マイクロコンピュータ断層撮影とヌードマウスへのヒト脂肪注入の生存率の評価

この手順の全体的な目標は、マイクロ CT を利用して、脂肪移植の準備と送達の延期技術間の体積保持を比較するマウス モデルを説明することです。これは、最初にヒトのリポ吸引物を処理して、移植の準備ができている脂肪を得ることによって達成されます。2番目のステップは、CD 1胸腺ヌードマウスの頭皮に脂肪移植片を配置することです。

次に、CTスキャンマウスによって脂肪移植片の生存率を毎週分析し、画像を再構築し、体積保持を定量化します。最後のステップは、8週間の終わりに脂肪移植片を説明し、それらを重量と組織型で比較することです。最終的に、マイクロCTと組織学を使用して、脂肪移植片の品質と生存率の違いを示します。

脂肪移植片の計量などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、研究動物を犠牲にすることなく、最初の移植後の複数の時点での脂肪移植片の量を視覚化し、客観的に定量化できることです。この手法のアイデアを思いついたのは、マイクロCTを使用してカルバ欠損を分析し始めたときでした。この技術の意味するところは、脂肪移植、保持、生存率を評価するすべての研究に手術モデルを提供することです。

一般的に、この方法に不慣れな人は、頭皮の上の正しい位置に脂肪移植片を収容するのが難しいため、苦労します。この技術の視覚的なデモンストレーションは、技術のわずかな偏差が結果を変える可能性のある多くの段階があるため、移植と再構築の手順を学ぶのが難しいため、非常に重要です。コールマン法を使用して、選択的脂肪吸引を受けている健康な女性患者の腹部、脇腹、および大腿部の領域からヒト脂肪組織を採取します。

移植のために脂肪吸引物を処理するには、脂肪を30分間沈殿させることから始めます。脂肪吸引液は通常、上部に油、中央に脂肪、下部に血液の3つの層に落ち着きます。上部の油層を吸引して廃棄し、続いて下部の血液層を廃棄します。

残っている膨満液や細胞の破片をさらに除去するには、脂肪を350G、摂氏4度で5分間遠心分離します。遠心分離後、下部の血液層を吸引し、上部の油層が進行します。テキストプロトコルに記載されているように移植に必要な脂肪の量を計算するために、脂肪移植を行うには、ヌードマウス1匹の雌ホモ接合CDを得る。

実験的研究では、麻酔を誘発するために8〜12週齢のマウスを選択します。マウスの呼吸数が遅くなったら、マウスを2.5%isofのフッ素酸素混合物を含むノックダウンボックスに毎分2リットルで約10分間入れます。つま先をつまんで十分な鎮静を確認します。

マウスの両目に獣医用潤滑眼軟膏を塗布し、マウスの鼻をノーズコーンに入れて、1分間に1〜2リットルで2.5%ISOフッ素酸素混合物を供給します。次に、マウスの下に滅菌フィールドを設定します。次に、頭皮を2.5%ポビドンヨードで滅菌し、続いて70%エタノール溶液で滅菌します。

滅菌をさらに2回繰り返します。1ミリリットルのルアーロックシリンジに、室温に平衡化された1ミリリットルの脂肪をバックロードします。14ゲージ8センチメートルの長さの脂肪移植カニューレをシリンジの端に接続します。

脂肪が200〜400マイクロリットル残るまでシリンジプランジャーを押し下げて、システムをプライミングします。シリンジプランジャーを押し下げながら、細い鉗子を使用して遠位カニューレ穴から出る脂肪を観察して、カニューレが脂肪で完全に満たされていることを確認します。頭蓋骨の最も側面の甘えん坊を覆う正中線の背側の皮膚を持ち上げます。

細いハサミで皮膚に1.5mmの切り込みを入れます。切り口の中央に6 OHナイロン縫合糸を通し、後で傷口の端をまとめるために使用されます。移植を行った後は、縫合糸を結ばないでください。

次に、皮膚切開部からカニューレを挿入し、カニューレを頭蓋骨の上で扇形のパターンで前後に通過させて、頭蓋骨の上に皮下ポケットを作成します。ポケットが作成されたら、カニューレをマウスの正中線に配置し、頭蓋骨の真上にカニューレを直接配置します。 これは、目の間に引かれた線のすぐ後ろにある必要があります。逆行性にゆっくりと脂肪を注入し、カニューレを後ろに引いながらプランジャーを進めます。鉗子を使用して、傷口の端を一緒にして持ち上げ、ポケットから脂肪が漏れないようにします。

以前に配置した縫合糸を結び、最初の結び目が皮膚に軽く当たっていることを確認します。さらに3つの正方形の結び目を作り、3mmの尾で縫合糸をカットします。マウスを麻酔から外し、テキストプロトコルに詳述されているように回復を続行します。

最初のスキャンを実行する前に、空気、水、骨の強度を区別するイメージングファントムでマイクロCTをキャリブレーションします。キャリブレーション後。4匹のマウスをスキャナーの腹側位置に配置し、2匹のマウスを上に、2匹を下に置きます。

スキャンベッドに置きます。以前は、マウスの体を保持するための60ミリリットルの注射器と、鼻の円錐形として10ミリリットルの注射器で構成されていました。鼻から最初の頸椎まで、および頭蓋骨の上部から頭蓋骨の基部まで、マウスの頭蓋骨全体が画像化されることをスカウト画像で確認します。

テキストプロトコルで詳しく説明されているように、スキャンを続行します。ピクセル強度の閾値を使用してボクセルを選択することにより、関心領域またはROIを作成できるマイクロCTイメージング解析ソフトウェアで再構成された画像を開きます。まず、再構成したCT画像を2次元、冠状、軸方向、矢状方向のビューで読み込みます。

軸方向のスライスをガイドとして使用して、脂肪移植片の左端の側面に対応する矢状スライスに移動します。脂肪移植に対応するすべてのボクセルをキャプチャするピクセル強度の上限と下限のしきい値を選択しますが、周囲の組織と骨は除外されます。脂肪移植に対応するサジタルビューでROIを定義します。

以前に定義したピクセル強度の閾値を使用して、グラフトの右端の側面に達するまで、5番目の矢状スライスごとにこの手順を繰り返します。次に、すべての 2D ROI から選択したボクセルを 1 つの結合された 3D ROI に補間し、ソフトウェアによって計算された ROI ボリュームを記録します。3Dアイソサーフェスをレンダリングして、最終的な脂肪グラフトの体積を視覚化します。

その後の解析では、ピクセル強度の最大しきい値と最小しきい値を、マウスを 8 週目の時点までスキャンした後のベースライン解析に使用した値と同じにしてください。テキストプロトコルに記載されているようにマウスを安楽死させます。腱切開術用ハサミを使用してマウスを手術野に置き、ポケットと脂肪移植片から上にある皮膚および結合組織の付着部を慎重に開きます。

この時点で、移植片の抽出を助けるために、上にある背側の皮膚のパッチを切除するのに役立つ場合があります。移植片を切除した後に移植片から採取される結合組織を最小限に抑えるために、切除するときはできるだけ移植片の近くにとどまります。少なくとも0.01グラムの精度の引き裂かれたスケールで質量を測定します。

脂肪移植片は研究の過程で体積が徐々に減少し、8週目までに平均生存率が62.2%になりました。8週目のスキャンの完了時に、各脂肪移植片が1つのピースに抽出されました。WILコキシンランク合計検定を使用して、マイクロCTまたは物理的質量から計算された脂肪移植片の体積測定値の差を比較しました。

これら2つの方法の間に有意差は認められなかった。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば、セッションごとに2時間で実行できます。この手順を試みるときは、この手順に続いて毎回同じ方法で手術と再建を行うことを忘れないでください。

免疫染色やQ-R-T-P-C-Rなどの他の方法も実施することで、さまざまな移植方法によって血管性や遺伝子発現がどのように影響を受けるかといった追加の疑問に答えることができます。このビデオを見た後、in vivoでCTスキャングラフトを連続的に移植するためのリポ吸引物の処理方法、グラフトの生存率の評価方法、重量組織学のためのグラフトの説明、および将来の分析の開発方法についてよく理解しているはずです。この技術は、形成外科の分野の研究者がミラーリングモデルでの脂肪移植を探求する道を開きました。