がん薬感の有効性を評価インビトロとインビボ

次の実験の全体的な目標は、in vitro の細胞代謝と in vivo の転移頻度の変化を測定することにより、がん薬物感作の有効性を評価することです。これは、まずがん細胞をin vitroでアンチセンス分子で切り株、目的の標的をノックダウンすることで達成されます。次に、トランスフェクションした細胞をバイオセンサーチップに播種し、代謝測定システムにロードして、薬物治療中の酸性化、呼吸、接着の変化を列挙します。

これとは別に、トランスフェクションされた細胞を薬物で処理し、ニワトリ胚の静脈循環に注入して、転移頻度への影響を評価します。その結果、細胞代謝と転移頻度の変化によって示されるがん薬物感作が示されました。この技術は、従来の薬物標的または化合物の前臨床試験では必ずしも考慮されないパラメーターの同時評価を可能にするため、がん治療の開発を拡張します。

この手法は、DNA修復に関与する新規の薬物標的に関する洞察を得ることができますが、細胞周期制御などの他のシステムにおける標的検証にも適用できます。腫瘍細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスセクトした後、無菌環境でのテキストプロトコルに従って、400マイクロリットルのPBSを使用して6つのバイオセンサーチップを慎重に洗浄しますチップを滅菌するには、PBSを取り外し、400マイクロリットルの70%エタノールを加えて20分間インキュベートしてから、PBSを使用してチップを3回洗浄します。それぞれ3つのチップを滅菌培養皿に入れ、コントロールと目的のターゲットをラベル付けし、同様の方法で2つの50ミリリットルチューブを標識します。

次に、PBSを使用してトランスフェクションされた細胞を洗浄してから、適切な量の0.25%トリプシンEDTAを添加し、単層が剥離するまで待ってから、細胞懸濁液を適切なチューブに移します。細胞をカウントした後、培地を追加するか、細胞を濃縮することにより、1ミリリットルあたり5番目の細胞の10倍の6.0の最終濃度に達するように容量を調整します。一度に1つのグループを準備し、各バイオセンサーチップに250マイクロリットルの細胞溶液を追加します。

チップを含む滅菌皿を湿度チャンバー内に置き、蒸発を防ぎ、一晩インキュベートして、テキストプロトコルラベル1450ミリリットルチューブに詳述されている実験概要に従って代謝測定を実施し、50ミリリットルの成長、培地プラス0.2%FBS、および1つのxペニシリンとストレプトマイシンを追加します。またはPS。1つの代謝測定システムに6本のチューブを、別のシステムに6本のチューブラックを、シスプラチン入りのチューブを含む3本目のチューブラックに残りのチューブを入れます。蒸発を防ぐために、最初の2つのラックをシールするために通気性のあるメンブレンを使用します。

次に、0.2%FBSと1つのXPSを含む培地で、6マイクロモルシスプラチンの適量を調製します。必要な量の培地をラベル付きの50ミリリットルチューブ4本に分注し、3番目の代謝測定チューブラックの4つのスロットに戻します。通気性のあるメンブレンを使用してチューブをシールします。

50ミリリットルのチューブを6本にラベル付けし、0.1%Triton X溶液のそれぞれに20ミリリットルを追加します 中、Triton X溶液は残りのセルに存在し、各チップにゼロ値を提供します。チューブを4番目のチューブラックに入れ、密封します。次に、チップをバイオモジュールにロードします。

2つのブラックを2つのブラックホルダーにロードし、実験を開始します。細胞トランスフェクションの2日目にテキストプロトコルで参照されているようにニワトリ胚を調製した後、コントロールグループとターゲットインタレストグループをビヒクル用の2つのフラスコとシスプラチン用の2つのフラスコに分割します。培地を吸引し、3ミリリットルのフレッシュ、ミディアム、または6マイクロモルのシスプラチンを含むミディアムのいずれかを使用して補充します。

フラスコは6時間インキュベートします。インキュベーション後、培地を吸引し、次いで細胞を洗浄し、アナイズし、細胞懸濁液を4つの適切に標識された15ミリリットルチューブに移し、スピンし、PBSを使用して3回Resus細胞を再懸濁する。そして、カウント後、PBSを使用して希釈するか、遠心分離して細胞を1mリットルあたり10〜6番目の細胞の最終濃度に濃縮します。

細胞懸濁液を注射用にラベル付けされた5ミリリットルのチューブに移し、氷上に置きます。次に、実体顕微鏡下で注射するために24 9日齢のニワトリ胚を確保し、1ミリリットルの注射器に接続された柔軟なチューブに取り付けられたガラス針を使用して、ゆっくりと脈動する動きをします。100マイクロリットルの容量で5番目の細胞に1.0倍の10を、ソフトワイプでchoal toic膜またはカムの静脈循環に注入します。

注入部位を軽くたたいて血流を止め、スピンのこぼれを吸収します。各胚容器を、蛍光顕微鏡下での各注入後に適切に標識します。カムの血管系における蛍光細胞の存在と分布を確認します。

腫瘍細胞の数が少ない、または分布が悪い胚に注意してください。最後に、ニワトリ胚を湿度チャンバーに入れ、テキストプロトコルで概説されているように転移性病巣を列挙する前に7〜9日間インキュベートします ここに示されるように、ヒト、A 5 49肺癌細胞をBRCAで処理した2つのSOおよびシスプラチンを標的とする細胞は、コントロールAのSOおよびシスプラチンを単独で受け取った細胞と比較して、呼吸の早期かつ不可逆的な減少を示した。対照処理細胞と比較して39%の減少は、細胞接着が検出可能な低下する約10時間前に始まっており、細胞数の変化とは無関係に発生し、ここで示したように細胞死に先行する形成的イベントである可能性があることを示唆しています。

72時間の実験では酸性化に違いは観察されず、BRCA two a SOとシスプラチン治療がグルコース代謝にほとんどまたはまったく影響を与えなかったことが示唆されています。この実験では、ヒトA 5 49肺癌細胞をシスプラチンの存在下または非存在下でコントロールA SOまたはBRCA 2 A SOで処理し、カムの静脈循環に注入した。9日後、BRCA two a SOとシスプラチンで治療された細胞は、コントロールA SOとシスプラチンまたはBRCA 2 A SSOのみで治療された細胞と比較して、転移巣の頻度が77%低いことを示し、BRCA two a SOとシスプラチン治療が固形腫瘍患者の転移負担を軽減または予防する可能性があることを示唆しています。

この手順に続いて、細胞増殖、アッセイ、in vivo異種移植研究などのより伝統的な方法を実施して、特定の標的の薬物感受性向上への寄与をさらに調査することができます。