発生と人間INO80クロマチンリモデリング複合体とSubcomplexesの精製

本手順の目的は、NO80クロマチンリモデリング複合体の野生型および変異型マルチサブユニットを生成し、精製することである。まず、Flagエピトープタグ付きNO80タンパク質を発現している細胞から核を単離し、次に核抽出液を調製する。その後、抗Flagアフィニティークロマトグラフィーを用いて、野生型または変異型のヒトNO80クロマチンリモデリング複合体を精製する。最終的に、精製されたNO80複合体のサブユニット組成をウェスタンブロッティングまたは銀染色によって解析することができる。

この手法は、MultiProクロマチンリモデリング複合体のサブユニットが全体の活性にどのように寄与しているかという重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法は、特にNO 80クロマチンリモデリング複合体の野生型および変異体の研究用に設計されていますが、Mediatorのような他の多サブユニット核複合体の研究にも適用可能です。

この手順で最も重要な工程は核抽出ステップです。塩抽出ステップにおいて、塩を添加する速度が速すぎたり、激しく混ぜすぎたりすることで問題が生じることが一般的です。ローラーボトルでの培養後、HEC 2 9 3細胞を適切なサイズの目盛り付き円錐チューブに移し、1000 ×g、4 °Cで10分間遠心分離します。上清を除去した後、細胞ペレットの体積を測定し、緩衝液Aを細胞ペレット体積の5倍量加え、緩やかなピペッティングで再懸濁させ、正確に10分間氷上でインキュベートします。

再び細胞を遠心分離した後、細胞ペレットを2回目に測定します。サイズは最大で2倍に増加しているはずです。今回は、細胞を緩衝液Aの2倍の細胞容量で再懸濁し、その後、適切なサイズのダウ組織ホモジナイザーに細胞懸濁液を移します。細胞の90%がトリパンブルーで陽性に染色されるまで、緩いガラスペスティルを用いて細胞懸濁液をホモジナイズします。ホモジナイズした細胞を45 mL高速遠心管に入れ、固定角ローターを用いて25,000 ×g、4 °Cで20分間遠心分離します。その後、核ペレットから細胞質タンパク質を含む上清を除去し、塩を用いて核を抽出します。

次に、開始時のパッキングセルボリューム 3 mLにつき 2.5 milliliters のバッファーCをペレットに加えます。その後、セラロジカルピペットを使用して、チューブの壁面からペレットを剥がし、混合物全体を適切なサイズのドゥーンホモジナイザーに移します。緩いペッスルで2回ストロークして混合物をホモジナイズし、核を再懸濁させた後、再懸濁した核画分を、懸濁液が少なくとも 0.5 centimeters の深さまで満たされるサイズの冷却ビーカーに移します。

次に、以下の計算式に従って、溶液の最終濃度を0.42 Mの塩化ナトリウムにするために必要な5 M塩化ナトリウムの量を算出します。算出した量の塩溶液を、氷上でガラス棒を用いて懸濁液を穏やかに攪拌しながら、一滴ずつ徐々に加えます。すべての塩化ナトリウムを加え、溶液が非常に粘稠になるまで、懸濁液の塩濃度を上昇させます。その後、粘稠な懸濁液を、キャップアセンブリを備えたType 45 TIローターの70 mLポリカーボネートチューブに慎重に移し、ミューテーターを用いて、密封したチューブを4 °Cでゆっくりとロッキングします。30分後、TI 45ローターを用いて、40,000 ×g、4 °Cで30分間超遠心分離し、上清である核抽出液を一つのプラスチック容器に回収します。

次に、核抽出液を適切な量に分注し、液体窒素で急凍結させ、-80°Cで保存します。免疫精製のためのAnti-Flag arosを調製するには、まずチップを切断した200 µLピペットを使用して、50% Anti-Flag arosビーズスラリー200 µLを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。予備洗浄済みのビーズを、解凍したばかりの核抽出液10 mLを含むコニカルチューブに移し、ラボ用ローテーターを用いて低速回転させながら4°Cで4時間保持した後、4°C、1000 ×gで5分間遠心分離してflag arosを回収します。

次に、ビーズ抽出液Pを10 mLのlysis 450バッファーで、4°Cで5分間、回転振とう機を用いて緩やかに揺らしながら洗浄します。その後、ビーズ抽出混合液を遠心分離し、上清を除去します。ペレットを100〜150 µLの新鮮なlysis 450に再懸濁させ、ビーズを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。

すべてのビーズがマイクロ遠心チューブに移るまで、15 mLコニカルチューブを100〜150 µLのLysol 50で繰り返し洗浄します。マイクロ遠心機でビーズをスピンダウンさせた後、1 mLのLysol 50で3回、次いで1 mLのEB 100緩衝液で1回洗浄します。その後、結合したタンパク質を溶出させるため、Flagペプチドを含む200 µLのEB 100緩衝液を加え、サンプルを4 °Cで氷上に静置してインキュベートします。

30分後、マイクロ遠心分離機でビーズをペレット化し、溶出されたOAC C複合体を含む上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。溶出操作をさらに4回繰り返した後、回収した溶出液を空のスピンカラムに通し、タンパク質画分から残留したFlag AeroBeadsを除去します。最後に、分画分子量50,000の遠心超ろ過デバイスを用いて、溶出タンパク質画分を約10倍に濃縮します。

この図に示されているように、先ほど実演した指定のflagタグサブユニットを用いて調製したNO 80複合体の純度は、銀染色SDSポリアクリルアミドゲルを用いて評価できます。このコントロールレーンに現れるタンパク質は、flagアエロに非特異的に結合した不純物です。これらのラベルは、テストしたNO 80サブユニットに対応するバンドを示しており、また、分子量マーカーの移動度を示しています。

野生型NO 80の位置を黒い四角で示し、NO 80変異体の位置を白抜き円で示している。黒線で区切られたレーンは、別のゲルから得られたものである。複合体の組成は、各種NO 80サブユニットに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングにより評価できる。

例えば、末端ドメインモジュール、ヘリカーゼセンター関連モジュール、およびSNF2モジュールのサブユニットを評価しました。この手法を習得すれば、細胞の回収から複合体の精製までを1日で完了させることができます。

この手法を用いることで、研究者は哺乳類細胞における多量体複合体およびサブ複合体を精製し、その機能を研究することが可能になります。このビデオを視聴することで、ヒト細胞やその他の哺乳類細胞株から、クロマチンリモデリング複合体やその他の多量体タンパク質複合体を精製する方法について、より深く理解することができます。