Name: 腸間膜リンパダクトカニューレを挿入ラットモデル：腸のリンパ医薬品輸送の評価への応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: 学ぶ腸間膜リンパダクトカニューレ挿入法で、ラットを用いて脂質と医薬品の腸管リンパ輸送を定量的に評価する技術。この方法は薬物吸収メカニズムの解析に有用です。

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オーストラリア研究評議会(ARC)および国立保健医療研究評議会(NHMRC)からの資金提供に感謝しています。

著者らは開示するものは何もない。

ラット腸間膜リンパカニュレーションモデルは、直接リンパに腸から（例えば脂質および薬物のような）種々の細胞および分子の輸送の濃度及び割合の定量化および種々の物質の投与に応答して発生し、これらの変化（食事を可能に、抗原、薬物、配合物など ） を 10,27および疾患（癌、ウイルス、大腸炎、インスリン抵抗性、 等 ）5-7。リンパ収集コンポーネントは、さらに追加の実験において使用され得る。例えば、細胞は、44分画し、リポタンパク質およびリンパまたはそのようなリポタンパク質または細胞のようなその成分は、薬物、放射性標識、蛍光プローブを含むマーカーを装填培養することができる。次いで、これらを、より直接的に、それらの機能、代謝、クリアランスおよび/ ​​または組織の配置パターン45-47を評価するためにレシピエント動物に再注入することができる。ラットリンパカニュレーションモデルはothの上にいくつかの利点を有するえーインビトロ 、 インサイチュで 、 インシリコで<...

リンパは各小腸絨毛1内に含まれているシングルlactealsから発信一方向のプロセスを経て小腸から流れ。 Lactealsこうして流体、巨大​​分子、細胞およびリンパ形成に比較的透過性であるlactealsにこれらの要因のエントリで始まる。 lactealsの初期のリンパはその後、（求心性）のリンパ管、腸間膜リンパ節、最終的にはポスト結節（遠心性）リンパ管のシリーズを集め、リンパ微小血管のネットワークを経由して腸から流入する。ノード内では、リンパ液は交換は、血液からノードに入るノード常駐免疫細胞だけでなく、材料に発生する髄洞の一連を通過する。小腸から流れるすべてのリンパ節は、最終的には遠心性上腸間膜リンパ管、その後槽のchyliに収束する。槽のchyliもINTEST、尾末梢組織に所属リンパを収集ノミナル、肝及び腰椎地域や縦隔と体の頭蓋部分からリンパ液と一緒に胸部リンパ管を結合します。胸部リンパ管は左内頸静と鎖骨下静脈の接合部で静脈系に直接リンパ液を空にします。ここに記載されているプロトコル、上腸間膜リンパ管から直接リンパの収集を可能にし、したがって、腸のリンパ系を介して全身（一般的な）循環への腸から直接遷移する様々な要因の分析を容易にします。 腸のリンパ系に割り当てる主な生理学的機能は、体液平衡を維持するために、脂質と、親油性分子の吸収を促進するために、1適切な免疫応答を可能にするためである。腫瘍細胞およびウイルスも2-4とキーの変更は、いくつかの炎症性および代謝病態5-7にリンパ管内で発生する腸リンパ管を経由して伝播する。缶腸間膜リンパ節内を収集する腸間膜リンパ管のnulation腸リンパ管を介してバルク流体の流れの解析ならびに様々な細胞および分子の濃度および輸送速度の定量化を可能にする。様々な課題（ 例えば、食事、抗原、薬物）に応答して、疾患のモデルにおけるこれらの因子の濃度または輸送に変化（ 例えば、大腸炎、HIV、糖尿病）も評価することができる。それは広範囲に分析し、ここで比較することができる各リンパコンポーネントを記述することは不可能であるが、腸間膜リンパは単純化して、水性、脂質と細胞のフェーズで構成。水相中の目的の構成要素は、抗原または寛容原8などのサイトカインおよび肥満細胞メディエーター9、及びそのようなインクレチン10のような代謝性メディエーターの免疫メッセンジャーとしてのペプチドおよびタンパク質を含む。ポスト結節腸間膜リンパ節の細胞画分は、ほぼ完全に（99％以上）lymphocytの構成されていES 11。さまざまな免疫細胞（樹状細胞、肥満細胞など ） は事前に結節腸間膜リンパ管に入りますが、ノード12内に残る。求心性リンパ節内の細胞に関心がある場合には、腸間膜リンパ節の除去を介してこれらの細胞を収集することが可能である腸間膜リンパ管12のカニューレ挿入の前に数日間ノード。このようにして、求心性および遠心性のリンパ管に直接接続され、輸入リンパリンパ細胞は、腸間膜リンパ管に直接渡す。腸リンパ管を通過する種々の免疫細胞の輸送および表現は、このように調べることができる。おそらく、これまでの腸間膜リンパを収集するために引用した最も一般的な理由は、しかし、食事性脂質および親油性分子10の腸の処理、吸収と輸送を研究することである。 摂取後、食事性脂質は、例えば、トリグリセリドからの脂肪酸とモノグリセリド、phospに（消化され脂肪酸およびリゾリン脂質、脂肪酸およびコレステロールなど ）へのコレステロールエステルのholipid胆汁からの両親媒性物質の添加によって小さなミセルおよび小胞構造に腸管腔の内部に分散（リン脂質、コレステロールおよび胆汁塩）との作用膵酵素10,13。ここから彼らは腸細胞に吸収される。吸収された成分の割合は、吸収細胞（腸細胞）内のトリグリセリド、リン脂質及びコレステロールエステルを形成するために再エステル化されている。これらの再エステル化された脂質は、外因的に脂質成分および胆汁分泌、粘膜脂質プールまたは腸の血液供給13からの内因性脂質成分の摂取の組み合わせから組み立てられる。ここからエステル化脂質はどちら腸細胞内に格納されているか、一緒に様々なアポや他の親油性分子と腸のリポタンパク質（カイロミクロン、超低密度リポタンパク質（VLDL））（に組み立てる<eM&gt;例えば、ビタミン）10,13。腸のlactealsは腸の毛細血管よりも彼らのエントリに対してより透過性であるように、腸細胞を出た後、リポタンパク質は、特に腸間膜リンパ系を介して全身循環への腸から輸送される。吸収された脂質成分の割合はまた、関連した単一の非リポ蛋白質のような毛細血管および門脈を経由して全身循環への腸から運ば14を分子ている。しかしながら、一般的に、門脈搬送経路は短く、中鎖長の脂質の吸収の唯一の重要なプレーヤーである。 腸間膜リンパの集合は、このように腸からのリポタンパク質および関連コンポーネント（脂質、親油性分子、アポ蛋白質）の輸送の評価を可能にします。リポタンパク質は、腸間膜リンパリポタンパク質は、一般に、nascenであるという利点を用いて定量し、特徴付けることができるT状態彼らは広くそのようなリポタンパク質リパーゼ15などの全身の酵素によって変更されていないため。腸間膜リンパカニューレ挿入ラットモデルは、おそらく歴史的に最も広範に腸からの脂質/リポタンパク質輸送を分析するために記載されている一方で、関心の拡大領域は、親油性薬物、プロドラッグ及び他の生体異物13,16の輸送におけるリンパ管の役割であるそのここで説明したモデルの焦点である。 17,18（例外は明らかであるが、長鎖トリグリセリドのlog P&gt; 5と溶解度が、一般的にそれらの&gt; 50ミリグラム/ g）を、プロドラッグ19および他の生体異物13,16は、腸リンパ管のどちらか受動的かによるへのアクセスを親油性薬物を得ることができます積極的に腸のリポタンパク質輸送経路19への統合。 ラット腸間膜リンパカニューレ挿入技術は、このように多くの用途を有する。ボールマンらは、まずtechniqを説明したモデルのバリエーションその後数が記載されているので、UEは、1948年20ラットにおける腸間膜リンパ管にカニューレを挿入する。 15を拘束したり、自由に23,24を移動しながら、ラットを様々な麻酔薬21,22、または意識的な状態で麻酔されている場合たとえば、コレクションが発生する可能性があります。 （ - 5ミリリットル/時間、典型的には0）25ラットは異なる再水和溶液と、胃、腸、又は非経口的に異なる速度で脂質および薬物製剤のような他の物質を投与することができる。いくつかの研究において、胸管ではなく、胸管は、他のリンパ節を受信すると、これは、関心の要因に応じて、小腸の通過を過大評価してもよいが、腸間膜リンパ管は、リンパ管を経由して腸からの輸送を推定するためにカニューレを挿入する地域22,26。リンパカニュレーションモデルはまた、ミニパイ、マウス15,27を含むいくつかの他の種に記載されているGS 12、羊28,29、豚30と犬31。しかし、ラットモデルは、最も広くかつ一貫して引用されている。意識25内リンパの収集に続いて、または22ラットおよびマウス15,27を麻酔腸間膜リンパ管のカニューレ挿入のための詳細なプロトコールは、以前に公開されており、興味のある読者は、これらのプロトコルを対象とする。このプロトコルは、可視化された形式で技術を実証する最初のです。 リンパカニューレラットモデルは、費用の点で大きな動物モデル、外科的および倫理的考慮事項を容易に勝る利点を有する。マウスモデルと比較すると、マウスモデルは、トランスジェニック動物27でより詳細な研究が可能になりますが、腸間膜リンパカニュレーション手術はまた、ラットで簡単です。それにもかかわらず、ラットモデル、生理学の違いに関連した特に、そのリミットextrapolatのいくつかの制限があります他の前臨床および臨床状況にイオン。高い種食品又は脂質、胆汁の流れ32を刺激するのに対し、例えば、ラット胆汁流量が一定と食物摂取と無関係である。これは、より大きな種とヒトに見られるものを反映ラットにおける代表前と食後の環境を得るための課題を作成します。現実的な人間の剤形25の投与後のリンパ輸送を評価する場合、薬物送達研究のために、より大きな種が好ましい場合がある。最近の研究では、腸間膜リンパ節中の脂質輸送速度は、種27を横切っ脂質輸送データを外挿することで、いくつかの信頼性を提供する等価質量と脂質のタイプの投与後の種（マウス、ラット、イヌ）全体で同等であることが見出された。しかし、動物の大きさ（ すなわち、犬&gt;ラット&gt;マウス）の順にランク付けモデル親油性薬物、ハロファントリンの輸送、。スケーリング係数は、このように元に必要とされ得る他の種にラットからのリンパ薬物輸送データをtrapolate。 リンパカニュレーションモデルの制限は、一般に、リンパ管は容器33にカニューレを挿入されると、変更された圧力勾配に対して作用するので、直接リンパ管から受動リンパコレクションはリンパ流および輸送を変更することができるということである。リンパカニュレーションモデルは、技術に精通していない研究室で確立することは困難である。代替モデルは、このように記載されている。例えば、このようなリポタンパク質および親油性分子腸リンパ系を介した因子の輸送は、間接的に採血を介して研究されている。一つのこのようなモデルは、リンパ輸送ブロック34腸リポタンパク質の産生の（シクロヘキシミドを、例えば、コルヒチン、プルロニックL81）を阻害剤の存在下および非存在下での経口投与後の脂質および/ ​​または薬物の血中濃度を比較することを含む。利点血液サンプルの収集を介して間接的にリンパ輸送を定量化モデルの侵襲的手術が35を必要としないように、それは、ヒトにおけるリンパ輸送のいくつかの評価を可能にすることである。しかし、リンパ輸送の阻害剤は特異的ではないとリンパ管を介して輸送される要因は、そのような評価を複雑にし、全身循環中に希釈し、修飾されている。 インビトロ代替物も記載されている。例えば、Caco-2細胞または単離された腸細胞培養物は、より詳細にリンパ36-38に入る分子の腸分泌を研究するために利用されてきた。ヒト腸微小環境のより代表的である高度なin vitroモデルも最近39を説明した。このモデルにおいて、リンパ内皮細胞層は、リンパ管への腸からの物質の移動のより詳細な分析を可能にするのCaco-2細胞と共培養する。しかし、vitrでOセルシステムは、交換の流れを欠き、腸管腔、基礎となる血液とリンパ血管供給にすなわち相互接続を転送します。別のアプローチでは、Kassis ら血管収縮、リンパ流および腸間膜リンパ管33内の蛍光脂質濃度との定量比較を可能にする、その場イメージングシステムにおけるデュアルチャネル（高速明視野ビデオおよび蛍光）を確立した。 インビトロ系における上記に対するこのモデルの利点は、リンパ管を介して免疫細胞の継代の正確な追跡を可能にすることである。質量脂質（または薬物）の絶対測定輸送は、しかしながら、まだイメージング法を使用して確立されていない。 インビトロおよびインシリコ腸リンパ管も40-42公開されているを介して特異的に親油性の薬物輸送の程度を予測することに近づく。いくつかのcは、例えば、ex vivoでの親和性プラズマキロミクロンのためのompoundsは、生体内 41 でのリンパ輸送と合理的に相関することが見出された。その後、同グループは、複数の物理化学的性質40に基づいて、カイロミクロンのための薬物親和性を予測するためにシリコモデルに設立さ。ホルムらもあからさまな分子記述42に基づいて親油性化合物のリンパ輸送を予測するために、 インシリコモデルで比較的複雑なを設立しました。これらのモデルは、未知の薬物のリンパ輸送の程度を予測するための有用なアプローチを提供してもよい。薬物の広い範囲で、別の研究室全体でのモデルの妥当性は、しかし、それらの精度と再現性を確認するために必要とされる。 腸間膜リンパ管のカニューレ挿入は、このように直接小腸および因子（細胞​​、タンパク質の複雑な配列の走行速度を排出リンパのコンテンツを検査する唯一の手段で残るin vivoの状況でリンパ中のペプチド、脂質、薬物）。 】ここで我々を麻酔ラットから腸間膜リンパおよび全身の血液の収集を可能にする腸間膜リンパ管と頸動脈のカニューレ挿入するためのプロトコルについて説明します。代表的なデータは、モデルが腸間膜リンパ系を介して腸からの脂質および薬物輸送を調べるために使用することができる方法を示します。これは、モデルとトラブルシューティングガイドを確立する際に遭遇することができ困難の議論が続いている。確立された後は、モデルは、腸リンパ輸送を調査するための強力なツールです。

<table><tbody><tr><td>滅菌生理食塩水</td><td>バクスターヘルスケア</td><td>AHB 1307</td><td>任意のブランドを使用することができます。例は、バクスター100ml生理食塩水袋、50</td></tr><tr><td>70 %エタノール</td>の水の箱です <td>任意の</td><td></td><td>ブランドを使用できます</td></tr><tr><td>グルコン酸クロルヘキシジン溶液(Microshield 4)</td><td>リビングストンインターナショナル</td><td>JJ60243L</td><td>任意のブランドを使用できます。 http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =</td></tr><tr><td>JJ60243Lベタジン溶液</td><td>リビングストンインターナショナル</td><td>BU0510</td><td>どのブランドでも使用できます。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =BU0510</td></tr><tr><td>腸質ケタミル (ケタミン 100 mg/ml)</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>KETA I 1</td><td>http://www.provet.com.au/</td></tr> <tr><td>Ilium Xylazil (キシラジン 100 mg/ml)</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>TRO-3828</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.provet.com.au/ ACP 10 注射剤 (アセプロマジン 10 mg/ml)</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>VTG-DACP010020</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.provet.com.au/ ペントバルビトンナトリウム</td><td>PROVET VICTORIA&nbsp;</td><td>24529</td><td>任意のブランドを使用できます。ここでの例はLethabarb&regです。325 mg / mlナトリウムペントバルビトン、 Virbac動物衛生。http://www.provet.com.au</td></tr><tr><td>ヘパリン (35000I.U. in 35 mL)</td><td>シグマ・ファーマシューティカル</td>ズ <td>337220</td><td></td></tr> <tr><td>http://sigmaco.com.au/ エチレンジアミン四酢酸(EDTA)二ナトリウム塩二水和物</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>E1644</td><td>ブランドは問いません。ここでの例は、シグマのEDTAの二ナトリウム塩です。&nbsp;</td></tr><tr><td>ポリエチレン(PE)カニューレ 外径 0.96 mm x 内径 0.58 mm</td><td>マイクロチューブエクステンション</td><td>PE8050</td><td>どのブランドでも使用できます。ここでの例は、PEチューブ0.96 x 0.58 mm、30 m</td></tr>ポリエチレン<tr><td>(PE)カニューレ外径0.8 mm x 内径0.5 mm</td>マイクロ<td>チューブエクステンション</td><td>PE9658</td><td>任意のブランドを使用できます。ここでの例は、PEチューブ0.8 x0.5 mm、30 m</td></tr>ルー<tr><td>ラー</td>、<td>任意の</td><td></td><td>ブランド</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>、</td></tr>任意のブランド、<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>任意の<td>、</td></tr>使用可能な<tr><td>、23ゲージの針</td>、<td>リビングストンインターナショナル</td><td>DN23GX0.75LV</td><td>です。どのブランドでも使用できます。ここでの例は、リビングストンの使い捨て針、滅菌、23GX0.75インチ、100 / BOXです。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT= 6&search=DN23GX0.75LV</td></tr><tr><td>25ゲージ針</td><td>Livingstone International</td><td>DN25GX1.0LV</td><td>どんなブランドでも使用できます。ここでの例は、リビングストンの使い捨て針、滅菌、25GX1.0インチ、100 / BOXです。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search= DN25GX1.0LV</td></tr><tr><td>1mlシリンジ</td><td>リビングストン・インターナショナル</td><td>T3SS01TA</td><td>どのブランドでも使用できます。ここでの例は、テルモシリンジ1mlスリップツベルクリン100/ボックスです。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS01TA</td></tr><tr><td>10mlシリンジ</td><td>リビングストン・インターナショナル</td><td>T3SS10SA</td><td>どのブランドでも使用できます。ここでの例は、テルモシリンジ10mlスリップ100/ボックスです。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA</td></tr><tr><td>ガーゼ綿棒</td>リビング<td>ストンインターナショナル</td><td>GSC075</td>任意の<td>ブランドを使用し、必要なサイズにカットすることができます。ここでの例は、綿を7.5x7.5 cm、8プライで充填したガーゼ綿棒です。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =GSC075</td></tr><tr><td>コットンバッド</td><td>リビングストン・インターナショナル</td><td>CTAST075DP</td><td>どのブランドでも使用できます。ここでの例は、リビングストンのコットンアプリケータープラスチックダブルチップです。75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =CTAST075DP</td></tr><tr><td>ヒーティングパッド</td><td>Ratek</td><td>WT1</td><td>温度を37°Cに保つブランドなら何でも使用できます。ここでの例は、Ratekの保温トレイです。</td></tr><tr><td>無影灯</td><td>ハーバード装置</td><td>72-0215 と 72-0267</td><td>どのブランドでも使用できます。ここでの例は、ハーバードの装置V-Lux 1000冷光源と二股グースネックライトガイド、黒、繊維径4.7mm(各アーム)です。http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_ -1_HAI_ProductDetailおよび&nbsp;http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_ ●1_HAI_ProductDetail___</td></tr><tr><td>手術用顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>495005-0014-000</td><td>どのブランドでも使用可能です。例えば、Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C、Stand S Double Spot、KL 300 LEDなどです。https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143</td></tr><tr><td>シルク縫合糸</td><td>リビングストンインターナショナル</td><td>DTSK163019F4</td><td>どのブランドでも使用できます。ここでの例は&nbsp; 3/8 サークル リバース カット シルク縫合糸 3/0 糸 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DTSK163019F4</td></tr>メス<tr><td>刃</td><td>Fine Science Tools(FST)</td><td>10020-00</td><td>どのブランドでも使用可能です。ここでの例はFSTメスブレード#20です。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191</td></tr><tr><td>メスハンドル</td><td>ファインサイエンスツールズ(FST)</td><td>10004-13</td><td>どのブランドでも使用できます。ここでの例はFSTメスハンドル#4です。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51</td></tr><tr><td>1 x 小型手術用ハサミ</td><td>ファイン サイエンス ツール (FST)</td><td>14060-09</td><td>どのブランドでも使用できます。ここでの例は、FSTファインハサミ、9 cm、刃先21 mm、シャープ、ストレートです。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17</td></tr><tr><td>2 x 鋸歯状の湾曲した先端を持つ鉗子</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11001-13</td><td>どのブランドでも使用できます。ここでの例は、湾曲した2.8x1.4mmの先端を持つFST 13cm標準パターン鉗子です。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32</td></tr><tr><td>1 x 虹彩切除はさみ</td><td>ファイン サイエンス ツール (FST)</td><td>15000-08</td><td>どのブランドでも使用できます。ここでの例は、FST Vannasスプリングはさみ-2.5mmカッティングエッジ、ストレートです。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16&nbsp;</td></tr><tr><td>1 x ストレートセレーテッドチップ付き鉗子</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11650-10</td><td>どのブランドでも使用できます。ここでの例は、FST Graefe 10 cm ストレートで、先端が 1 x 0.99 mm の鋸歯状になっています。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32</td></tr><tr><td>1 x 鉗子、滑らかでシャープなストレートファインチップ</td><td>ファインサイエンスツールズ(FST)</td><td>11251-10</td><td>どのブランドでも使用できます。ここでの例は、FST Dumont #5 鉗子 ストレート 11cm で、先端は 0.08 x 0.04mm です。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29</td></tr><tr><td>1 x 鉗子 滑らかで細かい湾曲した鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール (FST)</td><td>11063-07</td><td>どのブランドでも使用できます。ここでの例は、滑らかな0.4 x 0.3mmの先端を持つFSTデリケート鉗子9cmです。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360</td></tr><tr><td>2 x Hemostats</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>13010-12</td><td>どのブランドでも使用できます。すべてのオペレーターが止血剤を使用するわけではありません。例としては、長さ20 mm x 幅1.3 mmの鋸歯状のまっすぐな先端を持つFST 12 cm Micro-Mosquito Hemostatsがあります。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33</td></tr><tr><td>1 x 縫合糸ニードルホルダー</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>12001-13</td><td>どのブランドでも使用できます。ここでの例は、長さ16mm×幅1.9mmの先端を持つFST 13cm Hasleyニードルホルダーです。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70</td></tr><tr><td>1 x 動脈クランプ</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>18050-28</td><td>どのブランドでも使用できます。ここでの例は、FSTブルドッグSerrefinesストレート、長さ28mm、9x1.6mmの顎寸法で、ミディアムクランププレスです。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82</td></tr><tr><td>オレイン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1008</td><td>必要に応じて、どのブランドでも使用できます。ここでの例は、99%の純粋なオレイン酸です。http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>14C-オレイン酸</td><td>パーキン&nbsp;</td><td>NEC317050UC&nbsp;</td><td>どのブランドでも使用できます。ここでの例は、オレイン酸、[1-14C]-、50&microです。CI (1.85MBq)。http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC</td></tr><tr><td>タウロコール酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4009</td><td>どのブランドでも使用できます。ここでの例は、タウロコール酸ナトリウム塩水和物&geです。95%(TLC)です。http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>ハロファントリン</td><td>グラクソ・スミス・クライン</td><td></td>・<td>ハロファントリンは、グラクソ・スミス・クライン・ホ</td></tr><tr><td>スフェートナトリウム・モノベーシック</td><td>・シグマ・アルドリッチ</td><td>71507</td>からの贈り物として提供されました<td>。ここでの例は、分子生物学用のリン酸ナトリウム一塩基性一水和物であるBioXtra、>99.5%です。http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71643</td><td>どのブランドでも使用できます。ここでの例は、分子生物学のためのリン酸ナトリウム二塩基性二水和物、BioUltra、>99%です。http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&region=AU</td></tr></tbody></table>

腸間膜リンパダクトカニューレを挿入ラットモデル：腸のリンパ医薬品輸送の評価への応用

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

腸のリンパ系は、流体輸送、脂質吸収および免疫機能において重要な役割を果たしている。リンパは上腸間膜リンパ管に収束リンパ管と一連のノードを経由して小腸から直接流れます。腸間膜リンパ管のカニュレーションは、このように腸から流れる腸間膜リンパの収集を可能にします。腸間膜リンパは、免疫細胞（99％リンパ球）、水性画分（流体、例えばサイトカインおよび消化管ホルモンなどのペプチドおよびタンパク質）およびリポタンパク質画分（脂質、親油性分子とアポ蛋白質）の細胞画分で構成されています。腸間膜リンパ管カニュレーションモデルは、従って、リンパ系を介して濃度および腸からの因子の範囲の輸送速度を測定するために使用することができる。別の課題に応じて、これらの要因への変更（ 例えば、ダイエット、抗原、薬物）と疾病（ 例えば、炎症性腸疾患、HIVは、糖尿病）は、Bもできるeが決定。関心の拡大領域は、腸脂質吸収経路に関連付ける経口投与した親油性薬物およびプロドラッグの吸収のリンパ輸送の役割である。ここでは、詳細には、腸内送達後数時間リンパ系を介して脂質および薬物輸送の速度および程度を評価することができる腸間膜リンパ管カニューレ挿入ラットモデルを記述する。この方法は、リンパ内の他のパラメータの測定に容易に適合可能である。我々は、実験の成功を確認し、得られたデータを解釈する方法に関する指示を提供するために、この複雑な外科的方法を確立する際に遭遇することが困難の詳細な説明、ならびに失敗と成功した実験からの代表的なデータを提供する。

腸間膜リンパカニュレーションモデルを使用して、腸送達の後リンパ系を介して脂質および薬物輸送の累積範囲および速度を定量するための代表的な実験の結果を図4および図5に示す。この実験では、モデルの親油性200μgのとリン酸緩衝5 mMのタウロコール酸ナトリウムの5.6ミリリットル中に分散7.1 mgの2-モノオレイン-薬物ハロファントリンは、40mgの（5μCiの14 C-オレイン酸2を含む）のオレイン酸を含有する製剤中に2時間かけてラットの十二指腸内に投与した生理食塩水のpHは6.9。製剤投与後のラットは、2.8ミリリットル/十二指腸内に注入生理食塩水と時間の速度で再水和した。リンパは10時間毎時間を変更したチューブ内に連続して採取した。すべて同じCOMPONを含有する製剤について前述したプロトコルに従って、配合物を調製し、実験を行っそれを除くエントは2-モノオレイン43を含んでいませんでした。 1.3ミリリットル/時- 図4に示すように、...

ここでは、ラットの腸間膜リンパ管をカニューレ挿入する技術について説明し、これにより、腸管送達後のリンパ系を介した脂質および薬物輸送の定量化を可能にします。この技術は、腸間膜リンパの濃度および/または体液、免疫細胞、ペプチド、タンパク質、親油性分子の輸送を評価するために適応させることができます。

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

この手順の総合的な目的は、腸管投与後の腸管リンパ系への脂質および薬物の輸送速度と輸送量を評価することです。まず、リンパ液を回収するために腸間膜リンパ管を単離してカニュレーションします。次に、腸管内への注入を可能にするために十二指腸をカニュレーションし、続いて血液サンプルを採取するために頸動脈をカニュレーションします。最終ステップでは、実験的処置を十二指腸に投与し、全身の脂質または薬物レベルを定量するためにリンパ液および血液を採取します。最終的に、このモデルは、腸管投与後の脂質および薬物の総吸収量および腸管リンパ輸送を評価するために使用できます。この手法の主な利点は、腸間膜リンパ管に直接カニューレを挿入し、実験期間全体にわたってリンパ液を採取できることです。これにより、腸間膜リンパへと流入し、そこを通過する物質の絶対量を推定することが可能になります。このモデルは、薬剤および脂質の輸送をin vivoで評価することを可能にするだけでなく、任意の関心因子の腸管リンパ輸送や、さまざまな刺激または疾患状態に応じたそれら因子のリンパ輸送の変化を測定するためにも使用できます。腸間膜リンパ管のカニューレ挿入は、管が細く脆弱であること、また絶食させた動物ではさらに困難で複雑であるため、本手法の視覚的な実演が極めて重要となります。本手順の実演は、モナシュ大学の同僚であり教職員であるDr.Natalie cusと、研究グループのシニアポストドクターであるDr.LJ Hughが行います。手術の前日に、カニューレを適切な長さに切り、滅菌外科用メスを使用して各チューブの先端にベベル（斜面）を作成します。次に、十二指腸内カニューレを準備するため、カニューレをループ状に折り返し、加熱してチューブにアンカーポイントを作成します。手術当日、麻酔をかけた成体ラットの腹部右側、頸部、および左鎖骨領域の被毛を剃毛し、リンパ管にカニューレを挿入するため、ポビドンヨード溶液と70% ethanolを用いて3回連続で外科的領域を無菌的に洗浄します。動物の右側を上に向け、滅菌メス刃を用いて、剣状突起から肋骨縁の約2 cm下の右側腹部に向かって4 cmの直線的な切開を加え、腹壁筋の最上層を開きます。小腸を腹壁の左側に寄せ、生理食塩水で浸した2〜3枚の滅菌ガーゼを用いて固定します。次に、ラットの右腎臓の高さで、動物の背中の下に水平に置いた10 milliliterのプラスチック製シリンジの上にラットを跨がせます。腸間膜リンパ管の視認を容易にするため、右腎臓に対して垂直で、暗赤色に拍動する腸間膜動脈の直前（吻側）に平行に走る、直径約0.5〜1 millimeterの上腸間膜リンパ管を確認します。ここで示しているような非絶食ラットでは、上腸間膜リンパ管は白く不透明であり、絶食ラットよりも視認しやすいことに注意してください。次に、右腎臓の下縁にある会陰脂肪床を、上腸間膜リンパ管と平行に、かつ大静脈の直下の結締組織層を通して、直線ピンセットで貫通させます。次に、ピンセットの先を用いてリンパカニューレを会陰脂肪床に通し、一方の端を腸間膜リンパ管に隣接させ、もう一方の端を右腎臓の高さで動物の体外へ出します。その後、手術用顕微鏡と精密ピンセットを用い、下端から鈍的に剥離して、上層の結締組織および脂肪組織から腸間膜リンパ管を単離します。この際、リンパ管を損傷しないよう注意してください。微細先ピンセットの先端を使用して、リンパ管に小さな穴を開けます。リンパカニューレに抗凝固剤溶液が完全に満たされ、気泡がないことを確認した後、小型ピンセットを用いて、穿刺部位から腸間膜リンパ管の内部に約2〜4 mmまでリンパカニューレを挿入します。カニューレ挿入が成功すると、カニューレの自由端から腸管リンパ液が徐々に流出するのが観察されます。この現象が起きた場合は、シアノアクリレート系接着剤をリンパ管の挿入口に少量滴下してカニューレを固定します。その際、接着剤を塗りすぎて血管を閉塞させないよう注意してください。十二指腸にカニューレを挿入するには、まず、小腸の鮮やかなピンク色の部分を確認し、ゆっくりと下方へ引いて胃を露出させます。次に、滅菌済みの23ゲージ針を用い、胃と十二指腸の接合部から約2 cm下の幽門付近にある十二指腸に小さな穿刺孔を開けます。次に、十二指腸カニューレのJ字型のフック端を穿刺部位に挿入し、Sanoアクリレート接着剤を1滴用いてカニューレを固定します。その後、縫合糸を用いて腹筋壁の切開部を閉鎖します。頸動脈カニューレ挿入は、腸間膜リンパ管のカニューレ挿入前または後に行うことができます。通常、動物を移動させる際にリンパ管カニューレが脱落する可能性を低くするため、リンパ管のカニューレ挿入前に頸動脈のカニューレ挿入を行うことを推奨します。頸動脈にカニューレを挿入するには、まず頸動脈カニューレの斜端から2.5 centimetersの箇所に印を付け、動脈内に挿入するチューブ部分を特定します。次に、カニューレの斜面のない端を、抗凝固剤溶液を満たしたシリンジに取り付けられた25ゲージの針に接続し、気泡が入らないように注意しながらカニューレ内に溶液を満たします。続いて、正中面において気管の左上の皮膚層に1～1.5 cmの縦切開を加え、鈍端ピンセットを用いて皮下結合組織を剥離し、下層にある一対の頸筋を露出させます。頸筋を牽引し、皮膚表面から約1 cm下に位置する拍動している左総頸動脈を露出させます。次に、鈍的剥離によって動脈上の結合組織を除去し、鈍的組織ピンセットを用いて、動脈の約1 cmの区間を単離します。続いて、微細先端ピンセットを使用して、単離した動脈区間の両端に2本の絹糸を総頸動脈の下に通します。その後、ラットの心臓および鎖骨から最も遠い側の縫合糸を結紮し、総頸動脈の下に直線状の微細先端ピンセットを置いて、動脈内の血流を遮断します。次に、細いチップのアイリス剪刀を用いて、単離領域の上端から約3分の1の位置にある動脈の上面に小さな切開を加えます。曲がりチップのピンセットを用いて、カニューレの先端を動脈内に挿入します。挿入後、直線的な細いチップのピンセットを取り除いて血流を遮断し、2組のピンセットを使用してカニューレを動脈内に2.5 centimeters進めます。一人がカニューレを動脈内に保持して血液の逆流を防ぎ、もう一人がカニューレを挿入します。その後、小型の動脈クランプを使用してカニューレを動脈内に固定します。カニューレに抗凝固剤溶液を注入し、続いて少量の血液を吸引して、チューブの開通性を確認します。次に、カニューレを抗凝固剤溶液でフラッシュし、ライターの火で先端を封止します。最後に、縫合糸を使用してカニューレを固定し、動脈クランプを取り除きます。その後、動脈とカニューレの周囲に3本目の縫合糸で固定し、動脈周囲の縫合糸の長さを短くし、回復期間を経て、さらに縫合糸で頸部の創傷を閉鎖し、十二指腸カニューレを介して目的の製剤を動物に注入しました。モデルとして親油性薬剤であるhalal faneneを投与した後のグラフに示されているように、カニュレーションに成功したラットの平均リンパ流量は0.4から1.3 milliliters per hourの間でした。一部の個体では、カニュレーション後の最初の1〜3時間はリンパ流量がわずかに低く、その後増加しましたが、これはリンパ管カニュレーション成功後に一般的に観察される現象です。一方、カニュレーションに失敗したラットでは、採取期間を通じて流量が成功した実験例よりも大幅に低いままでした。同様に、これらの代表的な実験において、トリグリセリドおよびhalal RINの累積リンパ輸送量は、カニュレーションに失敗した動物において大幅に低くなりました。一方、カニュレーションに成功した群では、平均累積halalan輸送量は投与量の15.1%であり、累積トリグリセリド輸送量は10時間で61 milligramsでした。この代表的な脂質輸送実験において、リンパ系に輸送された投与済みの放射標識外来脂質投与量の割合は54%でした。これらの値は、以前に観察された値と有意な差はありませんでした。同様の処方において、トリグリセリドおよび薬物のリンパ輸送速度は、脂質および薬物の投与後数時間でピークに達し、その後ベースラインレベルに戻ります。これは、腸管リンパ管における脂質および薬物の輸送実験で一般的に見られる傾向です。各時間帯におけるリンパ中の薬物輸送速度は、薬物がリンパへ輸送されるため、トリグリセリド輸送の挙動を反映しています。トリグリセリドに富むリポタンパク質との関連において、一度習得すれば、困難が生じない限りカニューレ挿入は30分以内に完了できます。この処置に続き、採取したリンパ液中の成分を単離し、受容動物への再注入などの追加実験に用いることで、その機能、代謝、クリアランス、または分布パターンを直接的に評価することが可能です。このビデオを視聴することで、腸間膜リンパ管、総頸動脈、および十二指腸を単離し、カニューレを挿入する技術について十分に理解できるはずです。これらの手法を用いることで、腸管から腸間膜リンパ管を経由して、あるいはその中へと輸送される薬剤、脂質、およびその他の因子の輸送を、Vivaで評価できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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鼠径リンパ節の生体顕微鏡

学ぶ腸間膜リンパダクトカニューレ挿入法で、ラットを用いて脂質と医薬品の腸管リンパ輸送を定量的に評価する技術。この方法は薬物吸収メカニズムの解析に有用です。

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