腸間膜リンパダクトカニューレを挿入ラットモデル：腸のリンパ医薬品輸送の評価への応用

この手順の総合的な目的は、腸管投与後の腸管リンパ系への脂質および薬物の輸送速度と輸送量を評価することです。まず、リンパ液を回収するために腸間膜リンパ管を単離してカニュレーションします。次に、腸管内への注入を可能にするために十二指腸をカニュレーションし、続いて血液サンプルを採取するために頸動脈をカニュレーションします。

最終ステップでは、実験的処置を十二指腸に投与し、全身の脂質または薬物レベルを定量するためにリンパ液および血液を採取します。最終的に、このモデルは、腸管投与後の脂質および薬物の総吸収量および腸管リンパ輸送を評価するために使用できます。この手法の主な利点は、腸間膜リンパ管に直接カニューレを挿入し、実験期間全体にわたってリンパ液を採取できることです。

これにより、腸間膜リンパへと流入し、そこを通過する物質の絶対量を推定することが可能になります。このモデルは、薬剤および脂質の輸送をin vivoで評価することを可能にするだけでなく、任意の関心因子の腸管リンパ輸送や、さまざまな刺激または疾患状態に応じたそれら因子のリンパ輸送の変化を測定するためにも使用できます。

腸間膜リンパ管のカニューレ挿入は、管が細く脆弱であること、また絶食させた動物ではさらに困難で複雑であるため、本手法の視覚的な実演が極めて重要となります。本手順の実演は、モナシュ大学の同僚であり教職員であるDr.Natalie cusと、研究グループのシニアポストドクターであるDr.LJ Hughが行います。手術の前日に、カニューレを適切な長さに切り、滅菌外科用メスを使用して各チューブの先端にベベル（斜面）を作成します。次に、十二指腸内カニューレを準備するため、カニューレをループ状に折り返し、加熱してチューブにアンカーポイントを作成します。

手術当日、麻酔をかけた成体ラットの腹部右側、頸部、および左鎖骨領域の被毛を剃毛し、リンパ管にカニューレを挿入するため、ポビドンヨード溶液と70% ethanolを用いて3回連続で外科的領域を無菌的に洗浄します。動物の右側を上に向け、滅菌メス刃を用いて、剣状突起から肋骨縁の約2 cm下の右側腹部に向かって4 cmの直線的な切開を加え、腹壁筋の最上層を開きます。小腸を腹壁の左側に寄せ、生理食塩水で浸した2〜3枚の滅菌ガーゼを用いて固定します。

次に、ラットの右腎臓の高さで、動物の背中の下に水平に置いた10 milliliterのプラスチック製シリンジの上にラットを跨がせます。腸間膜リンパ管の視認を容易にするため、右腎臓に対して垂直で、暗赤色に拍動する腸間膜動脈の直前（吻側）に平行に走る、直径約0.5〜1 millimeterの上腸間膜リンパ管を確認します。ここで示しているような非絶食ラットでは、上腸間膜リンパ管は白く不透明であり、絶食ラットよりも視認しやすいことに注意してください。

次に、右腎臓の下縁にある会陰脂肪床を、上腸間膜リンパ管と平行に、かつ大静脈の直下の結締組織層を通して、直線ピンセットで貫通させます。次に、ピンセットの先を用いてリンパカニューレを会陰脂肪床に通し、一方の端を腸間膜リンパ管に隣接させ、もう一方の端を右腎臓の高さで動物の体外へ出します。その後、手術用顕微鏡と精密ピンセットを用い、下端から鈍的に剥離して、上層の結締組織および脂肪組織から腸間膜リンパ管を単離します。この際、リンパ管を損傷しないよう注意してください。

微細先ピンセットの先端を使用して、リンパ管に小さな穴を開けます。リンパカニューレに抗凝固剤溶液が完全に満たされ、気泡がないことを確認した後、小型ピンセットを用いて、穿刺部位から腸間膜リンパ管の内部に約2〜4 mmまでリンパカニューレを挿入します。カニューレ挿入が成功すると、カニューレの自由端から腸管リンパ液が徐々に流出するのが観察されます。

この現象が起きた場合は、シアノアクリレート系接着剤をリンパ管の挿入口に少量滴下してカニューレを固定します。その際、接着剤を塗りすぎて血管を閉塞させないよう注意してください。十二指腸にカニューレを挿入するには、まず、小腸の鮮やかなピンク色の部分を確認し、ゆっくりと下方へ引いて胃を露出させます。次に、滅菌済みの23ゲージ針を用い、胃と十二指腸の接合部から約2 cm下の幽門付近にある十二指腸に小さな穿刺孔を開けます。

次に、十二指腸カニューレのJ字型のフック端を穿刺部位に挿入し、Sanoアクリレート接着剤を1滴用いてカニューレを固定します。その後、縫合糸を用いて腹筋壁の切開部を閉鎖します。頸動脈カニューレ挿入は、腸間膜リンパ管のカニューレ挿入前または後に行うことができます。通常、動物を移動させる際にリンパ管カニューレが脱落する可能性を低くするため、リンパ管のカニューレ挿入前に頸動脈のカニューレ挿入を行うことを推奨します。頸動脈にカニューレを挿入するには、まず頸動脈カニューレの斜端から2.5 centimetersの箇所に印を付け、動脈内に挿入するチューブ部分を特定します。

次に、カニューレの斜面のない端を、抗凝固剤溶液を満たしたシリンジに取り付けられた25ゲージの針に接続し、気泡が入らないように注意しながらカニューレ内に溶液を満たします。続いて、正中面において気管の左上の皮膚層に1～1.5 cmの縦切開を加え、鈍端ピンセットを用いて皮下結合組織を剥離し、下層にある一対の頸筋を露出させます。頸筋を牽引し、皮膚表面から約1 cm下に位置する拍動している左総頸動脈を露出させます。

次に、鈍的剥離によって動脈上の結合組織を除去し、鈍的組織ピンセットを用いて、動脈の約1 cmの区間を単離します。続いて、微細先端ピンセットを使用して、単離した動脈区間の両端に2本の絹糸を総頸動脈の下に通します。その後、ラットの心臓および鎖骨から最も遠い側の縫合糸を結紮し、総頸動脈の下に直線状の微細先端ピンセットを置いて、動脈内の血流を遮断します。

次に、細いチップのアイリス剪刀を用いて、単離領域の上端から約3分の1の位置にある動脈の上面に小さな切開を加えます。曲がりチップのピンセットを用いて、カニューレの先端を動脈内に挿入します。挿入後、直線的な細いチップのピンセットを取り除いて血流を遮断し、2組のピンセットを使用してカニューレを動脈内に2.5 centimeters進めます。

一人がカニューレを動脈内に保持して血液の逆流を防ぎ、もう一人がカニューレを挿入します。その後、小型の動脈クランプを使用してカニューレを動脈内に固定します。カニューレに抗凝固剤溶液を注入し、続いて少量の血液を吸引して、チューブの開通性を確認します。

次に、カニューレを抗凝固剤溶液でフラッシュし、ライターの火で先端を封止します。最後に、縫合糸を使用してカニューレを固定し、動脈クランプを取り除きます。その後、動脈とカニューレの周囲に3本目の縫合糸で固定し、動脈周囲の縫合糸の長さを短くし、回復期間を経て、さらに縫合糸で頸部の創傷を閉鎖し、十二指腸カニューレを介して目的の製剤を動物に注入しました。

モデルとして親油性薬剤であるhalal faneneを投与した後のグラフに示されているように、カニュレーションに成功したラットの平均リンパ流量は0.4から1.3 milliliters per hourの間でした。一部の個体では、カニュレーション後の最初の1〜3時間はリンパ流量がわずかに低く、その後増加しましたが、これはリンパ管カニュレーション成功後に一般的に観察される現象です。一方、カニュレーションに失敗したラットでは、採取期間を通じて流量が成功した実験例よりも大幅に低いままでした。

同様に、これらの代表的な実験において、トリグリセリドおよびhalal RINの累積リンパ輸送量は、カニュレーションに失敗した動物において大幅に低くなりました。一方、カニュレーションに成功した群では、平均累積halalan輸送量は投与量の15.1%であり、累積トリグリセリド輸送量は10時間で61 milligramsでした。この代表的な脂質輸送実験において、リンパ系に輸送された投与済みの放射標識外来脂質投与量の割合は54%でした。これらの値は、以前に観察された値と有意な差はありませんでした。

同様の処方において、トリグリセリドおよび薬物のリンパ輸送速度は、脂質および薬物の投与後数時間でピークに達し、その後ベースラインレベルに戻ります。これは、腸管リンパ管における脂質および薬物の輸送実験で一般的に見られる傾向です。各時間帯におけるリンパ中の薬物輸送速度は、薬物がリンパへ輸送されるため、トリグリセリド輸送の挙動を反映しています。

トリグリセリドに富むリポタンパク質との関連において、一度習得すれば、困難が生じない限りカニューレ挿入は30分以内に完了できます。この処置に続き、採取したリンパ液中の成分を単離し、受容動物への再注入などの追加実験に用いることで、その機能、代謝、クリアランス、または分布パターンを直接的に評価することが可能です。このビデオを視聴することで、腸間膜リンパ管、総頸動脈、および十二指腸を単離し、カニューレを挿入する技術について十分に理解できるはずです。

これらの手法を用いることで、腸管から腸間膜リンパ管を経由して、あるいはその中へと輸送される薬剤、脂質、およびその他の因子の輸送を、Vivaで評価できるはずです。