発生と人間INO80クロマチンリモデリング複合体とSubcomplexesの精製

この手順の目的は、oh 80 Chromatin Remodeling Complexのマルチサブユニットの野生型および変異型を生成および精製することです。これは、まず、O 80タンパク質にタグが付けられたフラグエピトープを発現する細胞から核を単離することによって達成され、第2のステップでは、核抽出物が調製され、次いで、O80クロマチンリモデリング複合体の野生型または変異ヒトが抗フラグアロスクロマトグラフィーによって精製される。最終的に、精製されたNO 80複合体のサブユニット組成は、ウェスタンブロットまたは銀染色によって分析できます。

この方法は、MultiProクロマチンリモデリング複合体のサブユニットが全体的な活性にどのように寄与しているかという重要な疑問に答えるのに役立ちます。この方法は、NO 80クロマチンリモデリング複合体の野生型および変異型を研究するために特別に設計されていますが、他のマルチサブユニット核複合体の研究にも使用できます。調停者のように。

手順の最も重要なステップは、核抽出ステップです。塩抽出ステップ中に、人々はあまりにも速くまたはあまりにも激しく塩を追加する傾向があるため、人々は通常問題に遭遇します 培養後 ローラーボトルでは、HEC 2 9 3細胞を適切なサイズの目盛り付き円錐管に移し、Gの1000倍と摂氏4度で10分間スピンダウンします。燻腸を除去した後、パックされた細胞ペレットの容量を測定し、穏やかなピペッティングで緩衝液Aの5パック細胞容量にペレットを再懸濁し、氷上で細胞を正確に10分間インキュベートします。

細胞を再度スピンダウンした後、細胞ペレットをもう一度測定すると、サイズが最大で2倍に増加しているはずです。今回は、緩衝液Aの2パック細胞容量に細胞を再懸濁し、その後、細胞懸濁液を適切なサイズのダウン組織ホモジナイザーに移し、細胞の90%がトライアンブルー遠心分離機で陽性に染色するまで、緩いガラス乳棒で細胞懸濁液を均質化し、均質化された細胞を45ミリリットルの高速遠心分離チューブで25分間20分間、 Gの000倍、固定角ローターで摂氏4度。次に、細胞質タンパク質を含むSUP被覆液を核ペレットから取り出し、塩で核を抽出します。

次に、2.5ミリリットルのバッファーCを追加しますが、開始パックセル容量の3ミリリットルごとにペレットに追加します。次に、血清ピペットを使用して、ペレットをチューブの壁から取り除き、混合物全体を適切なサイズのダウンホモジナイザーに移します。緩い乳棒の2ストロークで混合物を均質化して核を懸濁し、次に再懸濁したnu核画分を、懸濁液がビーカーを少なくとも0.5センチメートルの深さまで満たすようなサイズの冷却ビーカーに移します。

次に、次の式に従って、溶液を最終濃度0.42モルの塩化ナトリウムにするために必要な5モルの塩化ナトリウムの体積を計算します。次に、計算された量の塩溶液を、氷上のガラス棒で懸濁液を穏やかにスターにしながら、一滴ずつ徐々に追加し、すべての塩化ナトリウムが追加され、溶液が非常に粘性になるまで懸濁液の塩濃度を上げます。次に、粘性懸濁液をキャップアセンブリ付きのタイプ45 TIローターで70ミリリットルのポリカーボネートチューブに移し、ミューテーターを使用して密閉されたチューブを摂氏4度でゆっくりと揺さぶります30分後、TI 45ローターでサンプルを40,000倍Gおよび摂氏4度で30分間超遠心分離します。 そして、上清を含む核抽出物を1つのプラスチック容器に引き込みます。

次に、核抽出溶液を便利なサイズのアリコートにスナップし、液体窒素で凍結し、摂氏マイナス80度で保存します。免疫精製用のAnti-Flag arosを調製するには、まずチップカットオフ付きの200 μLピペットを使用して、50%Anti-Flag arosビーズスラリーで200 μLを1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移します。事前に洗浄したビーズを、実験室の回転子でゆっくりと回転しながら摂氏4度の時間前に、新たに解凍した核抽出物10ミリリットルを含む円錐形のチューブに移し、次にGの1000倍と摂氏4度の5分間遠心分離によってフラグアロスを収集します。

次に、ビーズ抽出物Pをシラミ10ミリリットル、4つの50緩衝液で4°Cの5分間、ミューテーター上で穏やかに揺さぶって洗浄する。その後、ビーズ抽出物混合物をスピンダウンした後、再度再利用します。新鮮なシラミ4 50の100〜150マイクロリットルでペレットを懸濁し、ビーズを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。

100〜150マイクロリットルのLysol 50で15ミリリットルの円錐管をすすぎ続け、すべてのビーズがマイクロ遠心分離管に移されるまで。マイクロ遠心分離機でビーズをスピンダウンした後、1ミリリットルのlys four 50で3回、1ミリリットルのEB 100.Bufferで1回洗浄します。次に、結合したタンパク質を溶出するために、フラッグペプチドを含むEB 100バッファーを200マイクロリットル加え、サンプルをナッツ上で摂氏4度でインキュベー

30分後、得られたマイクロ遠心分離機でビーズをペレット化し、OAC C複合体で溶出したSUP被覆液を新しいマイクロ遠心チューブに移します。elucianをさらに4回繰り返した後、引っ張った溶出液を空のスピンカラムに通し、タンパク質画分から残留フラグエアロビーズを除去します。最後に、分子量50, 000のカットオフを備えた遠心式限外ろ過装置を使用して、言及されたタンパク質画分を約10倍濃縮します。

この図に示すように、示されたフラッグタグサブユニットを使用して調製したNO 80複合体の純度は、今示したように、銀染色されたSDSポリアクリルアミドゲルを使用して評価できます。このコントロールレーンに現れるタンパク質は、フラッグエアロに非特異的に結合する汚染物質です。これらのラベルは、試験されたNO 80サブユニットに対応する禁止を示し、これらは分子量マーカーの移動性を示しています。

野生型NO 80の位置は黒の四角で示され、NO 80変異体の位置は白丸で示されています。黒い線で区切られたレーンは、別々のゲルからのものです。複合体の組成は、さまざまなNO 80サブユニットに対する抗体を使用してウェスタンブロットで評価できます。

例えば。以下は、エンドターミナルドメインモジュールのサブユニットであり、ヘリカーゼセンター関連モジュールとSNFの2つのモジュールが評価されたものです。一度習得すると、この技術は、細胞の採取から複合体の精製まで、1日以内に完了することができます。

この技術により、研究者は哺乳類細胞のマルチサブユニット複合体とサブ複合体を精製して、その機能を研究することができます。このビデオを見れば、ヒト細胞やその他の運動量細胞株からクロマチンリモデリングやその他のマルチサブユニットタンパク質複合体を精製する方法について理解を深めることができます。