精製された野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成とチャネル活性の測定

本手順の全体的な目的は、再構成系においてCFTRチャネル群の機能を測定し、モジュレーター分子の存在に対するチャネルの応答を調べることです。これは、まず迅速精製法を用いてSf9細胞から野生型または変異型CFTRタンパク質を精製し、界面活性剤溶液中で機能的なCFTRタンパク質を得ることによって達成されます。次のステップでは、精製したタンパク質を、実験者が選択した特定の脂質で構成されるプロテオリポソームに再構成します。

次に、余剰なリポソーム内ヨウ化物を除去することで膜を介したヨウ化物の化学勾配を形成し、CFTRチャネルを通じたイオン移動の駆動力を生成します。最終ステップでは、目的のモジュレーター分子の存在下でチャネルを活性化させ、プロテオリポソームからのヨウ化物放出を開始させます。最終的に、ヨウ化物選択電極を用いて、この再構成系におけるCFTRチャネル機能をリアルタイムでモニタリングします。

本手法により、リン脂質リポソームに再構成した精製CFTR分子集団のクロライドチャネル活性を解析することが可能です。本手法はCFTRチャネルの機能および低分子モジュレーターの影響についての知見を得るために決定されましたが、他の膜タンパク質の機能解析などの他のシステムにも適用できます。本手法を初めて行う際は、使用するシステムに合わせてタンパク質と脂質の比率を最適化すること、機能不全または低機能なタンパク質を使用していないこと、および十分に封止されたベシクル間に十分なヨウ化物勾配を形成させていることを確認してください。

脂質の調製のため、まず非ホウケイ酸ガラス管内で5 mgの卵黄ホスファチジルコリン（egg PC）を、アルゴンガス気流下、室温で20分間乾燥させます。次に、テキストプロトコルに示されている通りに必要なバッファー6の量を算出し、バッファー6を脂質に直接加えます。ガラス管をパーフィルで封止し、室温で2分間ボルテックスして、脂質をバッファー中に懸濁させます。

次に、1 mL シリンジに 25 ゲージの針を取り付け、チューブの壁面に脂質膜が見えなくなるまで、室温で脂質を懸濁させます。脂質の懸濁により、バッファーは白濁します。氷を入れたバス型ソニケーターを用いて、チューブ内の脂質を 22 回目のバーストで超音波処理し、その後チューブを氷上に置いて 1 分間静置します。

このサイクルを3回繰り返します。次に、CFTRタンパク質を脂質に加え、最終容量を1 mLにします。25ゲージの針を用いて、タンパク質と脂質懸濁液を10回混合します。

サンプルを氷上に30分間置き、インキュベート中に5分ごとにチューブを5回旋回させて混合します。使い捨ての界面活性剤結合スピンカラムの底部のタブを折り、2000 ×gで2分間遠心分離します。保存バッファーを除去するため、カラムを5 mLのバッファー7で洗浄し、2000 ×gで4分間遠心分離して洗浄バッファーを溶出させます。

カラムを3回洗浄し、1 mLのタンパク質脂質サンプル全量をカラムレジンの上部に移した後、室温で2分間インキュベートします。室温にて2000 ×gで4分間、カラムを遠心分離します。次に、白濁したタンパク質リポソームサンプルを清潔なマイクロチューブに移し、チューブを氷上に置きます。5 gのSephadex G-50ビーズを50 mLのバッファー9に浸し、室温で少なくとも2時間静置します。

次に、4本の小型スクリーニングカラムに、飽和したビーズが少なくとも4分の3まで満たされるまで充填します。2000 ×gで4分間遠心分離し、レジンから過剰なバッファーを除去します。遠心分離後、カラム内には約2.25 mLのパッキング済みレジンが入っているはずです。

プロテアリポソームによる溶出を行うには、レジンを適切に水和させることが不可欠です。次に、プロテアリポソームサンプル 125 µLを各カラムの上部に移し、2000 ×gで4分間遠心分離します。ヨウ化物FLX実験に使用するため、EITを回収します。

96ウェルプレートの1つのウェルに小型のFフリース攪拌子を入れ、次いでバッファー9で20 micromolarに調製したVX seven 70を150 microliters加えます。ピペットチップを使用して気泡を取り除きます。その後、プロテアリポソームサンプルを150 microliters加え、総量を300 microlitersにします。

96ウェルプレートをスターラーの上に置き、130 rpmで撹拌します。ヨウ化物感受性電極の先端を、撹拌子やウェルの底に触れないように溶液に挿入します。電極信号のトレースを記録するため、サンプリングレート2 Hzのローパスフィルターで信号をフィルタリングし、サンプルが平衡状態に達するまで5分間トレースを記録します。

安定したほぼ平坦なベースラインが得られるはずです。次に、pH 7の100 mMマグネシウム ATPストック溶液を3 µL加えます。CFTRチャネルを活性化させるため、サンプルをさらに5分間平衡化させ、新しいベースラインに達するまで待ちます。

次に、2 µMのストック溶液を3 µL添加します。これは、CFTR活性によって生じた電気化学的勾配を消失させるためのバリノマイシンです。CFTRを介したヨウ化物イオンフラックス活性による電圧の低下を、少なくとも5分間記録します。

次に、コントロールとして、プロテアリポソーム腔内からヨウ化物イオンを放出させるため、10% Triton X 100溶液を3 µLサンプルに添加します。有意なヨウ化物イオンの放出が認められれば、小胞内に封入されたヨウ化物イオンがCFTR活性の制限要因にならなかったことを示します。サンプルの測定後、バッファー9を用いて、ヨウ化カリウムをマイクロモーラーからナノモーラー濃度まで希釈系列で調製します。

最も希釈された溶液から始めて、各ヨウ化物濃度における電極の応答をミリボルトで記録し、標準曲線を作成します。野生型 CFTR を用いてヨウ化物 F フラックス活性を測定し、再構成後の活性をアノモル/秒で算出しました。

CFTRとVX-770が存在する場合、CFTRを欠くコントロールと比較して、およびVX-770の添加によって、ヨウ化物イオンフラックスは有意に刺激されます。CFTRがサイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ（PKAとして知られる触媒サブユニット）によってリン酸化されると、逆に強力な阻害剤であるCFTR inhibitor-172による前処理は、ヨウ化物イオンフラックス率を低下させます。野生型CFTRのヨウ化物イオンフラックスを増強させるVX-770の能力を、PKAによるリン酸化の有無で試験しました。その結果、VX-770はリン酸化されたCFTRが存在する場合にのみ、相対的なヨウ化物イオンフラックスを増加させました。VX-770の有効性を、Delta 508 CFTRと呼ばれるCFTR変異体を用いて評価したところ、不活性アナログであるV091188はリン酸化されたDelta 508 CFTRの活性を増強させませんでしたが、VX-770は相対的なヨウ化物イオンフラックスを増加させました。この手法に習熟すれば、精製からCFTR活性測定までを標準的な8時間の勤務時間内で完了させることができます。CFTRの精製に約4時間を要し、eFluxアッセイを開始する前に再構成にさらに1時間を要します。

この手順に続き、同じCFTRタンパク質の調製物を用いて、TPSアッセイやパラリピッドSにおけるシングルチャネル導電率測定を含む他の手法を実施し、低分子化合物との相互作用をさらに詳細に特性評価することができます。これらの手法を用いることで、嚢胞性線維症の研究者は、CFTRモジュレーター分野における重要な課題、すなわち、そのモジュレーターがCFTRタンパク質と直接相互作用するかどうか、およびそのモジュレーターの作用機序がどのようなものであるかという点について検討することが可能になります。