トラブルシューティングの方法と現代の定量的蛍光ウェスタンブロッティングへのガイド

この手順の目標は、定量的な蛍光ツイストおよびブロッティングを使用して、複雑な生物学的サンプル内の特定のタンパク質の相対的な存在量を検出し、正確に定量することです。これは、プレキャストグラジエントゲルを使用して、最初に電気蛍光で分離するタンパク質抽出物によって達成されます。第2ステップでは、全タンパク質染色剤の適用により、すべてのサンプルレーンで同等のタンパク質負荷量を検証し、次にアイブロックセミドライ高速転写システムを使用してサンプルをA-P-V-D-Fメンブレンに移します。

最後に、タンパク質を特異的な一次抗体でプローブし、続いて適切な蛍光タグ付き二次抗体でプローブし、赤外および遠赤の波長での高感度で堅牢で直線的な検出を促進します。最終的には、定量的な蛍光ウェスタンブロッシングを使用して、広範囲の組織サンプルにわたって多数の膜結合および可溶性タンパク質を再現性よく検出、視覚化、および正確に定量することができます。ECLベースのイメージングなどの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、それが組織サンプルを手動で浸軟させることから始め、続いて、滑らかで一貫した均質化が生成されるまで、バッファーボリュームあたり約1〜10組織重量で新たに調製された抽出バッファーで均質化することにより、広範囲の線形スケールで精度を高めてより高い感度を可能にすることです。

次に、細胞溶解物を摂氏4度でGの20,000倍で20分間遠心分離します。次に、可溶化したタンパク質を含むセートを清潔なマイクロ遠心チューブに移し、ペレットとS上清画分の両方を必要なまで摂氏マイナス80度で保存します。穿孔器のタンパク質濃度を決定した後、サンプルあたり15マイクログラムのタンパク質を新しいマイクロ遠心チューブに移します。

次に、各サンプルの最終容量を蒸留水で最大10マイクロリットルにし、5マイクロリットルのForexローディングバッファーを追加します。ボルテックスにより細胞溶液を十分に撹拌し、次いでサンプルを摂氏98度で2分間加熱してタンパク質を変性させる。変性後、適切な分子量標準試料の3マイクロリットルを、実験用およびローディングコントロールゲルのそれぞれの第1ウェルに加えます。

その後、電気泳動後、各サンプルの10マイクロリットルを適切な後続のウェルにロードします。ゲルナイフを使用してカセットからゲルを放出し、ウェルとゲルの足を取り除きます。後で向きを決めるのを助けるために、ゲルに印を付けます。

次に、等価タンパク質負荷デカントを決定するために、約30ミリリットルのタンパク質染色を正方形の12 x 12センチメートルのペトリ皿に染色し、ローディング制御ゲルを染色剤に入れ、溶液がゲル全体を覆うようにします。ゲルを室温で最低1時間静かに撹拌し、その後、タンパク質染色剤を廃棄し、ゲルを蒸留水で3回洗浄してから、アイブロックを視覚化します。2つのセミドライ高速タンパク質転写 電気泳動後、ホイルカバーを取り外し、ゲルタンクから直接ランニングバッファーでメンブレンを事前に濡らして、下部の転写スタックを準備します。

このときも濾紙を蒸留水で再湿らせます。次に、実験用ゲルを準備した下部の転写スタックにひもで締め、次に、作業前の濾紙をゲルの上に置き、両方を転がして、層間に気泡が閉じ込められないようにします。濾紙と下のスタックの上に一番上のスタックを置きます。

次に、トランスファースタックサンドイッチを転がして気泡を取り除きます。トランスファースタックキットのスポンジを吸収パッドに挿入し、トランスファースタックサンドイッチを専用スペースに置きます。次に、蓋をしっかりと閉め、Iブロック2を開始し、プログラム3でタンパク質を7分間移します。

プログラムが終了したら、アイブロックマシンからトランスファースタックを取り外し、上部のトランスファースタックとフィルターペーパーの層を剥がして、下部のトランスファースタックのゲルを露出させます。転写効率の蛋白質の汚れを確認するために膜のトリミングに続いて膜上の配向目的のために三角形のカットを作るように注意しながら、ゲルの周りを切断するためにメスを使用し、ゲルはちょうど示されたように、その後迅速に膜を5ミリリットルのPBSを含むきれいな50ミリリットルのチューブに移動させた3つの最初のもののために、 機械式ローラーで5分間洗浄します。3回目の洗浄後、洗浄バッファーを廃棄し、メンブレンを希釈されていないブロッキングバッファーで室温で最低30分間インキュベートします。

次に、5ミリリットルのブロッキングバッファーと0.1で希釈した一次抗体でメンブレンをインキュベートし、摂氏4度で一晩、絶えず攪拌しながらインキュベートします。一次抗体溶液を廃棄した翌朝、先ほど示したように、メンブレンをPBSで5分間6回洗浄します。次に、蛍光タグ付き二次抗体を暗所でメンブレンをインキュベートし、5ミリリットルのブロッキングバッファーと0.1%で20の間で拡張し、一定の攪拌を行い、その後、すべてのイメージングについて5分間のPBS洗浄を6回行います。

まず、コンピューターとイメージャーにログインします。次に、イメージングソフトウェアを開いてウェスタンブロットをイメージングします。まず、イメージャーの蓋を開けて、ガラスに少量のPBSを注ぎます。

イメージャーの左下隅で、メンブレンをPBSの上に置き、イメージャーの軸と正方形になり、メンブレンとグリッド軸の間に1センチメートルの隙間が残っていることを確認します。メンブレンを転がして、ガラスとメンブレンの間に気泡が挟まらないようにしてから、メンブレンがx軸とy軸で占める正方形の数を数えます。次に、イメージャーの蓋を閉め、コンピューターソフトウェアに正方形の数を入力します。

適切な赤外線チャネルと適切な強度を選択し、スキャンを開始してローディングコントロールゲルの総タンパク質染色を視覚化します。実験用メンブレンで示したようにゲルとイメージャーを修復し、700チャンネルを選択します。強度を5に設定し、スキャンを開始します。

スキャンデータを定量化します。まず、スキャンしたファイルの明るさとコントラストのボタンを調整して最高の画質を実現し、目的の向きを達成するために必要な画像を回転させます。次に、形状メニューから長方形を選択し、それを使用してレーン全体に長方形を描画します。

サンプルレーン1。レーン 1 の周りの形状をコピーして、サンプル レーン 2 に貼り付けます。バックグラウンド測定で信号が次のレーンに組み込まれていないことを確認したら、残りのサンプルレーンの各レーンを囲む長方形を描きます。

次に、任意の蛍光単位で描画された各長方形のシェイプテーブルの信号を表示し、画像をtiff胆汁として保存します。定量的蛍光ウェスタンブロッティング中に正確なデータを収集するためには、いくつかの制御手段が重要です。例えば、ポジティブコントロールサンプルを含めることが望ましい。

次に、ゲルからメンブレンへの高分子量タンパク質と低分子量タンパク質の等価な移動を保証するために、転写時間を最適化することが重要です。第三に、これらの画像に示されているように、非特異的なバンディングによる目的のタンパク質の誤った解釈を避けるために、適切な一次抗体および二次抗体の希釈を決定する必要があります。第4に、特に期待されるタンパク質バンドが検出されない場合に、異なる宿主分子種で産生された二次抗体が必要かどうかを検討することが重要です。

第五に、ローディングコントロールゲルの製造により、サンプルロードの均一性を確認できます。全タンパク質分析と組み合わせると、ゲルを使用して、各サンプルに対して測定したさまざまな分子量範囲での各レーンのタンパク質負荷を比較および定量化できます。最後に、この技術は、感度の向上、バックグラウンドの低減、デュアルカラー検出、長期保存条件下での膜安定性などの要因により、ケミルミネッセンスよりも柔軟性のある膜のストリッピングおよび再プローブに適しています。

このビデオを見れば、定量的蛍光ウェスタンプロットを使用して目的のタンパク質を検出し、正確に定量する方法や、この手法を実行する際に発生する可能性のある一般的な問題のトラブルシューティング方法について十分に理解できるはずです。