アンインビトロ酵素アッセイは、ガリウム（III）とHによる転写阻害を測定する 3 5,10,15トリス（ペンタフルオロフェニル）corroles

この手順の全体的な目標は、潜在的な抗がん化合物が肋骨、核酸、または RNA 転写を阻害するかどうかを判断することです。これは、最初にRNA転写反応を調製することによって達成されますが、この実験では、潜在的な阻害剤を含め、異なる細胞傷害性を示すCHO化合物のRNA転写の阻害について調査し、既知の阻害剤と比較します。反応を十分に混合した後、反応チューブを摂氏37度でインキュベートし、所望の時点でアリコートを取り出します。

次に、臭化イリジウムはRNAの結合時に蛍光を発するため、ゲル内の暗いバンドはRNAの濃度が高いことに対応するため、相対的な阻害を評価するために使用されます。転写阻害の程度を定量化するために、紫外線、可視光、またはUV対分光法が行われます。最終的に、このビデオは、抗がん剤候補の特性を評価するための簡単な方法を示しています。

サンゴによる転写阻害を評価することにより、潜在的な抗がん剤は、RNAを阻害する能力について評価する必要があります。転写。ヒトのがん細胞は、生存治療のために単一の活性化がん遺伝子に依存することがよくあります。がん遺伝子の発現を阻害すると、がん細胞の排除に効果的です。

ここで説明するRNA転写阻害手順は、潜在的な抗がん剤候補を特定し、その作用機序についてさらに学ぶための有用な方法です。まず、キャロル化合物と阻害剤化合物を、複合体とDNAの0.01対1モル比で調製します。これを行うには、トリポリ、TPFC、ガリウムTPFCおよび酸化ジメチルスルフを清潔な別々の容器に溶解します。

転写反応を開始する前に、ヌクレアーゼを含まない水で穀物を希釈して最終濃度を得ます。必要な試薬は個別に調製するか、市販の業者から購入してください。凍結した試薬をすべて氷上で解凍します。

次に、テキストプロトコルに記載されているように、室温で転写反応用の試薬を組み合わせます。チューブをフリックするか、混合物を静かに上下にピペッティングして十分に混合してから、反応混合物を摂氏37度でインキュベートします。次に、各時間後に各反応から4マイクロリットルのアリコートを取り出し、摂氏マイナス20度で保存し、転写反応後の所望の時点に応じて必要に応じて変更します。

テキストプロトコールに記載されているように、RNAスピンカラムを使用して他の反応成分からRNAを精製し、アグロスゲル電気泳動を行い、トリスアセテートEDTAまたはTAEランニングバッファーと1000倍×臭化エーテルストック溶液を調製します。また、テキストプロトコルに記載されているように、臭化エテリウムは有毒であるため、取り扱うときは常に適切な保護具を着用してください。次に、10グラムの超高純度アグロスを1リットルのXTAEバッファー1リットルに溶解し、従来の電子レンジでアグロスを溶かして、1%アロスゲルを調製します。

50°Cに冷やしたら、1%agrosゲル溶液に1000×臭化イリジウム1ミリリットルを加え、密閉容器内で静かに渦巻くか反転させて混合します。次に、アグロ溶液をゲルキャスティングプラットフォームに注ぎ、ゲルが固まった後、ゲルが室温で固化します。電気泳動タンクからウェッジを取り外し、ウェルが水没するまでゲルを覆うのに十分なTAEバッファーを追加します。

ゲルコームを取り外す前に、TAEバッファーのレベルがゲルのレベルより約1ミリメートル高いことを確認してください。ゲル電気泳動用のRNAサンプルを調製するには、精製した各サンプルアリコートの1マイクロリットルを1マイクロリットルのゲルローディングバッファーと組み合わせ、マイクロピペットでピペッティングして完全に混合し、各サンプルの溶液をそれぞれの底に慎重にピペッティングして各サンプルをゲルにロードします。ウェル間で気泡を残さないように、またはサンプルを混合しないように注意してください。

DNAがゲル内の陽性リードに向かって移動するように、リードを取り付けます。電圧を希望のレベルに設定します。通常、ゲル1センチメートルあたり1〜10ボルトです。

250ボルトで23センチメートル×25センチメートルのゲルを約1時間駆動します。150ボルトで8センチメートル×8センチメートルのゲルを約20分間作動させます。より小さなRNAフラグメントは、より高い電圧でより高い分解能で動作します。

ゲルを任意の時間泳動することで、潜在的なRNAフラグメント間の有意な分離に十分な時間、色素の移動を使用して分離の進行をモニターします。ローディングバッファーからの色素がゲル画像の末端に移動する前に、電源をオフにしてください。紫外線下でRNAを臭化アテリウムとして蛍光を発し、画像の写真を撮り、各条件から精製されたRNAの蛍光強度を比較します。

UV V分光法を使用してRNA定量を行うには、NanoDrop 2000または同様のマシンに2マイクロリットルの水を置き、ブランクを測定します。次に、精製後の各RNAサンプルの2マイクロリットルを分光光度計に置き、吸光度が光学密度1を超える場合、200ナノメートルから800ナノメートルの波長範囲からの紫外線可視光を測定します。サンプルをヌクレアーゼフリー水で希釈して、光学密度が1未満になるようにします。

最後に、グラフ作成ソフトウェアを使用してさまざまなサンプルをプロットし、260ナノメートルでの光学密度を比較します。これは、転写されたRNAをイメージングするためにゲル電気泳動が使用されます。複合体がRNA転写を阻害すると、RNAの産生が減少し、テーバンは軽く見えます。アクチンdとトリプトリンは、これらの長い間研究された阻害剤の予想されるコントロールと比較すると、RNAの明らかな減少を示しています。

ガリウムTPFCバンドはまた、RNAのレベルが非常に低い一方で、TPFCバンドは阻害をほとんどまたはまったく示さず、コントロールと同じ相対強度を示します UV対各サンプルで測定が行われました。RNA転写を4時間行い、RNAスピンカラムクロマトグラフィーで精製した後、波長220ナノメートルから350ナノメートルのスペクトルを以下に示します。

阻害剤で処理した4つの転写反応のうち3つは、ガリウムTPFCで処理したDNAを未処理のD-N-A-T-P-F-Cで処理したDNAの14分の1のRNAのみを転写した対照よりもRNAが少なく、明らかな阻害は示されませんでした。したがって、TPFCで処理した細胞株の細胞毒性は、RNA転写阻害によるものではありません。すべてのサンプルの吸光度は260、280ナノメートルの比率は約2.2であり、比較的純粋なサンプルを示しています。

この手順に続いて、濃度や添加の順序など、反応の他の変数をテストして、作用機序などの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、抗がん化合物がRNA転写を阻害するかどうかを判断する方法についてよく理解できるはずです。ブロマイドはあなたの健康に非常に危険である可能性があることを忘れないでください。

常に適切な個人用保護具を着用し、臭化アテンを含むマイクロ波溶液や農薬は絶対に使用しないでください。