高コンテンツ、オープンソースソフトウェアでサポートされているユニバーサル顕微鏡データからの蛍光マーカー、個々の細胞定量のワークフロー

この手順の全体的な目標は、顕微鏡画像から特定の蛍光マーカー強度を定量化することにより、個々の細胞の応答を客観的に測定することです。これは、最初に接着組織培養細胞をirna媒介遺伝子ノックダウンにさらすことによって達成されます。第2ステップでは、細胞を蛍光染色し、次に目的のいくつかのマーカーについてイメージングします。

最後のステップでは、特定の細胞内領域内のマーカーの発現がアルゴリズム的に定義され、個々の細胞です。最終的には、遺伝子ノックダウンによる生物学的な手がかりに対する細胞応答は、目的のマーカーの蛍光発現レベルとその細胞内転座を測定することで解析できます。この手順は、siRNAに応答したGの1つの細胞周期通過の制御についての洞察を提供します。

また、蛍光細胞画像の生成、核輸送、タンパク質の恒常性の研究にも適用できます。手順をデモンストレーションするのは、私の研究室のDaniel WekとCar K HOフェローのポスドクです まず、70マイクロリットルの200ナノモルirnaを分注し、irnaバッファーを希釈して、滅菌組織培養フード内の滅菌96ウェルプレートの適切なウェルに入れます。次いで、40容量の無血清DMEM培地で希釈したトランスフェクション脂質105マイクロリットルをsirの各ウェルに加え、室温の穏やかな振動でプレートを混合し、次いで10分後に、得られた175マイクロリットルをターゲットあたり3回の50マイクロリットルの複製に細分し、透明なベースを有する不透明な組織培養処理96ウェルプレートに調製する。

次に、10%血清を含むDMEMの150マイクロリットルにウェルあたり8,000個の細胞を、混合せずに50マイクロリットルの脂質irna複合体に直接分注します。次に、プレートを滅菌接着剤の通気性メンブレンで密封し、プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%の加湿インキュベーターに入れます。48時間後、プレートからメディアを吸引します。

次に、室温でヒュームフード内の4%バッファーホルムアルデヒドの100マイクロリットルに細胞を固定します10分後、固定剤を吸引し、最後の洗浄後にPBSで100マイクロリットルの洗浄を3回行います。PBSを取り外し、100マイクロリットルの浸透液を室温でそれぞれ10分間のインキュベーションを3サイクル行い、振とうせずに細胞に穿孔します。最後のインキュベーション後、浸透溶液を取り出し、ウェルあたり100マイクロリットルのブロック溶液を室温で30分間加えます。

次に、ブロック溶液を吸引し、20 x 対物レンズで uc 共焦点顕微鏡を標識してから 2 週間以内に、目的の一次抗体 50 マイクロリットルで細胞をプローブし、DNA 色素 GFP および免疫染色に対応する 3 つのチャネルで別々の 16 ビット グレースケール TIFF 画像を撮影します。フローラフォーは、ウェルあたり約1000〜2000個の細胞を画像化するために、多くの非重なり合う画像セットまたはフレームをキャプチャします。メタデータ情報を使用して画像ファイルに体系的に名前を付け、各ファイル名が実験名、ウェルアドレス、フレーム番号、およびチャネル識別子の一意の組み合わせになるようにします。

次に、セルプロファイラーソフトウェアを開き、[ファイル]と[パイプラインのインポート]をクリックします。次に、ファイルから、保存されたファイル名から画像ファイルのメタデータを解釈するソフトウェアに必要な指示を含むファイル3チャンネルパイプラインCPパイプファイルを選択しますConvention Cell Profilerは、画像を関連付けるために使用でき、ファイルから核DNAと抗体強度を抽出し、GFPチャネルを使用して核対細胞質強度の比率を計算することができます。検出されたセルごとに、[出力設定の表示] ボタンをクリックし、デフォルトの入力フォルダとデフォルトの出力フォルダをクリックします。

分析する画像ファイルの場所と抽出されたデータの宛先をそれぞれ選択します。次に、解析モジュールウィンドウで、適切な目のアイコンをクリックして、解析中に [一次オブジェクトの識別] ウィンドウと [三次オブジェクトの識別] ウィンドウを観察し、解析が完了したら [画像の解析] をクリックします。メッセージボックスで[OK]をクリックし、すべてのデータファイルがカンマ区切り値ファイルとして保存されているデフォルトの出力フォルダの場所に移動します。

データ抽出を行うには、Cell Profilerからの出力に含まれる新しい核CSVファイルを見つけます。このファイルには、蛍光核抗体強度核DNA強度とGFP CDKの2つのレポーター比の値に関する個々の細胞データが含まれています。提供されたパルススクリプトファイルを歩行分類器PLの核CSVデータファイルと同じフォルダにコピーします。次に、Pearl Scriptのアイコンをダブルクリックします。

プロンプトが表示されたら、データファイルのフルネームに続けて、細胞をゲートするファイルのDOT CSVファイル名と、抗体蛍光およびG FP CDK 2レポーターデータのゲート値を入力します。新しく作成したファイルが、データの元の細胞プロファイルからの生の個々の細胞アッセイ値と、各ウェルの各細胞が両方のゲートに対してどのように機能するかを示す亜集団ラベルと組み合わされていることを確認します。次に、R Studioソフトウェアを開き、[ファイル]をクリックしてファイルを開くことにより、個々の細胞亜集団ラベルを使用して各実験条件のデータをプロットし、提供された分析ドットrファイルを選択します。

ゲートデータを含むフォルダのコンピュータアドレス(ドライブ文字とファイル自体の名前を含む)を入力します。次に、スタジオの左上のウィンドウで1行目から17行目を強調表示し、実行ボタンをクリックして実験データのしきい値と井戸の位置の詳細を入力します。最後に、17 行目の下にある残りのコードの個々のブロックを強調表示し、[実行] ボタンをクリックして対応するプロットを作成します。

スタジオの右下隅にあるウィンドウでプロットを観察し、エクスポートボタンをクリックして、これらをさまざまな形式で保存します。ここで説明するワークフローでは、蛍光顕微鏡の画像を解析して、同定された各細胞とそれに対応するアッセイ値を詳述したリストの形式で生データを生成します。これらのデータの分析には、多くのオプションがあります。

例えば、これらのヒストグラムプロットでは、コントロールRNAで処理された細胞のアッセイ値により、各アッセイの閾値を決定するための適切なゲートを同定することができます。次に、パルススクリプトを使用してゲーティング閾値を適用し、アッセイ結果に従って生データ中の各細胞を標識します。このラベリングアプローチは、治療と個々の細胞データの非常に大きなセットの亜集団分布との関係を予備的に視覚的に評価するだけでなく、自動的に評価するのに役立ちます。

例えば、この代表的な実験では、3つのirnaノックダウン条件により、2つのアッセイであるゲートに対する細胞の分布が対照的になりました。Rプロットは、ラベルを使用して、各象限のセルのパーセント分布を計算します。また、このラベルにより、追加の蛍光測定値をアッセイデータと相互参照することもできます。

この実験では、SI CDK 6で処理した細胞の亜集団をそれぞれのアッセイラベルに従ってグループ化し、核DNA染色のヒストグラムとしてプロットしました。このように細胞データラベルを使用することで、2つの細胞アッセイと細胞内のDNA含有量との関係が明らかになります。この手順を実行するときは、セルプロファイラーを使用する際に、画像セグメンテーションパラメータをテストおよび調整することを忘れないことを常に重要視することが重要です。

これは、新しい画像ファイルやテストされていない画像ファイルを初めて使用する場合に特に重要です。大丈夫です。