ATP依存性クロマチンリモデリング酵素の活性を分析するための生化学的アッセイ

ここでは、ATP依存性クロマチンリモデリング酵素の能力を特徴づけるために使用できる生化学的アッセイについて説明し、1)ATP依存性のヌクレオソームのスライドを触媒し、2)ヌクレオソーム基質と関与し、3)ATPをヌクレオソームまたはDNA依存的に加水分解します。

次の手順の目的は、TP依存性クロマチンリモデリング複合体のさまざまな生化学的活性を測定することです。これは、電気泳動移動度シフトアッセイまたはemsaを使用して、DNA分子の一端からDNA上のより中心的な位置への位置ヌクレオソームのTP依存的なスライドを測定することによって達成されます。同様のEMSAベースの方法を使用して、リモデリング複合体に結合したモノヌクレオゾーンの形成をモニターし、クロマチンリモデリング複合体のヌクレオソーム結合活性を評価することができます。

さらに、薄層クロマトグラフィーを使用して、TP依存性クロマチンリモデリング複合体のAPA活性を測定することができます。最終的に、これらの方法は、O 80複合体におけるヒトのTP依存性クロマチンリモデリングを測定するために使用できます。このビデオでは、NO 80クロマチンリモデリング複合体を研究する生化学的アッセイを実演します。

同様の方法は、他のクロマチンリモデリング複合体の研究にも適用でき、TP依存性ヌクレオソームリモデリングアッセイを実施するためにも適用できます。まず、表に示されているように100 μLのPCR反応を設定した後、ヌクレオソーム基質を調製します。サーマルサイクラーでPCR反応を行い、反応生成物をヌクレアーゼフリースピンカラムに2回通して、取り込まれていないヌクレオチドを除去します。

次に、50マイクロリットルの緩衝液中に6マイクログラムのヒラルヌクレオソームと標識されたP 32の2つのオールを混合し、30°Cで30分間インキュベートします。次に、混合物を0.8モル、0.6モルおよび0.4モルの塩化ナトリウムに逐次希釈し、それぞれ12.5マイクロリットル、20.8マイクロリットルおよび41.6マイクロリットルのトリスHCL緩衝液を添加し、E-D-T-A-P-M-S-FおよびDTTを添加した後、各添加後に摂氏30度で30分間インキュベートし、最後のインキュベーション後、125マイクロリットルおよび次に250マイクロリットルのトリス塩酸塩緩衝液を添加する。さらに、非負債のP 40グリセロールとPSAを、さらに2回、30分、摂氏30度希釈でそれぞれ0.2モルと0.1モルの塩化ナトリウムに添加しました。

次に、モノヌクレオソーム基質を摂氏4度で最大3か月間保存してから、アッセイキャストのネイティブポリアクリルアミドゲルをセットアップします。次に、実行する各反応について、OH80中の約20ナノモルと、予め冷却されたシリコン処理された中で4.75マイクロリットルの容量を得るのに十分な量のEB100バッファーとを組み合わせます。1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管は、フラクション、IMP粉末ドライアイスを含む残りのNO 80をすぐに再凍結します。

次に、調製したばかりのマスターカクテル5.25マイクロリットルを各反応チューブに分注し、ピペッティングで上下によく混合します。次に、反応を摂氏30度のヒートブロックでインキュベートします。インキュベーションの終わりに、1.5マイクロリットルの新たに調製した除去混合物を各チューブに加えて反応を終了し、次に各反応チューブを混合します。

それらをよくスピンダウンし、摂氏30度でさらに30分間インキュベートします。一方、天然のポリアクリルアミドゲルを垂直電気泳動ユニットで100ボルト、摂氏4度で30分間、0.5 XTBEをランニングバッファーとして使用し、下部チャンバー内の磁気攪拌バーを使用して、インキュベーションの終わりに一定のバッファー循環を維持し、混合物を除去してインキュベーションを終了し、各反応で2.5マイクロリットルのローディングダイを混合します。そして、短時間の遠心の後、ローディングチップを使用してサンプルをゲルにロードします。

緩衝循環を使用して、ゲルを200ボルトで摂氏4.5度で4.5時間泳動します。次に、ゲルを2枚の濾紙の束に移し、透明なラップを使用してゲルを上にした紙のフィルターを落とし、信号を検出します。ゲルを摂氏4度の保存リン酸化スクリーニングに所望の時間露光し、その後、同位体イメージングスキャナーシステムでスクリーンをスキャンし、適切なソフトウェアを使用してデータを分析して、DNAおよびヌクレオソーム依存性APAアッセイを実施します。

まず、免疫精製されたサブ複合体の10〜50ナノモルを、各反応ごとに1つの予め冷却された潤滑された1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに2.2マイクロリットルの容量を与えるのに十分な量のeeb 100バッファーと組み合わせ、その後、粉末ドライアイス中のNO 80含有画分を直ちに再凍結します。次に、DNAヌクレオソームを含む、またはどちらも含まない、またはどちらも含まない作りたての調製したばかりのサブカクテルを、ピペッティングで酵素を含む反応チューブに優しく混合し、チューブを摂氏30度のヒートブロックに移します。次に、鉛筆を使用して、20 x 10ポリエチレンの下端から少なくとも1.5センチメートルの非常に薄い線を引きます。

薄層クロマトグラフィーまたはTLCプレートを意味します。次に、インキュベーション後5分、15分、30分、60分で各反応混合物の0.5マイクロリットルをライン上にスポットし、すぐに各サンプルをヒートブロックに戻すため、1本のチューブから複数のタイムポイントを取得できます。最後のサンプルを塗布した後、ヘアドライヤーを使用してプレートを乾燥させ、プレートを十分な量の入ったガラスチャンバーに移します。

0.375モルのリン酸カリウムを使用して、TLCプレートの底部0.5センチメートルを溶液に浸します。チャンバーを覆い、液相の前面がTLCプレートの上部に達するまで反応を起こさせ、その時点でプレートをすぐにブロードライし、室温で貯蔵リン酸化スクリーンにさらす必要があります。最後に、同位体イメージングスキャナーシステムで画面をスキャンして、TP基板とDP製品の放射性量を決定します。

この最初の実験は、複合体がフラグIESを介して精製されることを実証し、2つのフラグ、N-O-A-T-EおよびフラグNO 80デルタNが同様のヌクレオソーム摺動活性を持ち、NO 80 N末端およびまたはそれに関連するサブユニットがNO 80複合体によるヌクレオソームリモデリングに不要であることを示しています。対照的に、フラグNO 80 delta n delta HSAはこのアッセイでは不活性であり、リモデリング活性がNO 80 APAおよびそれに関連するサブユニットのHSAドメインに依存することを示しています。NUCLEOSOMEスライディングアッセイ手順の修正を使用して、クロマチンリモデリング複合体のヌクレオソーム結合活性を測定できます。

この実験では、NO 80 Eサブユニットを通じて精製された無傷のNO 80複合体の量を増やしながらヌクレオソームをインキュベートすると、遊離モノヌクレオゾーンに対応するバンドが用量依存的に消失し、ゲルの上部近くに移動する新しいシフト種が出現しました。対照的に、ヌクレオソームは、NO 80デルタNを介して精製され、NO 80サブユニットのサブセットを欠く小さな複合体とインキュベートされましたが、シフトした種はより迅速に移動し、スーパーシフトバンドの相対的な移動度は複合体アッセイのサイズによって決定されることを示唆しています。この最終実験では、2つの異なるNO 80サブ複合体のDNAとヌクレオソーム活性化APAs活性を比較するアッセイの結果が示されています。

移動速度が遅いスポットは、TPと標識された開始アルファ32Pに対応し、移動速度が速い種は、溶媒移動の方向を示す領域を持つA DP反応生成物です。これらの手順を使用する際には、時間の長さが異なり、異なる濃度の酵素を含むアッセイを実行することを忘れないでください。これにより、製品の時間と用量反応曲線が線形である場合に測定が行われることが保証されます。

このビデオを見れば、精製クロマチンリモデリング複合体のATTPAのヌクレオソーム結合およびヌクレオソームのスライディング活性の解析方法について十分に理解できるはずです。放射性物質の取り扱いには危険が伴うことを忘れないでください。白衣や目の保護具の着用、放射能汚染の監視、放射性廃棄物の適切な処分などの予防策を講じる必要があります。