バイオマーカー研究のための次世代組織マイクロアレイ（ngTMA）プロトコル

次の手順の目的は、その後のバイオマーカー研究で使用するための最適または標的組織マイクロアレイを構築することです。まず、代表的な組織スライドからデジタルスライドアーカイブを生成します。関心のある組織学的領域は、組織マイクロレイブロックに転送される対応するドナーブロックの正確な領域を特定するために、デジタルスライドに注釈が付けられます。

組織マイクロアレイの設計とレイアウトが作成された後、ドナーブロックが自動的にパンチされ、原因が組織マイクロアレイにロードされます。この正確で高速な自動化された次世代アプローチを使用すると、正確な組織学的領域や特定の細胞グループを正確に捕捉し、組織マイクロアレイに転写することができます。自家製または半自動デバイスを使用するなど、既存の組織マイクロリングの方法に対する当社の技術の主な利点は、明らかに組織学的精度です。

これは、デジタルパソロジーの強みと組織学の専門知識を組み合わせることによって達成され、今日の手順を示す自動化された組織マイクロリングは、Kalin HammanとJose Galvanです。私たちの研究室からの2つの技術支援スキャンソフトウェアを使用します。まず、明視野スキャンの自動モードを選択します。

次に、スキャンオプションをクリックして、スライド品質パラメータを調整します。次に、スライドスキャンをローカルに保存するか、サーバーパラメータをクリックしてWebフィニッシュに保存するかを選択し、スキャン先をケースセンターに設定します。次に、スライドをマガジンにロードする前にスライドを準備しますスキャナーの場合は、スライドが汚れていないことを確認します。

必要に応じて、それらをきれいにしてください エタノールを使用すると、各マガジンに最大25枚のスライドを装填でき、スキャナーには最大10個のマガジンを装填できます。複数のマガジンは、装填時に積み重ねられます。スライドが読み込まれたら、すべてのスライドとファイル名を指定し、ケースセンターに保存フォルダーを設定します。

次に、緑色の矢印をクリックしてスライドのスキャンを開始します。このセクションでは、スライド上に組織サンプルを打ち抜く位置を、デジタルスライドへの注釈によって設定します。まず、デジタルスライドフォルダを開きます。

表示ソフトウェアでは、フォルダ自体に変更を加えることができます。メモを追加したり、スライドを並べ替えたり、添付ファイルと同様にユーザー権限を設定したりできます。次に、スライドの注釈付けを開始します。

ビューアに表示されます。ビューア内。倍率ツールを使用してスライドを評価し、次世代のTMAに統合するための関心領域を見つけます。

TMA アノテーション ツールを使用して、目的のコアのサイズとアノテーションの色を選択します。この注釈をスライドに添付するには、スライドをクリックします。次に、アノテーションを目的の組織構造に移動します。

これらの注釈は、対応する組織ブロックのパンチ位置をマークします。すべてのスライドに注釈が付けられるまで、このプロセスを繰り返します。組織の原因に対する別のオプションは、分子分析のために組織を0.2ミリリットルのPCRチューブに送ることです。

スライドに異なるカラーマークを使用して注釈を付け、これらのスポットをTMAのスポットと区別します。すべての注釈を作成したら、すべてのスライドのリストと、対応する注釈、および注釈の色を含むスプレッドシートファイルを保存します。組織のマイクロ再構築を開始するには、注釈付きすべてのデジタルスライドに対応するパラフィン組織ブロックを取得します。

ドナーブロックと呼ばれます。ブロックをデジタルスライドと同じ順序に並べ替えます。各ブロックの厚さが少なくとも4ミリメートルであることを確認してください。

そうでない場合は、コンピューターで組織を再発明する必要があります。ソフトウェアのtissueマイクロアレイを開き、プロジェクトの名前を入力します。工具交換に移動し、必要な工具径を選択します。

次に、最大12個の受信者ブロックをマシンにロードします。ブロック名をメモします。一貫性を保つために、すべて同じ番号付けシステムを使用してラベルを付ける必要があります。

次に、ソフトウェアで、各ブロックに適切な名前を割り当てて、TMAレイアウトを作成します。まず、パンチの行数、列数、空行数、間隔を割り当てて、新しいTMAデザインを作成します。レイアウトを保存し、ブロックに割り当てます。

次に、次のブロックに対してこのプロセスを繰り返します。新しいレイアウトまたは同じレイアウトでは、受信者ブロック間でコアサイズを変えることができます。次に、最大60個のドナーブロックをマシンにロードします。

各行には最大10個のブロックが収まります。AからF.Remaining donerブロックは、後でソフトウェアにロードされます。各ドナーブロックに識別名を付けます。

各ブロックの画像が自動的に取得されます。次に、デジタルスライドを対応するドナーブロックに位置合わせします。まず、ブロックを選択します。

次に、スライドをクリックして、スライドとブロックの画像を並べて比較します。ドナーブロック画像上で、対応するデジタルスライド上の特定の点に対応する参照点を選択します。次に、[次へ]をクリックすると、注釈がドナーブロックの画像に移動します。

注釈が正しい場合は、各注釈をクリックしてその位置を確認します。次に、[開始]をクリックします。これにより、マイクロアレイは受信者ブロックの基準点に穴を開け、次にドナーブロックから同じ場所に穴を開けて、コアを受信者ブロックに転送します。

コアをA PCRチューブに収集するには、ブロックのPCRツールをクリックします。最大4つのアノテーションを使用して、チューブに組織を供給することができます。設定が完了したら、開始をクリックすると、ドナーが呼び出され、チューブがロードされます。

機械がドリルで穴を開け、コアを打った後、ドナーブロックのイメージを更新します。次のブロックの整列と注釈の繰り返しに進みます。次に、コアを作成します。

これをすべてのドナーブロックに対して続けてください。それはTMAにあります。最初の60個のドナーブロックが完成したら、それらをアンロードしてさらに60個のブロックをロードします。

すべてのドナーブロックが配列されるまで、このプロセスを続けます。約500コアを取った後、ドリルを掃除すると、パンチングツールがxleになります。配列が完成したら、プロジェクトをエクスポートします。

プロジェクトデータを含むスプレッドシートファイルがエクスポートフォルダにあります。各TMAブロック内の各サンプルの位置が表示されます。次に、注釈が重ねられたドナーブロック画像をJPEGファイルとしてエクスポートフォルダーに保存します。

これで、TMA ブロックの生成プロセスは完了です。この TMA レイアウトは、配列を埋めるために 12 個の最終ブロックに対して 2 つのコピーで構築された 6 つの NG TMA ブロックを示しています。各腫瘍ブロックには402個の組織スポットが含まれ、各正常組織ブロックには268個のスポットが含まれていました。

60のドナーブロックに注釈が付けられた後、原因が打ち出されました。コア転送時間は約12秒でした。コアの損失は最小限に抑えられ、このプロジェクトのアレイの合計時間は全体で約 24 時間でした。

これには、N-G-T-M-Aのプロセス後、その後の分子分析の原因を打ち抜くのにかかった時間が含まれていました。これらの組織マイクロアレイには、細胞ハイブリダイゼーションにおける免疫組織化学、さらには特殊な染色などの他の方法を適用することで、異なる組織で発現または変化する遺伝子やタンパク質などの疑問に答えることができます。