50マイクロリットルのエレクトロコンピテントイコイトに変換します。800マイクロリットルのSOC培地で37°Cの細胞を1時間振とうしながら回収します。次に、すべての並列変換をプールし、ミリリットルあたり50〜100マイクログラムの炭素ペニシリンをLB寒天に段階希釈液をプレーティングして評価します。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートし、翌日に総CFUを推定します。形質転換の直後に、形質転換細胞の残りを使用して、1ミリリットルあたり100マイクログラムの炭酸塩を補充した200ミリリットルのLBを接種します。細胞を摂氏37度で一晩増殖させ、翌日振とうしながら、標準的な手順に従って血漿DNAを単離し、インサートの存在を確認します。単離されたライブラリーのアリコートをSFI oneで消化し、1%arosゲルで生成物を使い果たします KPN oneおよびXBA oneを使用した連続消化でプラスミドライブラリを線形化し、最初にKPN oneで摂氏37度で1時間消化し、磁気ビーズを使用して製品を精製します。次に、XBA1とエビアルカリホスファターゼのユニットで製品を摂氏37度で2時間分解します。65°Cで反応を5分間不活性化し、磁気ビーズを用いて生成物を精製します。1%ゲルでアリコートを実行し、カットされていないプラスミドが見える場合は、直鎖状フラグメントをゲル化して、哺乳動物細胞へのトランスフェクションに適したNPRAライブラリーを作製します。まず、P-M-P-R-Aドナー1から読取フレームフラグメントを開くための互換性のある運を準備します。このプラスミドをKPN oneおよびXBA oneとともに摂氏37度で1時間消化します。その後、1%AGROSゲルで製品を分析します。この場合、オープンリーディングフレームフラグメントを1.7キロベースで切り取り、ゲル精製スピンカラムを使用して精製します。次に、直列化されたオープンリーディングフレームを、前のライゲーションで説明したように、直列化された中間ライブラリーにライゲーションします。ライゲーション産物を大腸菌細胞に形質転換し、前述のように最終的なNPRAプラスミドライブラリーを単離します。気をつけないと持ち越しましょう。調整されたプラスミドとサブプレーティングされた製品は、最終的なプラスミドプール内の正しいコンストラクトの割合を大幅に減らすことができます。次の手順に進む前に、正しいバンドを分離し、背景を確認してください。小切手として、NPRAライブラリの1マイクログラムまたは2マイクログラムのEloquaとKPNの1を消化します。これを1%ゲルで実行し、単一のバンドとして実行される場合は、続行します。それ以外の場合は、トランスフェクション培養細胞への汚染への対処方法に関するテキストプロトコールを参照してください。NPRAと。プラスミドの条件は、細胞タイプごとに最適化する必要があります。例えば、10センチメートルの培養皿中で約50%のコンフルエンスまで増殖させた500万個のHK2 93 T 17細胞を、1ミリリットルのofm中に10マイクログラムのプラスミドDNAをトランスフェクションし、30マイクロリットルのリポLTXおよび10マイクロリットルのプラス試薬を用いて1つの還元血清培地でトランスフェクションすることができる。この場合、トランスフェクション混合物を約5時間除去し、細胞を1〜2日後に回復させ、細胞を回収し、キットを使用してポリ陽性mRNAを単離します。次に、タグを作成し、シークエンシングライブラリをシークして結果を分析します。NPRAは、転写調節要素の配列活性相関の高分解能定量的解剖を促進します。NPRA実験が成功すると、通常、Transfectedライブラリの大部分の配列について、再現性の高い測定値が得られます。再現性が悪い場合は、回収したRNA中のレポーターmRNAの濃度が低すぎる可能性があります。これは、アッセイ配列間の絶対活性が低いため、またはトランスフェクション効率が低いために発生する可能性があります。これらの成功したn PRAでは、ヒトインターフェロンβ遺伝子の上流にある1 45塩基対配列の37,000の変異体が、センディウイルスへの曝露の有無にかかわらず分析されました。プロモータータタボックスと既知の近位エンハンサーは、ウイルス依存性で情報量の多い領域として明確に識別できます。このテクニックを習得すると、この手順に従って適切に実行すれば、約1週間で実行できます。EMCEやタンパク質DNAアフィニティーキャプチャなどの他の方法を実行して、活性DNA配列内の重要なヌクレオチドにどの転写因子が結合しているかなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、何千ものDNA配列の遺伝子調節活性を並行してアッセイするためのレポーターライブラリーの作り方を十分に理解できるはずです。

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生物学

生きた細胞内の個々のDNA分子を観察する方法が記載されている。技術は目的のDNAに組み換え結合部位に蛍光標識lacリプレッサータンパク質の結合に基づいています。この方法は、時間をかけて生きている細胞内の多くの組換えDNAをたどるように適応させることができる。...

蛍光顕微鏡法による、複数世代にわたってライブ哺乳類細胞におけるプラスミドの複製を監視

我々は、高スループットのロボットのトランスフェクションと自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを使用して転写調節因子を同定するための迅速で安価なスクリーニング法を提示する。このプロトコルは、急速に数千の遺伝子のための直接のサイド·バイ·サイド機能データを生成し、目的の任意の遺伝子をターゲットに簡単に変更可能です。...

自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング

細胞プロセスのシステム·レベルの理解を達成することは、現代の細胞生物学の目標です。我々はここでゲノム規模のRNAiライブラリーを用いた遺伝子の機能を調べるために、様々な細胞機能のエンドポイントのルシフェラーゼレポーターを多重化するための戦略について説明します。...

培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

我々は、マイクロスケール細胞刺激実験のために自動細胞培養と尋問プラットフォームを開発した。プラットフォームは、栽培と細胞の小集団を刺激し、分子解析のための溶解物の回収で、シンプルで汎用性の高い、かつ正確なコントロールを提供しています。プラットフォームはよく貴重な細胞および/または試薬を使用した研究に適しています。...

マイクロスケール細胞刺激のための実験のための多目的自動化プラットフォーム

細菌性生物発光遺伝子カセットを発現する哺乳動物細胞（...

細胞毒性の継続とリアルタイム監視のための自律的に生物発光哺乳類細胞

ここでは、小干渉合成RNA(siRNA)、化学化合物、および 結核 菌変異体ライブラリーのハイスループット/高含有スクリーンに適用可能な表現型アッセイについて述べている。この方法は、自動共焦点顕微鏡を用いた蛍光標識された宿主細胞内の蛍光標識型 結核...

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

(1)細胞内細菌性病原体を標的とする真核生物の細胞浸透性抗菌薬を同時に同定し、(2)真核生物の細胞毒性を評価するために、ハイスループットのリアルタイムアッセイが開発されました。その後、同じ技術のバリエーションをデジタル分注技術と組み合わせて、簡便で高解像度の用量反応、および 2 次元および 3...

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

安易な蛍光アッセイであるアミノ アミノアシル tRNA-合成酵素/tRNA ペア哺乳類細胞で発現したタンパク質に非正規のアミノ酸 (ncAAs) を組み込むことの効率を評価する. します。サイトと bioorthogonal GPCR の生きているセルのラベルを連結する光橋マッピングを含む ncAAs の G タンパク質共役受容体 (Gpcr)...

光橋マッピングおよび生きている哺乳類細胞における Bioorthogonal 化学の Gpcr にプローブを化学物質の遺伝的結合の最適化

MRGPRX2受容体を介してマスト細胞を活性化できる短いペプチドのライブラリーを生成する技術が記載されている。関連する技術は、容易で安価であり、他の細胞受容体に拡張することができる。...

工学的HEK細胞を用いたMRGPRX2を活性化するペプチドのスクリーニング

イントロマイクロRNA生合成レポーターアッセイを開発し、イン ビトロ の細胞で、イントロニックmiRNAの1つ、ターゲットの1つ、調節タンパク質を過剰発現させるプラスミド、ウミシイタケの4種類のプラスミドを用いました。miRNAをプロセシングし、標的配列に結合することによってルシフェラーゼ発現を制御することができた。...

哺乳類細胞におけるイントロニックマイクロRNA成熟を解析するためのレポーターアッセイ

この研究では、最近作成されたダブルレポーター株を用いた マイコバクテリウム・アブセッサス...

マイコバクテリアに対するハイスループット薬物スクリーニングのためのアッセイ開発

学ぶ超並列レポーターアッセイ（MPRA）を用いた遺伝子調節活性の解析手法。数千のDNA配列を並列的に検定し、ディープシーケンスと計算解析で配列と遺伝子発現制御の関係を解明する。

培養哺乳動物細胞での超並列レポーターアッセイ

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