Name: 強化された骨形成のためのヒト脂肪由来間質細胞の単離および濃縮 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学ぶ ヒト脂肪由来間質細胞の単離法。フローサイトメトリーで骨形成能の高い細胞集団を同定し、再生医療や頭蓋顔面骨再建への応用を可能にする技術を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、MTLに健康研究助成R01-DE021683-01と健康研究助成金R01-DE019434の国立衛生研究所の国立研究所によってサポートされていました。 MTCDCWにハワード·ヒューズ医学研究所研究員は、ACSフランクリン·マーティン学部研究フェローシップ、小児再生医療のためのHagey研究所、スタンフォード大学小児保健研究所学部奨学生賞によってサポートされていました。

注：すべての患者の試料はインフォームドコンセントを得て、実験的なプロトコルは、スタンフォード大学の治験審査委員会（プロトコル＃2188と＃9999）によって審査され、承認された。 1.細胞の単離および培養： <ol><li>一般/局所麻酔下で腹部、脇腹、および/または大腿部領域の選択科目lipoaspirationを受けた健康女性患者からのヒト皮下脂肪組織を入手します。治験審査委員会（IRB）の承認は、人間の組織からのASCを単離するプロトコルのために得られていることを確認し、そのような材料での作業中に制度的安全上の注意に従ってください。 </li><li> lipoaspirated脂肪組織からSVFを得るために、最初の1倍の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）等容量の脂肪吸引物を3回洗浄する。慎重に吸引し、底の水層を捨てる。 </li><li>私はハンクのコラゲナーゼ0.075％の種類：コラゲナーゼ消化緩衝液を準備平衡塩類溶液（HBSS）。 FACS緩衝液を準備します。PBS中の2％FBS、1％のP188と1％のペニシリン - ストレプトマイシンを。市販の0.22μmの細孔サイズ速い流れのポリエーテルスルホンフィルターを使用して両方のソリューションをフィルタリングします。 </li><li>洗浄した脂肪組織を消化するために、37°C​​（約180シェイク/分）で60分間、振盪水浴中でしっかりと消化槽をコラゲナーゼ消化緩衝液の等量を追加して配置する。 注：これは、必要とされるよりも、これは（ すなわち 、コラゲナーゼ消化緩衝液の250ミリリットル、1リットルの滅菌フラスコ内の洗浄した脂肪組織の250ミリリットル）しながら中に最大の消化を可能にするので、より大きな容積消化容器を使用するのが最適です。 </li><li> FACS緩衝液の等量を添加し、室温で5分間静置させることによって酵素活性を中和する。次に、4℃で20分間233×gで遠心。 </li><li>慎重に吸引し、高密度SVFペレットを乱さないように注意しながら、上清を捨てる。 </li><li> RT赤5〜10mlの中でペレットを再懸濁ペレットサイズに基づいて、細胞溶解緩衝液。 RTで5分間233×gで5分間遠心分離を室温で座って解決のままにしておきます。 </li><li>上清を吸引し、ペレットの大きさに基づいて、伝統的な増殖培地5〜10mlの添加することによりペレットを再懸濁（ダルベッコ改変イーグル培地[DMEM] / 10％FBS / 1％ペニシリン - ストレプトマイシン溶液[ペンストレプトマイシン]）。 </li><li>細胞破片を除去するためには100μmナイロン細胞ストレーナーを通してサスペンションをフィルタリングします。 </li><li> 4℃で5分間233×gで遠心分離し、ペレットを中断することなく、上清を捨てる。 </li><li>ペレットサイズに基づいて、伝統的な増殖培地5-10中にペレットを再懸濁。 </li><li> 15センチメートル標準培養皿に2×10 6個の細胞を配置し、O / N 37°C / 21％O 2、5％CO 2で初代培養を確立する。増殖培地中で37℃/ 21％O 2、5％CO 2での自発的な分化を防止するために、サブコンフルエントなレベルに維持する。 注：完全に中の細胞密度コンフルエント15cmのプレートは、約4-6×10 6細胞である。 </li></ol> 2.染色<ol><li>ソート/染色前36時間、37℃/ 21％O 2、5％CO 2、伝統的な増殖培地中での培養のASC。 </li><li> （製造業者のプロトコルに従って）のAccutaseを用いて培養プレートからリフトのASC。 </li><li>一度（2％FBSおよび1％のペン - ストレプトマイシンを含むPBS）をFACS緩衝液で細胞を洗浄する。 </li><li> 4℃で5分間233×gで遠心し。 </li><li>ペレットを中断することなく、上清を捨てる。 FACS緩衝液0.5〜1 mlの細胞を再懸濁し（細胞数および所望の抗体の量に依存する）。 注：細胞懸濁液の体積は、FACS抗体製造業者の推奨に従って、抗体濃度を決定する。しかし、1の開始濃度を用いて抗体濃度の滴定、：それは抗体を使用する最初の時間であれば100は、通常は推奨されている。 </li><li>の合計数血球計数器を用いて細胞。 </li><li>未染色試料および単色のコントロールのために使用されて1.5 ml遠心管中で予備100μlのアリコート（使用する蛍光抗体の数に応じて）。 </li><li> （製造者の指示に従って、所定の濃度で）適切な蛍光標識されたモノクローナル抗体を追加し、遮光し氷上で20〜30分、インキュベートする。 <ol><li>骨形成亜集団にラベルを付けるには：1：50の濃度になるようにFACS緩衝液中の抗CD90（APC抗ヒトCD90（はThy1））または抗CD105（FITC抗ヒトCD105（エンドグリン））を希釈します。 </li><li>他の細胞集団（ 例えば 、造血および内皮細胞）を標識する：希釈した抗CD45（抗ヒトCD45パシフィックブルー）、抗CD34（抗ヒトCD34 APC）、および/ ​​または抗CD31（抗ヒトCD31 PE ）FACSで1時50分の濃度にバッファー。 </li><li>直接結合した抗体を使用していない場合は、適切なストレプトアビジン結合第二に、ビオチン化一次抗体を使用する100：そのような1の希釈でストレプトアビジンPE-Cy7は、などの進の抗体。 </li></ol></li><li>インキュベーション後、細胞を2回洗浄する。上清を吸引し、4℃で5分間、233×gでFACS緩衝液および遠心機でチューブを埋める。 </li><li>細胞塊を除去するために70μmのナイロン細胞ストレーナーを通して400〜500μlのFACSバッファおよびフィルタサンプル中の細胞を再懸濁。 </li><li>フィルタートップでFACSチューブに標識細胞を移し、分析の間、サンプルを氷上で維持する。 </li></ol> 3.蛍光活性化細胞ソーティング注：以下の手順では、蛍光活性化細胞選別（FACS）または熟練した技術者の支援に予備知識を義務付ける。 <ol><li>前方散乱（FSC）、側方散乱（SSC）を調べるために、設計解析プロットを適切なFACSソフトウェアを使用して、フィコエリトリン（PE）-Texasレッド、パシフィックブルー、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、アロフィコシアニン（APC）および任意の他のフルオロフォアの使用dは細胞を標識する。 </li><li>セルソーター、簡単に渦に細胞を再懸濁するために、各サンプルをロードする前に。 </li><li>細胞破片を排除するために、ベースライン自己蛍光を決定するために、全細胞集団のためにゲートを設定するために、未染色試料の分析を開始する。 </li><li>未染色試料にヨウ化プロピジウム（PI）を追加し、全細胞集団内の生細胞の集団を可視化するためにそれを分析する。この集団の周りにゲートを構築します。 </li><li>蛍光補正を行うために、各蛍光色素のための単色対照試料を分析する。 </li><li>ソートにゲートの位置を設定するための染色サンプルを分析します。 </li><li>死細胞を染色するために、染色されたサンプルにPIを追加します。 </li><li>標識された細胞集団をソートします。ソート培地を含む1.5 mlの遠心チューブまたは円錐管（15ml）中のどちらかに変換する。 </li><li>手動での細胞の必要量が得られた後に選別止める。 </li><li>私達取得された細胞集団のFACS、ごく一部分析することによって、高純度チェックを行う（ 例えば 、500細胞）る。 注：この手順はソートされた細胞集団の純度を確認した。理想的には、純度が90〜95％より大きくなければならない。 </li><li> 10％FBSを含む新鮮な培地1mlにソートし、再懸濁の4°Cの直後の終了で5分間233×gで遠心分離細胞。 注：使用される媒体の量は、細胞ペレットのサイズに基づいて増加させることができる。 </li><li>ゼラチン被覆プレート上のプレートは、細胞生存率を改善する。最終的な細胞収量に応じて、6ウェルプレート中の12ウェルプレートでウェル当たり100,000細胞を、ウェル当たり300,000細胞をプレーティング。 </li></ol>

<ol><li>Narsinh, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).</li>
<li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298, 580-584 (2002).</li>
<li>Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+profiling+in+individual+hematopoietic+progenitors+by+digital+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).</li>
<li>Warren, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+instability+is+not+a+universal+attribute+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional instability is not a universal attribute of aging.</a> Aging Cell. 6, 775-782 (2007).</li>
<li>Aalami, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+mouse+model+of+calvarial+healing%3A+differences+in+regenerative+abilities+of+juveniles+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults.</a> Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD105+protein+depletion+enhances+human+adipose-derived+stromal+cell+osteogenesis+through+reduction+of+transforming+growth+factor+beta1+%28TGF-beta1%29+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling.</a> The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).</li>
<li>Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+antigen+expression+by+cells+in+the+osteoblast+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage.</a> J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).</li>
<li>Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+vitamin+D%2C+retinoic+acid%2C+and+dexamethasone+in+mouse+adipose-derived+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells.</a> Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depot-specific+variation+in+the+osteogenic+and+adipogenic+potential+of+human+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+reconstructive+surgery%22%5BJournal%5D)">Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells.</a> Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).</li>
<li>James, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen%2Festrogen+receptor+alpha+signaling+in+mouse+posterofrontal+cranial+suture+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion.</a> PloS one. 4, e1720(2009).</li>
<li>Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+human+adipose-derived+stem+cells%3A+separating+promise+from+clinical+need%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need.</a> Stem Cells. 29, 404-411 (2011).</li>
<li>Glotzbach, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Information+Theoretic%2C+Microfluidic-Based+Single+Cell+Analysis+Permits+Identification+of+Subpopulations+among+Putatively+Homogeneous+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells.</a> PLoS One. 6, e21211(2011).</li>
<li>Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+isolation+of+adipose-derived+stem+cells+from+human+lipoaspirates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates.</a> J. Vis. Exp. , e50585(2013).</li>
<li>Mitchell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotype+of+human+adipose-derived+cells%3A+temporal+changes+in+stromal-associated+and+stem+cell-associated+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers.</a> Stem Cells. 24, 376-385 (2006).</li>
<li>McMurray, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+surfaces+for+the+long-term+maintenance+of+mesenchymal+stem+cell+phenotype+and+multipotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency.</a> Nat Mater. 10, 637-644 (2011).</li>
<li>Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+and+transcriptional+characterization+of+human+adipose-derived+adherent+stromal+%28hADAS%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells.</a> Stem Cells. 23, 412-423 (2005).</li>
<li>McIntosh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunogenicity+of+human+adipose-derived+cells%3A+temporal+changes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro.</a> Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).</li>
<li>Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+age+negatively+impacts+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation.</a> Journal of translational medicine. 12, 8(2014).</li>
<li>Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem%2Fprogenitor+cells%3A+roles+in+adipose+tissue+remodeling+and+potential+use+for+soft+tissue+augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation.</a> Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).</li>
<li>Chung, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90+%28Thy-1%29+Positive+Selection+Enhances+Osteogenic+Capacity+of+Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells.</a> Tissue Eng Part A. , (2012).</li>
</ol>

著者のいずれも、この原稿に記載されている製品、デバイス、または薬物のいずれかに経済的利害関係を有していない。著者のいずれも、報告するためのあらゆる競合する経済的利害関係を有していない。

現在、ヒト脂肪組織のSVFからASCの均質な亜集団の単離は、望ましい目標ものの依然として厳しい。このような細胞は、骨格組織の形成および恒常性を研究するために使用することができるようにプロ骨形成ASC亜集団の単離は、特に望ましい。しかし、脂肪組織のSVFは、セル容量と分化能を食い止めるに関して有意な異質性を保有する。11この異質性の分子基盤は、細胞のプールされた集団から理解され、その代わりに、単一細胞分析を必要とすることはできない。12このアプローチでは、表面マーカー密接にASCの骨形成分化能に関連付け識別することができる。 ASCの成功濃縮のための最も重要な要因は、上記の方法に記載のように、FACSのために使用する抗体に関連している。一つは、CELに対して高い親和性を有する抗体を選択することが賢明である必要があります当該リットル表面マーカー。理想的には、このように複数のステップと、細胞死、細胞損失およびエラー発生主義の増加可能性を必要とする間接的な染色方法とは対照的に、一次複合抗体であるべきである。さらに、FACS中の軽微な変更は、細胞...

幹細胞集団の不均一な性質はまだ完全には理解されておらず、臨床的に効果的な幹細胞ベースの治療アプリケーションの開発に対する主要な障害となっています。幹細胞の不均一な集団を特徴付ける最も一般的な方法の1つは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)などの細胞ソーティング法を採用して、表面マーカー発現プロファイルに基づいて細胞を分離することです。ソーティング方法が複雑になるにつれて、細胞のより明確な機能的亜集団を同定することが可能になります。マイクロ流体ベースの技術は、シングルセルレベルでの遺伝子発現の解析にますます頻繁に利用されるようになっています。マイクロ流体チップ内のマルチプレックス定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)により、効果的かつ信頼性の高い高分解能のシングルセル転写解析が可能になります。1-5
48遺伝子の単一細胞転写プロファイリングを使用した以前の研究では、ASC間でかなりの転写不均一性が観察されました。6 しかし、遺伝子MSX2、BMP-5、BMP-7、ALP、OCN、RUNX2の分布は、骨形成性の高い転写プロファイルを持つ細胞群と強い関連を示した。この骨形成遺伝子発現プロファイルに従って細胞を単離するために、表面抗原発現パターンは転写パターンと相関し、その後、エンドグリン(CD105)の表面マーカー発現がASCの骨形成分化能の増強と密接に相関することを発見しました。CD105の発現とは無関係に、Chenらが以前に骨前駆細胞と関連していることを示したグリコシル-ホスファチジルイノシトール結合膜タンパク質である表面受容体Thy-1(CD90)の発現も、骨形成遺伝子の発現と相関していました。6,7 これらの知見は、細胞ベースの骨組織工学アプリケーションのための骨形成能力が増加したASCのより大きな不均一なプール内の亜集団を前向きに分離する機会を提供します。

<table><tbody><tr><td>使い捨て 250 ml コニカルチューブ</td><td>コーニング (Thomas Scientific)</td><td>2602A43</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、GlutaMAX サプリメント</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS、pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Betadine - 消毒剤 ポビドン/ヨウ素溶液</td><td>Purdue&nbsp;</td><td>PFC-67618015017</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution, 1X</td><td>Cellgro</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ from&nbsp;Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-5G</td><td></td></tr><tr><td>ACCUTASE 細胞剥離溶液</td><td>幹細胞技術</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>APC マウス 抗ヒト CD90</td><td>BD Pharmingen</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>FITC マウス 抗ヒト CD105 (エンドグリン)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561443</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD45 eFluor 450 (パシフィックブルーの代替品)&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>48-9459-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD34 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0349-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II instrument</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

強化された骨形成のためのヒト脂肪由来間質細胞の単離および濃縮

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

骨髄由来間葉系間質細胞(BM-MSC)は、幹細胞ベースの組織工学アプリケーションのゴールドスタンダードと考えられています。ただし、それらを収穫しなければならないプロセスは、ドナーサイトの重大な罹患率と関連している可能性があります。対照的に、脂肪由来の間質細胞(ASC)は、より豊富に存在し、より簡単に採取できるため、BM-MSCの魅力的な代替品となっています。BM-MSCと同様に、ASCは骨形成系譜細胞に分化することができ、頭蓋顔面骨格欠損に使用するための足場への播種などの組織工学用途に使用できます。ASCは、ASC、血管内皮細胞および壁細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、線維芽細胞、および循環細胞の不均一な混合物である消化脂肪組織の間質血管画分(SVF)から得られます。フローサイトメトリー解析により、ASCの表面マーカープロファイルはBM-MSCと類似していることが示されています。ASC表現型のマーカーを確立するいくつかの発表された報告にもかかわらず、この不均一な集団の骨前駆細胞を特定するプロファイルについては、まだコンセンサスが不足しています。このプロトコルでは、骨形成能力が強化されたASCの亜集団を分離して使用し、臨界サイズの頭蓋骨欠損を修復する方法について説明します。

ヒトASC（ 図1A、1B）の高濃縮集団の単離に強化された骨形成の結果と細胞のマーカーとしてCD90を使用した。 ASCははパシフィックブルー結合抗ヒトCD45、FITC結合抗ヒトCD105、およびAPC結合抗ヒトCD90で染色した。ポストソート分析によって定量しソートした後、純度のレベルは、98％以上であった。 2つの新規な亜集団の将来の単離のために許可された転写プロファイルに基づいてセルのグループを定義する。以前に6,8,9のように各有望亜集団（ 低 CD90 +及びCD105）の骨形成能、ならびにそれのin vitroでのソートされていない集団を特徴付けるために、細胞は、14日間骨形成分化培地で培養した。 7日目（骨形成10の早期検出のために使用される）、アルカリホスファターゼ染色が有意にCD90 +に増加した他のグループ（ 図2A）にSUP&gt;人口の相対的。これは、両方の肉眼...

ヒト脂肪由来の間質細胞内の転写の不均一性は、細胞表面マーカーと骨形成遺伝子を使用して単一細胞レベルで定義することができます。 骨形成能力が増加した細胞亜集団の単離にフローサイトメトリーを利用したプロトコルについて説明し、これは頭蓋顔面骨格再建を強化するために使用できます。

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

この手順の全体的な目標は、これを達成するために、フローアシストサイトメトリーを使用して骨形成能力が増強されたヒト脂肪由来幹細胞の亜集団を分離することです。ヒト脂肪由来幹細胞またはASCSは、ヒト脂肪吸引液から採取され、36時間培養されます。次に、骨形成集団を標識するために選択された抗体で細胞を染色し、フローアシストサイトメトリーを使用して目的の集団を単離します。最終的に、アルカリホスファターゼとアザリン染色は、単離された細胞の骨形成能力の向上を明らかにします。この技術の意味は、骨形成が強化されたASCの亜集団を分離する方法を説明しているため、再生医療と新しいトランスレーショナルセラピーの開発にまで及びます。次の手順は、局所麻酔または全身麻酔下で腹部、脇腹、または大腿部領域の選択的脂肪吸引を受けた健康な女性患者のヒト皮下脂肪組織を使用して行われます。手術室から直接採取した吸引キャニスターに500ミリリットルから1リットルの組織から始めます。収集後すぐに、収穫手順を開始します。これにより、細胞生存率が最大化され、脂肪吸引脂肪組織から間質血管画分またはSVFが得られます。次に、キャニスターを静かに振って混ぜます。混合後。溶液が3つの層に分離するまで放置します。上部の油層は透明で黄色です。真ん中の脂肪層は粘性があり、不透明で黄色で、下の血液層は赤です。血清学的に慎重に使用し、ピペットで、下の血液層を吸引して廃棄し、上の油層を吸引します。次に、これを繰り返します。さらに2回洗います。添付文書に記載されているようにコラゲナーゼ消化バッファーとファックスバッファーを調製した後、赤血球溶解バッファーと一緒にフードに入れ、室温まで温めます。次に、洗浄した脂肪組織を大きなフラスコに移し、等量のコラゲナーゼ消化バッファーで消化します。フラスコを振とうのある水浴に60分間しっかりと入れます。摂氏37度で。必要以上に大容量の消化容器を使用すると、振とう中に最大の消化が可能になります。例えば、250個のコラゲナーゼ消化緩衝液と250mlの洗浄脂肪組織を滅菌済みの1リットルフラスコに入れる必要があります。インキュベーション後、等量のファックスバッファーを添加し、組織を室温で5分間放置することにより、酵素活性を中和します。次に、消化組織を250ミリリットルの使い捨て円錐形遠心チューブに移し、233Gで、または摂氏4度で20分間遠心分離します。スピン後、仰臥位を吸引し、5〜10ミリリットルの従来の成長を追加してペルペレットを再懸濁します。ペレットのサイズに応じて、中程度。次に、懸濁液を100マイクロメートルのナイロンセルストレーナーを介して50ミリリットルの円錐形チューブにピペットで移し、細胞の破片を取り除きます。上澄みを捨てると、パレットは図のように表示されます。ここで、リースは、室温の1

isolation-enrichment-human-adipose-derived-stromal-cells-for-enhanced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このプロトコルは、吸引脂肪や骨格再生を評価するための重要な4ミリメートルサイズの頭蓋冠欠損の作成から脂肪由来の間質細胞の単離を説明します。...

吸引脂肪から採取した脂肪由来間質細胞を使用したクリティカル·サイズの頭蓋冠欠損モデルの修復

2001年には、UCLAの研究者は、成体幹細胞の集団の単離を説明した脂肪組織から、脂肪由来幹細胞またはASCをと呼ばれる。この記事では、コラゲナーゼを使用して手動、酵素消化プロトコルを使用して脂肪吸引物からASCの分離の概要を説明します。...

人間の脂肪吸引物からの脂肪由来幹細胞を手動で隔離

このプロトコルは、ブタ脂肪由来幹細胞（pADSC）の皮下脂肪組織からの単離を、多能性の検査とともに説明するものです。多能性pADSCは、脂肪細胞の分化過程を描写し、中胚葉間葉の複数の細胞系統、または再生研究のための外胚葉および内胚葉のさらなる系統への分化転換を研究するために使用されます。...

ブタ皮下脂肪組織から分離し、脂肪由来幹細胞の分化

脂肪由来の間質細胞は、患者自身の細胞から新しい組織を改変するのに役立つかもしれません。骨形成能力が増加したヒト脂肪由来間質細胞(ASC)の亜集団を単離し、続いてin vivo calvarial...

頭蓋冠欠損治癒モデルで使用するためのBMPR-IB +脂肪由来間質細胞の迅速な単離

ビタミン C (ビタミン C)、1, 25-ジヒドロキシ ビタミン D [1,25-(OH)2D3] による骨膜由来細胞 (Pdc) の mRNA 発現バイオ マーカーを調査するためのプロトコルを提案します。また、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞に分化する Pdc...

人間歯槽骨膜から骨膜由来細胞の骨形成促進活性に及ぼすビタミン D の間葉系幹細胞の分離

白とベージュの脂肪細胞脂肪組織血管前駆細胞からの分化は、肥満の代謝改善の可能性を負いません。CD31 cd34 陽性 + + 人間の脂肪から内皮細胞分離および後続の in vitro拡張と白とベージュの脂肪細胞への分化のプロトコルについて述べる。いくつかのダウン ストリーム...

分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

このプロトコルは、腹筋形成術および脂肪吸引試料から間葉系幹細胞を切除するための酵素フリーの方法をexplant法を用いて提供する。過酷な酵素または遠心分離ステップの欠如は、インビトロの研究に使用したり、クリニックに戻って転送することができる臨床的に関連する幹細胞を提供します。...

ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の単離・増殖のための酵素フリー法

細胞療法の準備/操作ステップで導入された異種(化学的または動物由来)製品は、宿主患者における免疫反応性および病原性伝播のリスクの増加と関連しています。ここでは、ヒト脂肪由来幹細胞の単離および in vitro...

ヒト異種異系フリーのヒト治療法によるヒト脂肪由来幹細胞の単離と培養

このプロトコルは、Sprague Dawleyラットから脂肪組織由来間葉系幹細胞(MSC)を単離および同定するための方法論について説明しています。...

スプレイグドーリーラットの脂肪組織由来間葉系幹細胞の単離と同定

本稿では、マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画由来前駆脂肪細胞を単離、培養、脂肪誘発し、血管周囲脂肪組織の機能や血管細胞との関係を研究することを可能とする。...

マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画由来前駆脂肪細胞の単離・培養・脂肪誘発

ここでは、処理時間&gt;90%短縮、高い細胞生存率、広範な適合性を特徴とする、脂肪由来幹細胞および脂肪細胞を効率的に単離する標準的な方法を提示します。...

豚脂肪組織から脂肪由来幹細胞および脂肪細胞の効率的な単離

学ぶ ヒト脂肪由来間質細胞の単離法。フローサイトメトリーで骨形成能の高い細胞集団を同定し、再生医療や頭蓋顔面骨再建への応用を可能にする技術を解説します。

強化された骨形成のためのヒト脂肪由来間質細胞の単離および濃縮

さらに動画を探す