Name: 精製された野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成とチャネル活性の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 学ぶCFTRタンパク質の機能的再構成とチャネル活性測定法。精製した野生型および変異型CFTRをプロテオリポソームに再構成し、ヨウ化物選択電極でリアルタイムにイオン輸送をモニタリングすることで、嚢胞性線維症治療薬開発に有用な知見を得る。

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。

<ol><li>Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+mechanisms+underlying+CFTR+channel+activity%2C+the+molecular+basis+for+cystic+fibrosis+and+strategies+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy.</a> Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).</li>
<li>Bear, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+functional+reconstitution+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Cell. 68 (4), 809-818 (1992).</li>
<li>Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+high-resolution+single-channel+recording+to+functional+studies+of+cystic+fibrosis+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants.</a> Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).</li>
<li>Genetic Analysis Consortium. , 
 <a target="_blank" href="http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html">http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html</a> (1989).</li>
<li>Kerem, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene%3A+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis.</a> Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+defective+anion+transport+in+L+cells+expressing+recombinant+forms+of+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR.</a> Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).</li>
<li>Mendoza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+efficient+correction+of+DeltaF508+CFTR+revealed+by+analyses+of+evolved+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences.</a> Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).</li>
<li>Rabeh, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+both+NBD1+energetics+and+domain+interface+is+required+to+restore+DeltaF508+CFTR+folding+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function.</a> Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).</li>
<li>Aleksandrov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+modulation+balances+thermodynamic+stability+and+restores+function+of+DeltaF508%5BTitle%5D)+AND+%22CFTR.+J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508.</a> CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).</li>
<li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
<li>Riordan, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+recombinant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+from+Chinese+hamster+ovary+and+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells.</a> J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).</li>
<li>Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).</li>
<li>Peng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+affinity+isolation+of+recombinant+protein+using+the+baculovirus%2Finsect+cell+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system.</a> Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).</li>
<li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+reconstitution+of+epithelial+chloride+channel+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).</li>
<li>Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+protein+derived+from+the+baculovirus+expression+system+using+glutathione+affinity+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose.</a> Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).</li>
<li>Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29+opens+the+defective+channel+gate+of+mutant+CFTR+in+a+phosphorylation-dependent+but+ATP-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner.</a> J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).</li>
<li>Alkhouri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+properties+of+molecular+probes+for+the+rescue+site+on+mutant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).</li>
<li>Eckford, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VX-809+and+Related+Corrector+Compounds+Exhibit+Secondary+Activity+Stabilizing+Active+F508del-CFTR+after+Its+Partial+Rescue+to+the+Cell+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface.</a> Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).</li>
<li>Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+corrector+modifies+the+channel+function+of+F508del-CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR.</a> Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).</li>
<li>Verkman, A. S., Galietta, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+channels+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Chloride channels as drug targets.</a> Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).</li>
<li>Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+of+a+small-molecule+modulator+with+G551D-CFTR%2C+a+cystic+fibrosis-causing+mutation+associated+with+severe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease.</a> Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).</li>
<li>Norez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+CFTR+chloride+channel+activity+and+pharmacology+using+radiotracer+flux+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods.</a> J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).</li>
<li>Whitney, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+alginate+secretion+across+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).</li>
<li>Islam, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-dependent+gating+and+proton+uptake+by+Wzx+support+O-antigen-subunit+antiport+across+the+bacterial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane.</a> mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamjeesingh%2C+M+%22Reliable+Lab+Solutions%3A+Essential+Ion+Channel+MethodsReliable+Lab+Solutions%22">Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions</a>. Conn, P. M. , Academic Press. 337-357 (2010).</li>
<li>Wellhauser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).</li>
<li>Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+purified+human+Hv1+H%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels.</a> J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).</li>
<li>Chang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+A+%28PKA%29+still+activates+CFTR+chloride+channel+after+mutagenesis+of+all+10+PKA+consensus+phosphorylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites.</a> J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).</li>
<li>Gadsby, D. C., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CFTR+Cl-+ion+channels+by+phosphorylation+and+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Second+Messenger+Phosphoprotein+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation.</a> Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).</li>
<li>Ma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinone+CFTR+inhibitor+identified+by+high-throughput+screening+blocks+cholera+toxin-induced+intestinal+fluid+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion.</a> J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).</li>
<li>Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+CFTR+inhibition+by+a+thiazolidinone+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative.</a> J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).</li>
<li>Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+new+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+inhibitor+on+Cl-+conductance+in+human+sweat+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts.</a> Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).</li>
</ol>

著者は、ここに記載される精製方法の開発中に博士Mohabir Ramjeesinghの助言を認める。これらの研究は、ヘルスリサーチ（CIHR）および嚢胞性線維症カナダ（CFC）のカナダの研究所からのCEBに営業補助金によってサポートされていました。 PDWEはCIHRとCFCを通じてフェローシップ賞によって部分的にサポートされていました。著者は、嚢胞性線維症財団ピュー（CFFT）による補正、増強博士R·ブリッジズ（医学部のロザリンド大学と科学）から阻害剤化合物および流通の提供を認める。著者はまた、バキュロウイルス系を用いて、重量および変異型CFTRタンパク質を発現するにベイラー細胞培養施設（NIH助成金をP30 CA125123）により優れたサービスを認める。非アクティブなVX-770アナログ、V-09から1188には、バーテックス·ファーマシューティカルズの贈り物だった。

細胞の過剰発現システムの様々な、完全長の、機能的なCFTRの単離のための精製プロトコルの数が限られている。それはWT-CFTRまたはATPアーゼ、平面二重層内の単一チャネル測定を含むチャネル機能の直接測定を含むアッセイにおいて、高機能である適度な量のF508del-とG551D-CFTRの高濃縮の迅速な精製を可能にするように、ここで説明する方法は有利である小分子19-21の研究に関連性の高いシステムとCFTR人口チャネル機能の実証された措置。精製方法は、迅速かつ効果的な再構成プロトコルに統合され、他の方法よりしかし、精製されたタンパク質は、精製洗剤も同様除去に適しているという条件で、同様にこの再構成プロトコルに結合することができる。 EXCから、複雑で骨の折れる単一チャンネルの実験とは対照的にised膜パッチは、ここに記載される方法は、CFTRチャネル機能の堅牢なまだ直接的な評価を可能にし、独自にこの指標は、CFTRチャネルではなく、一つまたは少数の分子の大きな集団の機能を報告します。膜パッチを含む技術とは異なり、この方法は、結合された精製手順の有効性に応じ...

肺、腸、膵臓および汗腺などの組織における上皮細胞の頂端膜を横切る塩化物輸送は、主に嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）、ATP-とABCのリン酸化調節性メンバー（ATP-によって媒介される1で概説膜タンパク質のカセット）Cサブファミリー（）を結合。 ABCCサブファミリーの他のメンバーと同様に、CFTRは、単一で、適度なATPアーゼ活性を有し、そのヌクレオチド結合ドメイン（NBDは）の界面に形成された2つのヌクレオチド結合部位にATPが結合する大規模なマルチスパニング膜内在性タンパク質であるサイト。しかし、他のABCCサブファミリーメンバーとは異なり、CFTRは、固有の規制のClチャネルとしてではなく、アクティブな溶質輸送体として発展してきた。 morbiにつながるCFTR原因嚢胞性線維症、肺、消化管、膵臓および生殖器官を含む複数の器官に影響を与える疾患の変異、若年成人におけるdityと死亡。肺疾患は、典型的には、嚢胞性線維症、早期死亡を占めており、ほとんどの場合、誘導気道の表面上皮におけるCFTR機能の喪失によって引き起こされる。繊毛気道上皮の頂端面上に流体層を変更するために表面上皮を横切って水の動き- CFTR塩素イオンチャネル活性の欠如は、両方のClの減少を引き起こす。これは、繊毛呼吸上皮細胞、気道の外に効果的に明確な病原体の能力を損なう粘性の気道表面液が得られる。結果として、ほとんどのCF患者は、肺感染症や炎症による肺損傷の再発発作に苦しむ。 予想されるように、正常なCFTRタンパク質の作用メカニズムの研究は、主に、チャネルゲーティング活動の詳細な電気生理学的研究に焦点を当てた。シングルチャネルの研究では、PKA-依存性Clとして直接そのCFTR機能を示している- ATP規制ゲート2を有しているチャンネル。詳細な電気生理学的研究は、単一のCFTRチャネル1,3上の大量の情報を提供する、しかし研究されており、任意の特定の単一チャネルの特性はCFTRチャネルの全人口、したがって、単一チャネルを反映しているかどうかの懸念があるかもしれ結果は常に巨視的人口を研究するための方法と一緒に考慮されるべきである。精製されたCFTRの人口チャネル活性の直接アッセイは、疾患を引き起こす突然変異と関連する分子の欠陥への洞察を提供し、化学モジュレーター修復変異CFTRタンパク質の発見を駆動する可能性がある。現在までに、嚢胞性線維症4を引き起こすと考えCFTRにおける1900の異なる変異を超えるがある。北米と欧州で患者の約90％の少なくとも一つの対立遺伝子に見られる主要な突然変異、F508del-CFTRは、誤った折り畳みタンパク質につながるND小胞体5における保持。 F508del-CFTRはまた、不良チャネル活性6-9を含む他の結果を持っています。細胞表面からのCFTRの結果として存在しないことは、重篤な疾患と関連している。 G551D-CFTR、あまり一般的変異は、正しくまだ折り畳まれた細胞表面6における塩素イオンチャネルとして機能不全であることが考えられている。小分子補正器及び増強剤の開発は、それぞれ、細胞表面に存在フォールディングおよび/またはそのような細胞表面へF508del-CFTRのような変異体のトラフィッキング、および増強の補正や、G551Dような変異のチャンネル活性を増加させるという目標を有する。補正器VX-809およびVX-661は、（まだ患者での使用が承認されていませんが、増強Kalydeco（ivacaftor、VX-770）は、少なくとも1つのG551Dを持つすべての12 CF患者におけるHR&gt; 6歳150ミリグラムで使用されているG178R、S549N、S549R、G551S、G1244E、S1251N、S1255Pの1の患者のためのより最近-CFTR突然変異、及びとG1349D。 Kalydeco安全かつCF疾患10の臨床的指標の改善をもたらすの両方が、しかし、この小分子の作用機序は十分に患者に使用するためのFDA承認の際に理解している。 CFTRの精製方法の一握りが完了するまでにかなりの時間を必要とする多くは、2,11-18、以前に記載されている。最近の刊行物19には、ユニークな精製および再構成の方法は、S fは 9細胞発現系において過剰発現CFTRについて記載し、定義された脂質系において、この精製されたタンパク質は、CFTRの集団CFTRハロゲンチャネル活性アッセイを開発するために使用された分子。アッセイは、CFTR機能上のリン酸化、ヌクレオチドおよび阻害剤の既知の効果を再現。システムは、重量（野生型）、F508del-及びG551D-CFTRに増強VX-770 / Kalydecoの効果を調べるために使用し、それを最初にするために示された薬物が母集団の観点からCFTRおよびヌクレオチドおよび小分子を有する突然変異体の相互作用の研究にこれらの方法の有用性および適用可能性を実証し、ATP非依存的に、チャネル活性を増強するためにCFTRタンパク質と直接相互作用時間タンパク質約臨床的に関連する質問に答える。方法はまた、他の増強剤分子およびそれらの誘導体20、ならびにタンパク質21の活性に対する小分子の補正の効果を研究するために使用されている。 流出アッセイは、以前に、電極、放射性トレーサー、およびフルオロフォア22,23を用いて、全細胞アッセイは、イオン選択性電極24を有する膜小胞を含むCFTR突然変異体の活性およびその活性に対するCFTR調節性化合物の効果を調査するために多くの研究で使用されている、放射性トレーサー25を用いて再構成CFTRを精製した。しかし目精製された再構成されたCFTRを研究するためのイオン選択電極の電子の使用が最初に最近19報告された。現在の方法の応用は、再構成および緑膿菌 、共通CF病原体における2つの膜タンパク質の機能的特徴付けのために使用されてきた。ヨウ化物流出測定と結合して精製AlgE外膜タンパク質の再構成は、このトランス26を介してアニオン性アルギン酸塩分泌のためのモデルをサポートするために使用された。再構成およびヨウ化物流出測定は、モデルは、このタンパク質27によって細菌の内膜を横切る脂質結合オリゴ糖転位のためのH +依存性アンチポートメカニズムを示唆して提案することが許可され精製された例えば、wzxタンパク質に適用した。どちらの場合も、ヨウ化物は、一つは天然基質のために期待するかもしれないよりも低いスループットではあるが、アニオン性基板の代わりとして使用された。この方法は、cと他のタンパク質への適応のために適切であり得るアニオン性基板のためationic輸送又は伝導経路。 ここで迅速な精製手順は、CFTRタンパク質と定義された脂質のプロテオリポソー​​ムへの再構成のために記載されている。迅速な再構成手順は容易に精製において使用される界面活性剤の種類は、ここで使用される方法による除去に適しているか、再構成手順の前に適切な界面活性剤に交換することができれば、他の方法によって精製CFTRでの使用のために調整することができる。精製された再構成CFTRタンパク質のチャンネル活性を測定するためのヨウ化物流出方法について詳細に説明すると、この方法から得ることができるいくつかの典型的な結果を示す。

<table><tbody><tr><td>fos-choline 14洗剤</td><td>Anatrace Affymetrix(www.anatrace.affymetrix.com)</td><td>F312</td><td>Affymetrix:Anatrace製品;CAS#&nbsp;:77733-28-9</td></tr><tr><td>cOmplete EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠</td><td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td><td>04 693 132 001</td><td>EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠 (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH;Ref: 11873 580 001)</td></tr><tr><td>cOmplete ULTRA錠、ミニ、EDTAフリー、EASYpack&nbsp;</td><td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td><td>05 892 791 001</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qaigen GmbH</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand スクリーニングカラム</td><td>Fisher Healthcare</td><td>11-387-50</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K</td><td>Millipore (www.millipore.com)</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit</td><td>ニューイングランドバイオラボ (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)</td><td></td><td>パースPKAも適切な</td></tr><tr><td>PC、チキンエッグ</td><td>アバンティ極脂質 (www.avantilipids.com)</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>POP™</td><td>アバンティ極脂質 (www.avantilipids.com)</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>PS、ブタ脳</td><td>アバンティ極脂質 (www.avantilipids.com)</td><td>840032C</td><td>CFTRは、卵PC、POPC、2:1(w / w)卵PC:POPC、またはPE:PS:PC:エルゴステロール、5:2:2:1(w / w)</td></tr><tr><td>PE、鶏卵</td><td>Avanti極性脂質(www.avantilipids.com)</td><td>841118C</td><td></td></tr><tr><td>エルゴステロール</td><td>シグマ(www.sigmaaldrich.com)</td><td>45480</td><td></td></tr><tr><td>ピアス洗剤除去スピンカラム</td><td>Thermo Scientific</td><td>87779</td><td>1 ml容量カラム</td></tr><tr><td>バリノマイシンに正常に再構成されています</td><td>シグマ (www.sigmaaldrich.com)</td><td>V-0627</td><td></td></tr><tr><td>VX-770 (ivacaftor)</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1144</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化物選択的微小電極</td><td>ラザール研究所 (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)</td><td>LIS-146ICM</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Clampex 8.1ソフトウェア</td><td>Axon Instruments(www.axon.com)</td><td></td><td>私たちは、電極への応答を監視および記録するために、自家製のフィルターを備えたClampXシステムのコンポーネントを使用します</td></tr><tr><td>代替ソフトウェア:ArrowLabbシステム&nbsp;</td><td>ラザール研究所 (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)</td><td>LIS-146LICM-XS</td><td>ラザール研究所では、プローブの応答を記録するためのコンピュータやソフトウェアと連動するメーターを販売しています。&nbsp;このソフトウェアは、セットアップと同様の機能を提供する必要があります。</td></tr><tr><td>小さな攪拌子</td><td>Big Science Inc (www.stirbars.com)</td><td>SBM-0502-CMB</td><td>96ウェルプレートの井戸に簡単に収まるほど小さい攪拌子を選択します</td></tr><tr><td>Sephadex G50, fine</td><td>GE Health Care (www.gelifesciences.com)</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Laboratory Supplies Co, Inc.</td><td>G112SP1G</td><td>他のメーカーのバスソニケーターも適しているはずです</td></tr></tbody></table>

精製された野生型および変異型cftrタンパク質の機能的再構成とチャネル活性の測定

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）の輸送体のATP結合カセット（ABC）スーパーファミリーのユニークな流路形成部材である。 CFTRのリン酸化およびヌクレオチド依存性クロライドチャネル活性は、しばしば全細胞系および切除した膜パッチの単一チャネルとして研究されている。多くの嚢胞性線維症の原因となる変異はこの活性を変化させることが示されている。精製プロトコールの少数が公開されているが、チャネルの活性を保持する高速再構成方法及び精製系人口チャネル活性を研究するための適切な方法は、欠けている。ここで迅速な方法は、調整されたハロゲン化チャネルとしての活性を保持して定義された脂質組成物のプロテオリポソー​​ムに精製および全長CFTRタンパク質の機能的再構成のために記載されている。一緒にチャンネル活性の新規のフラックスベースのアッセイと、この再構成方法は、適したシステムである野生型CFTRと病気の原因となる変異体F508del-とG551D-CFTRの人口チャネル特性を研究。具体的には、本方法は、リン酸化、ヌクレオチドおよびそのようなCFTRチャネル活性における増強および阻害剤としての小分子の直接的な効果の研究において有用性を有する。方法はまた、アニオン性基材用の他の膜チャネル/トランスポーターの研究に適している。

この書かれた刊行物、精製および再CFTRタンパク質の調節されたチャネル活性を測定するための方法が記載される。 図1aは、精製、再構成およびヨウ化物流出手順のためのワークフローを示している。ヨウ化物フラックスによる再構成およびチャンネル活性測定のための方法は、関連するビデオにさらに詳細に示されている。 プロテオへのCFTRの精製と再構成 CFTRは、機能的重量または変異CFTR cDNAの2を含む組換えバキュロウイルスを使用して9個fは Sにおいて高レベルで発現させることができる。哺乳動物発現系ではないが、CFTRは、高レベルの発現を確実にするためにS fは 9細胞をバキュロウイルス系を用いて発現させた。 CFTRの生産は、全細胞タンパク質17,28の1％にもなり得る。 9-バキュロウイルス系fの Sタンパク質は、グリコシル化、コアとなるという利点を有するこのシステムの品質管理機構がCFTRおよび変...

ここで説明すると、嚢胞性線維症における欠陥があるこの塩素チャネル、のための活動を維持して精製野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成するための迅速かつ効果的な手続きである。 CFTRによって媒介され、再構成プロテオリポソー​​ムからヨウ化物流出は、チャネル活性の研究や小分子の効果を可能にする。

精製された野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成とチャネル活性の測定

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

本手順の全体的な目的は、再構成系においてCFTRチャネル群の機能を測定し、モジュレーター分子の存在に対するチャネルの応答を調べることです。これは、まず迅速精製法を用いてSf9細胞から野生型または変異型CFTRタンパク質を精製し、界面活性剤溶液中で機能的なCFTRタンパク質を得ることによって達成されます。次のステップでは、精製したタンパク質を、実験者が選択した特定の脂質で構成されるプロテオリポソームに再構成します。次に、余剰なリポソーム内ヨウ化物を除去することで膜を介したヨウ化物の化学勾配を形成し、CFTRチャネルを通じたイオン移動の駆動力を生成します。最終ステップでは、目的のモジュレーター分子の存在下でチャネルを活性化させ、プロテオリポソームからのヨウ化物放出を開始させます。最終的に、ヨウ化物選択電極を用いて、この再構成系におけるCFTRチャネル機能をリアルタイムでモニタリングします。本手法により、リン脂質リポソームに再構成した精製CFTR分子集団のクロライドチャネル活性を解析することが可能です。本手法はCFTRチャネルの機能および低分子モジュレーターの影響についての知見を得るために決定されましたが、他の膜タンパク質の機能解析などの他のシステムにも適用できます。本手法を初めて行う際は、使用するシステムに合わせてタンパク質と脂質の比率を最適化すること、機能不全または低機能なタンパク質を使用していないこと、および十分に封止されたベシクル間に十分なヨウ化物勾配を形成させていることを確認してください。脂質の調製のため、まず非ホウケイ酸ガラス管内で5 mgの卵黄ホスファチジルコリン（egg PC）を、アルゴンガス気流下、室温で20分間乾燥させます。次に、テキストプロトコルに示されている通りに必要なバッファー6の量を算出し、バッファー6を脂質に直接加えます。ガラス管をパーフィルで封止し、室温で2分間ボルテックスして、脂質をバッファー中に懸濁させます。次に、1 mL シリンジに 25 ゲージの針を取り付け、チューブの壁面に脂質膜が見えなくなるまで、室温で脂質を懸濁させます。脂質の懸濁により、バッファーは白濁します。氷を入れたバス型ソニケーターを用いて、チューブ内の脂質を 22 回目のバーストで超音波処理し、その後チューブを氷上に置いて 1 分間静置します。このサイクルを3回繰り返します。次に、CFTRタンパク質を脂質に加え、最終容量を1 mLにします。25ゲージの針を用いて、タンパク質と脂質懸濁液を10回混合します。サンプルを氷上に30分間置き、インキュベート中に5分ごとにチューブを5回旋回させて混合します。使い捨ての界面活性剤結合スピンカラムの底部のタブを折り、2000 ×gで2分間遠心分離します。保存バッファーを除去するため、カラムを5 mLのバッファー7で洗浄し、2000 ×gで4分間遠心分離して洗浄バッファーを溶出させます。カラムを3回洗浄し、1 mLのタンパク質脂質サンプル全量をカラムレジンの上部に移した後、室温で2分間インキュベートします。室温にて2000 ×gで4分間、カラムを遠心分離します。次に、白濁したタンパク質リポソームサンプルを清潔なマイクロチューブに移し、チューブを氷上に置きます。5 gのSephadex G-50ビーズを50 mLのバッファー9に浸し、室温で少なくとも2時間静置します。次に、4本の小型スクリーニングカラムに、飽和したビーズが少なくとも4分の3まで満たされるまで充填します。2000 ×gで4分間遠心分離し、レジンから過剰なバッファーを除去します。遠心分離後、カラム内には約2.25 mLのパッキング済みレジンが入っているはずです。プロテアリポソームによる溶出を行うには、レジンを適切に水和させることが不可欠です。次に、プロテアリポソームサンプル 125 µLを各カラムの上部に移し、2000 ×gで4分間遠心分離します。ヨウ化物FLX実験に使用するため、EITを回収します。96ウェルプレートの1つのウェルに小型のFフリース攪拌子を入れ、次いでバッファー9で20 micromolarに調製したVX seven 70を150 microliters加えます。ピペットチップを使用して気泡を取り除きます。その後、プロテアリポソームサンプルを150 microliters加え、総量を300 microlitersにします。96ウェルプレートをスターラーの上に置き、130 rpmで撹拌します。ヨウ化物感受性電極の先端を、撹拌子やウェルの底に触れないように溶液に挿入します。電極信号のトレースを記録するため、サンプリングレート2 Hzのローパスフィルターで信号をフィルタリングし、サンプルが平衡状態に達するまで5分間トレースを記録します。安定したほぼ平坦なベースラインが得られるはずです。次に、pH 7の100 mMマグネシウム ATPストック溶液を3 µL加えます。CFTRチャネルを活性化させるため、サンプルをさらに5分間平衡化させ、新しいベースラインに達するまで待ちます。次に、2 µMのストック溶液を3 µL添加します。これは、CFTR活性によって生じた電気化学的勾配を消失させるためのバリノマイシンです。CFTRを介したヨウ化物イオンフラックス活性による電圧の低下を、少なくとも5分間記録します。次に、コントロールとして、プロテアリポソーム腔内からヨウ化物イオンを放出させるため、10% Triton X 100溶液を3 µLサンプルに添加します。有意なヨウ化物イオンの放出が認められれば、小胞内に封入されたヨウ化物イオンがCFTR活性の制限要因にならなかったことを示します。サンプルの測定後、バッファー9を用いて、ヨウ化カリウムをマイクロモーラーからナノモーラー濃度まで希釈系列で調製します。最も希釈された溶液から始めて、各ヨウ化物濃度における電極の応答をミリボルトで記録し、標準曲線を作成します。野生型 CFTR を用いてヨウ化物 F フラックス活性を測定し、再構成後の活性をアノモル/秒で算出しました。CFTRとVX-770が存在する場合、CFTRを欠くコントロールと比較して、およびVX-770の添加によって、ヨウ化物イオンフラックスは有意に刺激されます。CFTRがサイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ（PKAとして知られる触媒サブユニット）によってリン酸化されると、逆に強力な阻害剤であるCFTR inhibitor-172による前処理は、ヨウ化物イオンフラックス率を低下させます。野生型CFTRのヨウ化物イオンフラックスを増強させるVX-770の能力を、PKAによるリン酸化の有無で試験しました。その結果、VX-770はリン酸化されたCFTRが存在する場合にのみ、相対的なヨウ化物イオンフラックスを増加させました。VX-770の有効性を、Delta 508 CFTRと呼ばれるCFTR変異体を用いて評価したところ、不活性アナログであるV091188はリン酸化されたDelta 508 CFTRの活性を増強させませんでしたが、VX-770は相対的なヨウ化物イオンフラックスを増加させました。この手法に習熟すれば、精製からCFTR活性測定までを標準的な8時間の勤務時間内で完了させることができます。CFTRの精製に約4時間を要し、eFluxアッセイを開始する前に再構成にさらに1時間を要します。この手順に続き、同じCFTRタンパク質の調製物を用いて、TPSアッセイやパラリピッドSにおけるシングルチャネル導電率測定を含む他の手法を実施し、低分子化合物との相互作用をさらに詳細に特性評価することができます。これらの手法を用いることで、嚢胞性線維症の研究者は、CFTRモジュレーター分野における重要な課題、すなわち、そのモジュレーターがCFTRタンパク質と直接相互作用するかどうか、およびそのモジュレーターの作用機序がどのようなものであるかという点について検討することが可能になります。

functional-reconstitution-channel-activity-measurements-purified

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、イオンチャンネルの機能上の単一の点変異の効果を研究する方法を説明します。...

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）を表現する試み...

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の発現および精製サッカロマイセスセレビシエ

嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）、上皮クロライドチャネルは、様々なタンパク質と相互作用し、重要な細胞プロセスを調節することが報告されているそれらの間でCFTR...

PDZ-依存性のCFTRの高分子シグナル伝達複合体のin vitroでの解析で

脂質膜にプロトタイプ電位依存性カリウムチャネルの完全な再構成のための手順が説明されています。再構成されたチャネルは、生化学的アッセイ、電気録音、リガンドのスクリーニングおよび電子結晶学的研究に適している。これらの方法は、他の膜タンパク質の構造的および機能的研究の一般的なアプリケーションを有することができる。...

構造と機能研究のための脂質膜へのKvチャネルの再構築

異種発現および嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）の精製は、重大な課題および嚢胞性線維症のための薬物療法の開発における制限因子である。このプロトコルは、機能的および構造的研究に適しCFTRのミリグラム量の単離のための2つの方法について説明します。...

で表現する嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の精製<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

継承された不整脈は、しばしば、一つ以上のイオンチャネルの表面の配信を変更する突然変異によって引き起こされます。ここでは、TSA-201細胞で発現された組換えイオンチャネルの相対的な合計および細胞表面タンパク質発現の定量化を提供するために、フローサイトメトリーアッセイを適合させます。...

フローサイトメトリーを用いた組換えイオンチャネルの相対的な細胞表面および合計式の決意

この記事では、分光分析用洗剤可溶化 TRPV1 の生化学的な量を取得する具体的な方法について説明します。結合されたプロトコルは、膜制御環境で哺乳類のイオン...

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

このプロトコルは、細胞環境において受容体に結合するアデニンヌクレオチドをリアルタイムで測定する方法を提示する。結合は、トリニトロフェニルヌクレオチド誘導体と非標準的な蛍光アミノ酸で標識されたタンパク質との間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)として測定されます。...

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

このプロトコルは、膜電位の変化を測定することによって電気発生膜タンパク質を研究するための方法を記載しています。このアッセイは、上皮細胞株で内因的に発現する複数のイオンチャネルの機能的読み出しのためのプラットフォームを提供します。...

2つの上皮細胞株における2つの内因性イオンチャネルのハイスループット機能研究のための膜電位の蛍光ベースのアッセイ(英語)

機能部位特異的蛍光法は、タンパク質ドメインの動きをリアルタイムで研究する方法です。天然細胞への適用のためのこの技術の修正は、マウス単離された骨格筋線維における電位依存性Ca2+...

骨格筋興奮性を研究するための天然細胞における機能部位特異的蛍光測定

電気生理学は、イオンチャネル活性を調査するためのゴールドスタンダードです。ただし、光学的方法など、多くの代替アプローチがあります。ここでは、8チャネル(LRRC8)形成陰イオンチャネルを含むロイシンリッチリピートの活性を、サブユニット間フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)ベースの方法を用いてモニターする方法について述べる。...

感作蛍光フェルスター共鳴エネルギー移動(SE-FRET)を使用したロイシンリッチリピート含有8チャネル(LRRC8/VRAC)活性のモニタリング

学ぶCFTRタンパク質の機能的再構成とチャネル活性測定法。精製した野生型および変異型CFTRをプロテオリポソームに再構成し、ヨウ化物選択電極でリアルタイムにイオン輸送をモニタリングすることで、嚢胞性線維症治療薬開発に有用な知見を得る。

精製された野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成とチャネル活性の測定

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