肺気腫とタバコ煙曝露マウスにおける末梢気道リモデリングの自動測定

この手順の目的は、タバコの煙にさらされたマウスの肺の慢性肺の病状のように、COPDを定量化することです。これは、最初にマウスをタバコの煙または空気に6か月間さらすことによって達成されます。次に、げっ歯類の人工呼吸器を使用してマウスで肺機能検査を行います。

次に、肺を固定圧力まで膨らませて除去し、10%ホルマリンで固定します。最後に、鰓で染色された肺切片や小さな気道の細胞外マトリックス、タンパク質層の厚さ、またはメイソンの毛状突起で染色された肺切片の空域サイズを測定するために、より情報量の多いソフトウェアが使用されます。最終的に、タバコの煙にさらされたマウスの肺の空域拡大の測定は、標準化された偏りのない自動化された方法で実行されます。

平均線形切片測定や破壊指数などの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、このプロトコルが完了するのに時間がかかりにくく、観察者バイアスの影響を受けにくく、マウスの病状の不均一な性質を捕捉するのにより効果的であることです。マウスをタバコの煙にさらし、テキストプロトコルに従って麻酔をかけた後、気管の前方の皮膚を剃り、ヨウ素ベースの溶液とエタノールを使用して、クレーブハサミを使用してその領域を消毒します。気管の前方の皮膚と皮下組織を正中線切開し、鉗子を使用して胸骨甲状腺筋を分離します。

気管を露出させるには、気管の後方に2インチの長さの絹縫合糸を通し、気管ハサミを誘導して気管の前面に気管切開を行います。次に、18ゲージのカニューレを気管切開に挿入します。縫合糸を気管カニューレを介して所定の位置に固定するように誘導します。

マウスを人工呼吸器のアダプターのYチューブに接続し、1キログラムあたり10ミリリットルの一回換気量と毎分150回の呼吸数を使用して機械的換気を開始します。次に、肺を総肺活量またはTLCまで膨らませます ボリューム履歴ごとに3回。吸気容量またはicを測定し、肺の拡張を軽減するには、単一周波数の強制振動、操縦を行い、呼吸器系の動的抵抗、RRS、エラスチンERSおよびコンプライアンスCRSを評価します。

次に、広帯域周波数、強制振動、操作を実行し、中心気道抵抗、RN組織抵抗、G組織、エラスチンH、およびHに対するGの比率を測定します。一貫した測定値が得られるまで、これらの各操作を5回繰り返します。繰り返される各セット間でTL C3倍まで膨らませます。

各マウスの各パラメーターの平均値を記録します。マウスを人工呼吸器から取り外し、テキストプロトコルに従って安楽死させた後。横隔膜を切断し、正中線の胸部を開き、前肋骨を取り外して肺を露出させます。

気管の周りの皮膚と皮下組織を解剖し、気管の後方に2インチの長さの絹の縫合糸を2つ通します。気管支肺胞洗浄を行うことで肺膨張が定量化され、肺膨張のためのギブリングセットから空気が洗い流されたら、静脈内ギブリングセットを気管カニューレに接続します。バルブを開き、肺が完全に膨らむまで、PBSが重力によって肺に流れ込むのを待ちます。

気管カニューレの遠位に縫合糸で結び目を作ります。鉗子を使用して気管を持ち上げ、結び目の近くで切断します。次に、気管と肺の後方にある結合組織を解剖します。

肺を慎重に取り外し、生理食塩水を10%含むチューブに入れます。バッファリングされた式 in。肺を室温で一晩固定してから、PBSを使用して肺を2回洗います。

肺をパラフィンに埋め込み、マイクロランの厚さ切片を5つ切ります。次に、gill染色を使用して切片を染色し、テキストプロトコルで概説されているようにそれらを画像化します。Scion画像解析用の画像を準備するには、Scion画像を起動し、テキストプロトコルの補足部分に示されているようにマクロをロードし、開いている明視野画像1マクロを選択してTIFFファイルを開きます。

画像編集ツールを使用して画像を準備します。分析するには、LUTウィンドウの下部にある黒または白をクリックして、ペイントブラシの色を選択します。次に、ブラシツールをクリックしてブラシサイズを変更します。

ブラシツールをダブルクリックし、適切なブラシサイズを入力します。ペイントブラシツールを使用して、気管支と血管を黒くペイントして組織として分析することにより、空域または肺胞壁ではない領域を空域または組織として処理するように強制します。空域の平均コード長を測定するには、マクロ コード長 air two を選択します。

この手順では、グレースケール画像を、黒または白のピクセルしきい値のみを持つバイナリ画像に変換します。バイナリ イメージは、画像の中央付近をクリックし、マウスを上下にドラッグします。しきい値を調整するには、マウスをもう一度クリックして値を受け入れます。

閾値を調整して、歯槽壁が元の画像と同じ厚さになるようにします。閾値を下回らないことが重要であり、それによって元の画像には存在しない歯槽壁の切れ目が生じ、人為的に高い臍帯長の値が生成されることになります。バイナリ イメージの再しきい値を設定するウィンドウを確認し、マクロをしきい値まで続行またはキャンセルします。

もう一度、プロンプトに「理由」と答え、「OK」ボタンを選択します。マクロで生成された水平および垂直のグリッド ウィンドウを 5 ピクセル間隔で観察します。このプログラムは、空域に重なる水平垂直線の長さを測定します。

デフォルトの名前を使用して任意のフォルダにファイルを保存します。これには、空域コードの長さを表す C LA TXT が付加されたファイル形式が含まれます。これにより、Excel レポート マクロでファイルを検索できるようになります。

レポートを分析するには、X Excel レポート TWENTYX XLS を開きます。CL m マルチマクロを選択すると、ファイルウィンドウから複数のマウスの画像に対応する複数のフォルダーの歯胞索の長さの測定値をレポートできます。フォルダを強調表示して一度に 1 つのフォルダを選択し、[OK] を選択します。

各フォルダを選択したら、各 CL txt ファイルの統計情報を示すワークシートを確認します。続いて、すべてのファイルから結合されたコード長データの統計量を確認し、すべてのCLファイルを開いて、すべてのワークシートのデータを表示します。最後に、スプレッドシートの名前を変更して保存します。

デフォルトのファイル名は、親フォルダの名前に c xls を付加したものです。ここには、十分に膨らんだ肺の切片が示されています。肺胞腔のマクロファージは白く塗られ、血管と気管支は黒く塗られています。

次に、画像を元の画像を使用して閾値化を施したバイナリ画像に変換し、次に、肺胞空間のすべてのピクセルが黒く、肺胞ではない肺の領域のピクセルが白になるように反転します。これらの図に示されているのは、ソフトウェアマクロが生成する垂直および水平の歯槽索の長さです。この実験は、煙に曝露されたC 57ブラック6野生型マウスは、年齢と性別が一致した野生型マウスと比較して、肺胞の空域サイズが23%増加していることを示しています。

肺機能試験では、肺の弾性反動の適度な損失を反映した圧力ボリュームループの左シフトが適度に変化し、タバコの煙に曝露されたC 37ブラック6野生型マウスで発症する軽度の肺気腫と一致しています。ここに示されている6ヶ月間は、空気またはタバコの煙に6ヶ月間曝露されたC 57ブラック6野生型マウスからの肺のマッセントリクローム染色切片の画像であり、タバコの小さな気道の周りの細胞外マトリックスタンパク質沈着の増加を示しており、煙に曝露された動物は、この手順を試みている間。発生後にマウスの胸郭から肺を取り外すときに、肺を傷つけないように注意することを覚えておくことが重要です。

この技術は、マウスの慢性閉塞性肺疾患の病因に寄与する経路を探索し、前臨床モデルシステムにおけるCOPDの新規治療法の有効性を評価するための肺疾患分野での探索への道を開きました。