ATP依存性クロマチンリモデリング酵素の活性を分析するための生化学的アッセイ

本手順の目的は、TP依存性クロマチンリモデリング複合体のさまざまな生化学的活性を測定することです。これは、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いて、位置指定ヌクレオソームがDNA分子の一端からDNAのより中心に近い位置へとTP依存的にスライドすることを測定することで達成されます。同様のEMSAベースの手法を用いて、リモデリング複合体が結合したモノヌクレオソームの形成をモニタリングし、クロマチンリモデリング複合体のヌクレオソーム結合活性を評価することができます。

さらに、薄層クロマトグラフィーを用いて、TP依存性クロマチンリモデリング複合体のAPA活性を測定することができます。最終的に、これらの手法を用いて、ヒトのNO 80複合体におけるTP依存性クロマチンリモデリングを測定することが可能です。このビデオでは、NO 80クロマチンリモデリング複合体を解析するための生化学的アッセイについて実演します。

同様の手法は、他のクロマチン再構成複合体の研究にも適用でき、TP依存的なヌクレオソーム再構成アッセイを実施することが可能です。まず、表に記載されている手順に従って100 µLのPCR反応系を構築し、ヌクレオソーム基質を調製します。サーマルサイクラーでPCR反応を行い、その後、未反応のヌクレオチドを除去するために、反応産物をヌクレアーゼフリーのスピンカラムで2回精製します。

次に、${}^{32}\text{P}$で標識した601 DNA断片2 pmolを、50 $\mu\text{L}$のバッファー中で1 $\mu\text{g}$のヒストンヌクレオソームと混合し、30 ${}^{\circ}\text{C}$で30分間インキュベートします。その後、EDTA、PMSF、およびDTTを添加したTris-HClバッファー溶液をそれぞれ12.5 $\mu\text{L}$、20.8 $\mu\text{L}$、41.6 $\mu\text{L}$ずつ順次加え、混合液を0.8 M、0.6 M、0.4 Mの塩化ナトリウム濃度に希釈します。各添加後に30 ${}^{\circ}\text{C}$で30分間インキュベートします。最後のインキュベート後、非標識${}^{32}\text{P}$、グリセロール、およびPSAをさらに添加したTris塩酸塩バッファーを125 $\mu\text{L}$および250 $\mu\text{L}$加え、さらに2回、それぞれ0.2 Mおよび0.1 Mの塩化ナトリウム濃度に希釈し、30 ${}^{\circ}\text{C}$で30分間インキュベートします。

その後、モノヌクレオソーム基質を4 °Cで最大3か月間保存し、ネイティブポリアクリルアミドゲルの作製およびアッセイの準備を行います。次に、各反応において、約20 nMのNO 80に適量のEB 100バッファーを加え、あらかじめ冷却したシリコン処理済みの1.5 mLマイクロ遠心チューブ内で合計容量が4.75 µLになるように混合します。NO 80を含む残りの分画は、粉末ドライアイスを用いて直ちに再凍結してください。

次に、調製したばかりのマスターカクテルを各反応チューブに5.25 µLずつ分注し、ピペッティングで十分に混合します。その後、反応液を30 °Cのヒートブロックでインキュベートします。インキュベート終了後、各チューブに調製したばかりの除去ミックスを1.5 µL添加して反応を停止させ、各反応チューブを混合します。

遠心分離した後、30 °Cでさらに30分間インキュベートします。その間に、垂直電泳装置を用いて、0.5 X TBEを泳動バッファーとし、下部チャンバー内にマグネチックスターラーを入れてバッファーを一定に循環させながら、4 °Cで100 V、30分間、ネイティブポリアクリルアミドゲルをプリランさせます。インキュベーション終了後、各反応液に2.5 µLのローディングダイを加えて混合します。短時間遠心した後、ローディングチップを使用してサンプルをゲルにロードします。

バッファーを循環させながら、4 °Cで200 Vにて4.5時間ゲル電気泳動を行います。その後、ゲルを2枚のフィルターペーパーを重ねたものの上に移動させ、信号を検出するため、ゲルを載せたフィルターペーパーを透明なプラスチックラップで包んで密着させます。ゲルをストレージホスホスクリーンに密着させ、4 °Cで任意の時間露光した後、アイソトープイメージングスキャナーシステムでスクリーンをスキャンし、適切なソフトウェアを用いてデータを解析し、DNAおよびヌクレオソーム依存的APAアッセイを実施します。

まず、反応ごとにあらかじめ冷却した潤滑処理済みの1.5 milliliter マイクロ遠心チューブ1本に、10 to 50 nanomolar の免疫精製サブコンプレックスと、最終容量が2.2 microliters になる十分量のeeb 100 bufferを加えて混合します。その後、NO 80を含む分画がある場合は、直ちにドライアイスの粉末中で再凍結させます。次に、DNAヌクレオソームを含む、または含まない、調製直後のサブカクテル2.8 microliters を、酵素を含む反応チューブに加え、ピぺッティングで穏やかに混合し、チューブを30 degrees Celsius のヒートブロックに移します。続いて、20 by 10 ポリエチレンの底端から少なくとも1.5 centimeters の位置に、鉛筆でごく薄い線を引きます。

薄層クロマトグラフィー、すなわちTLCプレートを使用します。次に、インキュベーション後5分、15分、30分、60分の時点で、各反応混合物を0.5 µLずつライン上にスポットします。各サンプルをスポットした直後にヒートブロックに戻すことで、単一のチューブから複数のタイムポイントにおけるサンプルを採取できます。最後のサンプルを適用した後、ヘアドライヤーでプレートを乾燥させ、十分な量の溶媒が入ったガラスチャンバーにプレートを移します。

TLCプレートの下端0.5cmが溶液に浸かるように、0.375molarのリン酸カリウムを加えてください。チャンバーに蓋をし、液相のフロントがTLCプレートの上端に達するまで展開させます。その後、直ちにプレートをブロードライで乾燥させ、室温でストレージホスホスクリーンに感光させます。最後に、アイソトープイメージングスキャナーシステムでスクリーンをスキャンし、放射性a TP基質およびa DP生成物の量を決定します。

この最初の実験では、FLAG-IES 2-FLAG、N-O-A-T-E、およびFLAG-NO 80 delta Nを介して精製した複合体が同様のヌクレオソームスライディング活性を持つことが示されており、これはNO 80のN末端またはその関連サブユニットがNO 80複合体によるヌクレオソームリモデリングに不可欠ではないことを示唆しています。対照的に、FLAG-NO 80 delta n delta HSAを介して精製した複合体はこのアッセイにおいて不活性であり、リモデリング活性がNO 80 APAsのHSAドメインまたはその関連サブユニットに依存していることを示しています。ヌクレオソームスライディングアッセイの手順を改変することで、クロマチンリモデリング複合体のヌクレオソーム結合活性を測定することが可能です。

本実験において、ヌクレオソームを、NO 80 Eサブユニットを介して精製した完全なNO 80複合体の量を増やしてインキュベートしたところ、遊離モノヌクレオソームに対応するバンドが濃度依存的に消失し、ゲルの上端付近に移動する新たなシフト種が出現しました。対照的に、NO 80 delta Nを介して精製され、一部のNO 80サブユニットを欠くより小さな複合体と共にヌクレオソームをインキュベートした場合、シフト種の移動速度はより速くなりました。これは、スーパーシフトバンドの相対的な移動度が複合体のサイズによって決定されることを示唆しています。この最終実験では、2種類の異なるNO 80サブ複合体について、DNA活性化およびヌクレオソーム活性化によるAPA活性を比較したアッセイの結果を示します。

移動速度の遅いスポットは、開始物質である$\alpha ^{32}\text{P}$標識a TPに対応し、移動速度の速い種はA DP反応産物であり、矢印は溶媒の移動方向を示しています。これらの手順を用いる際は、時間の長さや酵素濃度を変化させたアッセイを行うことが重要です。これにより、産生時間および用量反応曲線が直線的な範囲で測定が行われていることを確認できます。

このビデオを視聴することで、精製されたクロマチンリモデリング複合体のTPAにおけるヌクレオソーム結合能およびヌクレオソームスライディング活性の分析方法について、十分に理解できるはずです。放射性物質の取り扱いは危険を伴う可能性があるため、注意してください。白衣や保護メガネの着用、放射性汚染の監視、および放射性廃棄物の適切な処理などの予防措置を講じる必要があります。