Name: マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学ぶマウス脊髄における二光子イメージング法で、GFP標識神経前駆細胞とYFP軸索のリアルタイム相互作用を可視化する技術。損傷脊髄の細胞ダイナミクス解析に有用です。

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この作業は、国立衛生研究所 (NIH) の助成金 R01 GM-41514 (M.D.C.へ)、R39 GM-048071 (I.P.へ)、R01 NS-074987 (T.E.L.へ)、全米多発性硬化症協会 (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (C.M.W., T.E.L. and M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (M.L.G.へ) によって部分的に支援されました。 NMSSポスドクフェローシップFG 1960-A-1(JKWへ)、およびジョージE.ヒューイット医学研究財団(MPM)からの資金提供。

注：倫理声明：動物の取り扱いのためのプロトコルは、カリフォルニア、アーバイン、プロトコル＃2010から2943の大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認された。 脊髄の1の除去<ol><li>チャンバーを安楽死で約100％の液体イソフルラン、USPで湿らせた紙タオルを置き、上に乾燥紙タオルを置きます。マウスはイソフルランに触れていないので、乾燥紙タオルの上にチャンバー内にマウスを置き、チャンバーが覆われていることを確認してください。マウスを安楽死されることを保証するために呼吸停止後、少なくとも1分待ってください。 </li><li>マウスを安楽死されていることを確認するために、首の脊髄離断を実行します。これは脊髄を損傷する可能性がある頸椎脱臼を実行しないでください。 </li><li>毛髪を湿らせ、70％エタノールでマウススプレー。 </li><li> 1（C1約頚椎椎弓から脊柱を露出するために、マウスの背面から髪や皮膚を除去するために、鋭いファインはさみを使用してください））仙骨ラミナ4（S4へ。 </li><li> ＃10ブレードを用いてメスを用いて、筋肉および脂肪からそれを分離するために、脊柱の左右に切開を行う。これは、脊髄の除去がより簡単になります。 </li><li>オプション：湾曲したルアー骨鉗子は、追加の肉を離れてすくうために使用することができます。 </li><li>鋸歯状グレーフェ鉗子と脊椎骨の上部を押しながら、脊髄に触れないように注意しながら、C1で露出脊柱に湾曲した面を上にしてチタン湾曲Vannasはさみを挿入します。 </li><li>すべての道を右にVannasはさみ湾曲したチタンをスライドさせ、一つの小さなカットを作る。小さなクランチ音が聞こえとハサミは脊椎骨を切るように感じられるはずです。コー​​ドの左端にあるこのカットを繰り返します。これはハサミでコードを傷つけ危険にさらすようにあまりにも速く行くか、カットの大きすぎ行うことがないように注意してください。 </li><li>シングルラミナは、脊椎の側がカットされたら、ピンセットで持ち上げてすることができるはずです。 R保持し、脊髄脊椎骨を引き戻すために続けて、S4まで、各ラミナのために、この手順をEPEAT。 注：それは移植部位に削減されると、移植部位上記の脊椎骨はおそらく外れます。ただ移植部位の下に開始する手順を続行します。 </li><li>オプション：移植部位への吻側および尾側20ミリメートル〜移植部位がどこにある見て、測定し、カットする上下の椎骨を築く。 注：より一般的には15ミリメートルよりも遠くに移動しない移植したNPCとして必要されることはありませんのNPCを移植する。必要な脊髄の量は、移植された細胞型の実験および移動特性に依存する。移植部位に等距離で吻側および尾側のカットを作ることは撮像中に、より容易に位置するように移植部位を可能にします。 </li><li> ＃11ブレードとメスを用いて慎重に右の神経節をカットし、吻端から始まる脊髄の腹側の左。このW病気より簡単に腹側の椎骨から削除する脊髄を可能にする。 注：迅速に行う（1.7から1.11ステップ）、脊髄が完全に乾くことはありません。しかし、1×PBSで湿ったそれを維持するコードに投与することができる。 </li><li>マウスを反転ので、脊髄を下に向けているマウスをホールドアップ。慎重に閉じられた鋸歯状グレーフェ鉗子を使用して脊髄をはがします。脊髄をニッキングすることなく、慎重に脊髄が単一の完全な部分で持ち上げることができるように、残りの神経節をカット。 </li><li>脊髄はRPMI-1640であることを確認しますと2P顕微鏡への輸送のために氷の上に置きます。 </li></ol>イメージングのための脊髄の調製<ol><li>アガロースで脊髄を埋め込む<ol><li>イメージングの前に氷上で冷却RPMI-1640中で孤立した脊髄を保管してください。 </li><li>アガロース（低ゲル化温度）を秤量し、1×PBS、5mlの5％溶液を調製する。 agに溶解させる15秒間の5％アガロース溶液をマイクロ波起きて、37℃に冷却ソリューションを聞かせて。 </li><li>腹側を上に向けてパラフィルムのシート上に配置することによって脊髄を準備します。 </li><li>ピペット脊髄の腹側の上の5％アガロース溶液の約5 mlである。アガロースは室温に冷却することにより固化するましょう。完全な凝固は約5分かかります。 </li><li> 22ミリメートルの正方形カバースリップに組織接着剤の薄手のコートを適用します。 </li><li>パラフィルム上の腹側を配置、埋め込み脊髄を反転。背側は今まで直面するであろう。背側にカバースリップを接着し、接着剤を固化するRMPIアガロース埋め込み脊髄/カバースリップの準備を沈める。過剰にカミソリの刃を用いてアガロースを固化し削除します。 </li></ol></li><li>顕微鏡ステージ上の脊髄のマウント<ol><li>カバースリップの底にワセリンを適用します。これは、灌流中に準備を安定します。 </li><li>脊髄調製物を置く腹側は25X浸漬目標に向かって上向きにして顕微鏡ステージでよく撮影する。特注のイメージングウェルが約20ミリメートル、50ミリメートル、深長く、そして全体で50ミリメートルである。 </li><li>画像、温めた（37℃）で酸素準備をsuperfusingながら、血清を含まないRPMI-1640培地（95：二酸化炭素、カルボゲン：5酸素）。 <ol><li>水浴中で37℃に前加温メディアおよびメディアボトルにチューブを挿入することにより、チューブポンプに接続する。 </li><li>チャンバーへのチューブの接続部で37℃、加熱装置における媒体温度を保持します。ウェルで3 ml /分を通してSuperfuse媒体はチューブポンプ（ 図1B）に接続されたチューブを使用。 </li></ol></li></ol></li></ol>腹側脊髄の3 2Pイメージング<ol><li>顕微鏡のセットアップ<ol><li> 900nmのチューニングサファイアレーザー：カメレオンウルトラチタンを使用してはThy1-のeYFP脊髄から画像を取得する。レーザパワーを減衰させる&lt;5％の試料は、最小限の毒性16を確保する。安定した画像形成を確実にするために、組織ドリフト及び細胞の損傷を防止するために、単一のインライン液ヒーターを用いて一定の37℃での酸素灌流RPMI-1640を灌流することによって温度を維持する。 </li><li>のeGFPとのeYFP蛍光信号を分離するために、意図的に視認性を高めるために緑色発光を分割する3つのチャネルに2P発光を分離するために直列に520 nmの単一エッジダイクロと560nmの単一エッジダイクロイックビームスプリッタを配置する。 注：これらのチャネルは、青緑色（発光&lt;520 nm）を、（520〜560 nm）の黄緑色、および赤色（発光&gt; 560nmの）と呼ばれる。光電子増倍管は、各チャネルに放出された光を検出する。 </li></ol></li><li>関心の撮像領域の検索<ol><li>接眼レンズと明視野光源を用いて、基準点を設定するために、脊髄の腹側縁に浸漬対物レンズの焦点を合わせる。 </li><li>必ず周囲の光源がオフとSWであることを確認してくださいレーザシャッタを開くことによって2P励起かゆみ。 </li><li>利用可能な場合は関心のある分野のための組織を検索する際に、より低い解像度の設定、デジタルズームのない高いボリューム、および最終的な画像を取得するときよりも高いスキャンレートを使用しています。関心領域のための組織を検索このシステムの典型的な設定は次のとおりです。解像度：256ピクセル。ボリューム：X = 600ミクロン、Y =600μmで、Z = 0〜300程度である。 </li><li>脊髄の腹側縁の近くのEYFP軸索を観察します。コラーゲン（青）からの第2高調波信号は、脊髄組織のエッジで最も明るくなります。ちょうどコラーゲンからの第2高調波信号に背とのeYFP信号が黄緑色のチャンネルで可視化されたEYFP軸索の位置を確認します。 </li><li>脊髄準備14の長手方向の中央に移植部位の位置を確認します。のeGFP-NPC移植後のマウスの1日の場合は、深部組織へのz平面内のビーム経路を中心に移植部位を見つけます。移植サイトのWiLL動物間で若干異なるが、一般的には腹側の縁から〜200μmの位置しています。 1日目移植後後のマウスにおける腹側と横方向縁部に近い、白質路におけるEGFP-のNPCのクラスターを観察します。 </li></ol></li><li>最終的な画像を取得する<ol><li> 512ピクセルの画像の解像度を取得。ボリューム：X = 270ミクロン、Y = 212ミクロン、及びSlidebook 6ソフトウェアを使用して、Z =100μmである。 2.5ミクロン単位でシーケンシャル焦点面を取得することで、Zスタックをコンパイルします。 </li><li>脊髄内の任意の移行オブジェクトの迅速な定量化を確実にするためにオフセット適切なインターレースとの双方向スキャンを実行します。脊髄内の細胞の速度を決定するのに理想的な取得フレームレートは約1フレーム/秒であることを確認してください。 注：イメージング設定は、取得フレームレート、撮像分解能と撮像ボリュームとして個々のユーザの好みに変更することができる。より大きな画像ボリュームは、一般的にGIVで取得するために時間がかかります解像度EN。 </li><li>そのようなビットプレーンIMARIS 7.7などの画像解析ソフトウェアを使用して、分析する作物、滑らか、かつ疑似Slidebook画像ファイル。 SlidebookとIMARISで自動化されたプロセスを使用して、連続した画像化ボリュームをコーミングすることにより、最終的なタイムラプスビデオを制作。 </li></ol></li></ol>

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無傷組織のリアルタイム2Pイメージングは​​脱髄マウスの脊髄に移植後NPC動態との相互作用を調査する必要がある。生体2Pイメージングは、一般的に生きているマウスにおける脊髄の背側の携帯動力学を決定するために使用され、疾患17-19脱髄に背脱髄を研究するために使用されてきた。移植されたNPCは、2P顕微鏡を使用してその場で画像の深すぎる位置する腹側白質への移行しかし、 エクスビボで準備が必要である。この方法論は、損傷を受けたと非損傷した脊髄6に移植したNPCの運動性と再ミエリン動態を決定するために、私たちの研究室で使用されてきた。 エクスビボ準備が腹側6,20からだけでなく縦方向にも横方向に脊髄のスキャンを有効に。これは、tにおける細胞運動（速度及び方向）の違いや相互作用の分析を可能にする移植部位に隣接し、かつ移植部位6からの様々な距離でransplant部位。我々は最初に、脊髄の腹側のeGFP-NPCを移植した画像にこの製剤を考案し、一方、それは、画像を形成するために使用することができる任意の蛍光標識又は腹側、背側...

neuroadaptedマウス肝炎ウイルス（MHV）による実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）、および頭蓋内感染を含む脱髄のマウスモデルは、疾患に関連した分子経路と細胞の相互作用を研究するための優れたツールである。彼らはにつながったとFDAの有効性は、主に自己免疫および炎症1の停止をターゲットに、医薬品の治療法を承認しサポートしてきました。内因性の再ミエリン化が失敗したしかし、一度、現在承認されている治療法は効果的に中枢神経系の脱髄病変を修復しないでください。したがって、疾患のこの段階で修復に焦点を当てた治療は、慢性症状および生活の質の向上の軽減のために重要である。最近では、神経前駆細胞（NPCの）は、炎症および脱髄の領域をターゲットとする潜在的な再生治療法として最前線になってきた。いくつかの研究がendogenoを誘導するのNPCの能力を強調している私たちは、再ミエリン化及び再ミエリン2-8に直接参加。 NPCは、直接再ミエリン化に関与しているので、移植後の内因性の細胞とそれらの速度および相互作用を理解することが不可欠である。移植後、NPCはその後吻側および尾側移植部位5,9に比べて、白質損傷の領域に腹移行する。移行の動力学は、環境信号に応答して異なる。非損傷した脊髄に移植されたNPCは、損傷した脊髄6に移植したNPCよりも大きな速度を持っている。遊走期間の後、無傷の脊髄6に損傷した脊髄相対的に高いレートで、NPCは広範囲に増殖移した。最後に、NPCはの大半はオリゴデンドロサイトに分化し、直接再ミエリン化の4,6,9を開始する。 脱髄病変は複雑であり、種々の段階での細胞の多様な集団を含むことができctivati​​on。例えば、活性多発性硬化症（MS）、病変は、活性化T細胞、M1ミクログリア及びM1マクロファージの有意な集団を含んでもよいが、慢性の無音MS病変は、いくつかの炎症性細胞が10-13との反応性星状細胞から主に構成されてもよい。そのためエフェクター細胞の多様性、脱髄のマウスモデルにおける二光子（2P）イメージングは​​、病変内のローカルな細胞間相互作用を理解するための非常に便利なツールです。 MSと多くの広く使用MS研究モデルでは、病変の大部分が起因する病変の深さおよび脊髄の高い脂質含量に脊髄、生体内の2Pのイメージングにアクセスできない領域の腹側に配置されている。腹側脊髄に沿って病変内のこれらの問題及び試験細胞-細胞相互作用を回避するために、我々は、ex vivoでの2P撮影準備6簡単に開発した。 この研究は示した以前の方法パブリケーションを、フォローアップMHV誘発性脱髄14のJHMV株後のマウスの脊髄に強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）発現のNPCを移植するための手順。ファイブ週齢のマウスはJHMVに感染させ、14日目、感染後に胸部レベル9でのeGFP-のNPCを移植している。ここで紹介するプロトコルは、ex vivoでアガロース準備をし、脊髄を抽出​​し、強化黄色蛍光タンパク質（EYFP）発現性軸索の画像、移植のeGFP-NPCの相互作用する方法についての詳細な手順を提供しています。神経細胞特異的はThy1プロモーター下のeYFPを発現するマウスは、この手順15で使用した。唯一の軸索のいくつかは、個々の軸索を画像化するためには有用なもの、のeYFPを発現する。ここでは、7日後に移植に除去脊髄を表示。しかし、脊髄移植後の任意の時点で抽出することができる。我々は、損傷軸索でのNPCの相互作用を示しているが、我々のプロトコルは、遺伝子の蛍光マーカーと組み合わせて使用​​することができるマウス脊髄全体に生じる細胞相互作用の多くを調査するために、他の種類の細胞。

<table><tbody><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Piramal Critical Care, Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ファインハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14060-09</td><td>シャープ</td></tr><tr><td>メスブレード #10</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>メスハンドル</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロンジャー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Graefe鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>バンナスはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15615-08</td><td></td></tr><tr><td>メスの刃 #11</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ギブコ</td><td>12-115F</td><td></td></tr><tr><td>アガロース、低ゲル化温度</td><td>シグマ</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond (ティッシュ接着剤)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>22 mm 正方形カバー スリップ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>12-547</td><td></td></tr><tr><td>25X ディッピング対物レンズ、1.1 NA</td><td>ニコン</td><td>CFI Apo LWD 25XW</td><td></td></tr><tr><td>シングル インライン ソリューション ヒーター</td><td>ワーナー インスツルメンツ</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>520 nm シングルエッジ ダイクロイック ビーム スプリッター</td><td>セムロック</td><td>FF520-Di02-25x36</td><td>Brightline</td></tr><tr><td>560 nm シングルエッジダイクロイックビームスプリッター</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td>Brightline</td></tr><tr><td>光電子増倍管</td><td>浜松</td><td>R928</td><td></td></tr><tr><td>C/L 可変速チューブポンプ</td><td>Masterflex</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td>デジタル温度計</td><td>Comar Instruments</td><td>3501</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra Ti:Sapphire レーザー&nbsp;</td><td>Coherent</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6 software</td><td>3i</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 7.7 software</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

二光子(2P)顕微鏡法は、生きた無傷の組織の深部にある細胞のダイナミクスと相互作用を明らかにするために利用されます。ここでは、マウスの脊髄における生細胞イメージングの方法を紹介します。この技術は、神経炎症性脱髄障害を受けている脊髄への移植後の神経前駆細胞(NPC)のダイナミクスを解析するのに特に適しています。NPCは軸索損傷部位に移動し、増殖し、オリゴデンドロサイトに分化し、直接再髄鞘形成に参加します。したがって、NPCは、慢性脱髄疾患を改善するための有望な治療法です。移植されたNPCは脊髄の腹側の損傷領域に移動するため、従来の生体内2Pイメージングは不可能であり、以前は組織化学的染色アプローチを使用して静的相互作用に関する情報しか得られませんでした。この方法は、腹側脊髄に移植されたNPCを画像化するために作成されましたが、脊髄全体にわたる移植細胞および内因性細胞の多数の研究に適用できます。 この記事では、黄色蛍光タンパク質発現軸索と緑色蛍光タンパク質発現移植NPCを増強した脊髄の調製とイメージングを示します。

<html>外植脊髄イメージングプロトコルは、脊髄内の任意の蛍光を可視化するために使用することができるが、我々の代表的な結果は、軸索のeYFPでのeGFP-NPCの相互作用を実証する。まず、 図1Aに埋め込 ​​まれた腹側脊髄の調製を示す。次に、2P顕微鏡のセットアップおよび図1Bにおける主要構成要素を示す。 図2は、腹側脊髄内の単一zスタックにおけるEGFPとのeYFPの蛍光を示しています。連続したZ-スタックの取得は無傷組織内のリアルタイム細胞の動態を解析するために時間経過動画を生成するためにコンパイルすることができます。プロトコールに記載されているように、520nmの単一エッジダイクロと560nmの単一エッジダイクロイックビームスプリッタを使用して、のeGFPとのeYFP信号を分離することができる。個々のチャネルは、イメージングソフトウェアを使用して、緑色と黄色の疑似カラーすることができる。 80 /...

マウス脊髄を撮像するための新規のex vivo調製。このプロトコルは、脊髄全体生細胞の相互作用の二光子イメージングを可能にする。

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

本実験の全体的な目的は、マウスの脊髄において、蛍光標識した移植済みの神経前駆細胞（NPC）と蛍光標識された軸索との相互作用をリアルタイムでイメージングすることです。これは、NPCを移植したマウスから脊髄を慎重に摘出し、5%arosに包埋してカバーガラスに固定することで達成されます。脊髄の向きを変えることで、脊髄の任意の領域における蛍光を観察することが可能です。第2ステップでは、脊髄標本を2光子イメージングステージ上に配置し、温暖で酸素飽和させたRPMI培地を灌流しながら、生存しているNPCのイメージングを最大10時間まで行います。YFPとGFPの放出光を分離するために、適切なシングルエッジダイクロイックビームスプリッターを使用します。最終的に、2光子イメージングによって、損傷した脊髄内におけるGFP発現NPCとYFP発現軸索との相互作用をリアルタイムで可視化することが可能になります。この手法は、損傷した軸索を移植したNPCが再髄鞘化させるために必要な分子および細胞シグナルの手がかりは何か、また、これらの再髄鞘化イベントのキネティクスはどうなっているかなど、神経変性分野における重要な疑問への回答に役立ちます。背側脊髄のイメージングにしか利用できない経皮的2光子イメージングなどの既存手法に対する本手法の主な利点は、脊髄の腹側領域深部まで遊走した移植NPCのイメージングが可能である点です。脊髄切断により安楽死が確認された後、マウスに70% ethanolを塗布し、鋭利で細い鋏を用いて動物の背中から毛と皮膚を取り除き、頸椎1番（C1）付近から仙骨4番（S4）までの脊柱を露出させます。次に、10番のメスを用いて、脊柱の左右を切開して周囲の筋肉および脂肪組織から分離し、脊柱の周囲および上部にある余剰組織を取り除きます。これにより、椎骨をより容易に除去できるようになります。その後、鋸歯付きのグレー鉗子で脊椎の上端を保持しながら、C1の露出した脊柱に、曲面を上にしてチタン製曲面ヴァン鋏を挿入します。この際、脊髄に触れないよう注意してください。ハサミを右端までスライドさせ、小さく1回切断します。ハサミが椎骨を切断する際、小さな砕けるような音が聞こえ、感触があるはずです。脊髄の左端でも同様に切断を繰り返します。この際、作業を急ぎすぎたり、切断範囲を広げすぎたりすると、脊髄を損傷させるリスクがあるため注意してください。椎骨の側面を切断すると、単一の椎弓板を鉗子で持ち上げることができます。 S4に到達するまで、各椎弓板に対して左右の切断を繰り返します。その間、脊髄を保持して後方に引き寄せ続けます。脊髄を移植部位まで切断すると、移植部位より上方の椎骨が外れる場合があります。椎骨をS4まで切断した後、椎骨を寝かせて移植部位を視覚的に確認しやすくし、移植部位から吻側および尾側に約20 mmの位置で切断します。次に、11番メスを用いて、脊髄腹側の右側および左側にある神経節を、吻側端から慎重に切断します。次に、動物を反転させて保持し、脊髄が下を向くようにして、閉じた鋸歯状の組織鉗子を用いて、尾側から脊髄を慎重に剥離します。その後、脊髄を傷つけないように注意しながら、残りの神経節を慎重に切断して脊髄を単一の完全な状態で取り出し、イメージングの準備として、氷上の培地の中に脊髄を配置します。神経組織をパラフィルムの上に、腹側を上にして転送します。次に、調製したばかりの37 °C、5%アガロ溶液を約5 mL、脊髄の上にピペットで滴下し、室温で凝固させます。約5分後、22 mm四方のカバーガラスに組織接着剤を薄く塗布し、埋込済みの脊髄を腹側を下にして新しいペルフィル上に反転させて置きます。露出した背側にカバーガラスを接着させ、調製物全体を新鮮な培地に浸し、接着剤を凝固させます。次に、カミソリを使用して、凝固して過剰になったアガロースを除去します。続いて、チューブポンプに接続したチューブを、37 °Cに予熱したウォーターバス内の培地ボトルに挿入します。顕微鏡ステージ上の特製イメージングウェルを通じて、加温した培地を3 mL/minの速度で供給します。次に、脊髄標本をウェルに入れ、腹側を25倍浸漬対物レンズに向けて上に向けます。2photon顕微鏡を用いて脊髄腹側をイメージングするには、波長900 nmに調整したウルトラチタニウムサファイアレーザーを使用し、光毒性を最小限に抑えるため、試料位置でのレーザー出力を5%未満に減衰させます。その後、接眼レンズと明視野光源を用いて、浸漬対物レンズを脊髄の腹側端に合わせます。リファレンスポイントを設定するには、周囲の光源がオフになっていることを確認してください。次に、レーザーシャッターを開き、利用可能な場合は2つのフォトニックサイテーションを切り替えます。組織内の関心領域を探索する際は、最終的な画像を取得する時よりも、デジタルズームを使用せず、解像度を低く、ボリュームを大きくし、スキャンレートを高く設定して使用してください。細胞を見つけるには、まず組織の端の移植部位を明視野照明下で観察し、その後、蛍光観察に切り替えるのが最適です。その後、低解像度で広いXおよびY視野を使用することで、組織の深部へとフォーカスを移動させながら、広範囲を迅速に観察できます。脊髄の腹側端付近にあるEYFP陽性軸索を観察してください。ここで青色で観察されるコラーゲンの第2高調波信号は、脊髄組織の縁で最も明るくなります。次に、適切な画像キャプチャソフトウェアを使用して、2.5 micron刻みの連続的な焦点面で最終的な高解像度画像を取得し、Zスタックを構築します。この表示では、GFP陽性のNPCは青色に、損傷したYFP陽性の軸索は黄色に観察されます（擬似カラーリングは後で編集ソフトウェアを用いて行えます）。その後、適切なインターレイ・オフセットを用いて双方向スキャンを行い、脊髄内で移動する物体の迅速な定量化を可能にします。その際、脊髄内の細胞速度を決定するための最適な取得フレームレートが、約1.7 frames per secondに設定されていることを確認してください。最後に、適切なソフトウェアを用いて、クロップ、スムージング、および擬似カラー処理を行い、自動処理を用いて連続的なイメージングボリュームを統合して、最終的なタイムラプスビデオを作成します。この摘出した脊髄のイメージングプロトコルは、脊髄内のあらゆる蛍光の可視化に使用できますが、これらの画像は、腹側脊髄内の単一のZスタックにおけるEGFP発現神経前駆細胞とEYFP発現軸索との代表的な相互作用を示しています。連続的なZスタックの取得結果をコンパイルすることで、無傷の組織内におけるリアルタイムの細胞ダイナミクスを分析するためのタイムラプスビデオを作成できます。実際に、520 nmのシングルエッジダイクロイックミラーと560 nmのシングルエッジダイクロイックビームスプリッターを使用することで、EGFPとEYFPの信号を分離でき、ここで示したようにイメージングソフトウェアを用いて各チャンネルを緑色と黄色に擬似着色することが可能です。この手順を行う際は、脊髄をマウスから取り出す際に、神経組織を過度に伸展させたり、圧縮したり、あるいは誤って切断したりしないよう十分に注意することが重要です。本手法を用いれば、蛍光標識された細胞や軸索のあらゆる組み合わせをリアルタイムでイメージングでき、さまざまな薬剤処理や条件下における移動または再髄鞘化のキネティクスなど、さらなる疑問を解明することが可能です。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

マウス脊柱を安定させ、繰り返し実行するために低侵襲プロトコル...

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

出典: Maruoka, H., et.al. 覚醒マウスにおけるミクログリアダイナミクスとニューロン活動の同時イメージング J. Vis. Exp.

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

生きている動物のTime-lapse imaging...

二光子<em&gt; in vivoで</em&gt;間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング

このビデオでは、我々は生きたマウスの背側脊髄の上に慢性光学イメージング室を移植するための手順を説明します。室、外科的手順、および慢性のイメージングを見直し、実証されている。...

縦断のために脊髄商工を移植するための手順インビボイメージング

二光子生体内イメージングは、背柱外傷性脊髄挫傷を負った骨髄キメラ動物の天然組織環境における脊髄の異なる細胞タイプ間の相互作用を調査するために使用することができます。...

マウス背側列のクラッシュ損傷におけるミクログリアおよびマクロファージと軸索の相互作用の生体内イメージング

生体内でイメージ投射 Sprague-dawley ラットの霊長類脊髄損傷脊髄血管変化を追跡する 2...

In Vivoデュオ カラー霊長類脊髄損傷血管動態のイメージング手法

このプロトコルは、マウスの脊髄にガラス窓を移植し、生体内顕微鏡による視覚化を容易にすることを説明する。...

マウスにおける線込みおよび脊髄窓移植

この方法は、生きているマウスの海馬への光学的アクセスを可能にする慢性的な調製を記述する。この調製は、数週間の期間にわたって神経構造可塑性および活性誘発細胞可塑性の縦方向光学イメージングを行うために使用することができる。...

生きたマウスにおける後部海馬CA1の縦方向2光子イメージング

誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、特定の化学結合の固有の振動に基づいて生体分子の標識のないイメージングを可能にします。このプロトコルでは、生きたマウスの脊髄の細胞構造を視覚化するために、統合されたSRSおよび2光子蛍光顕微鏡の機器セットアップが記載されている。...

インビボ で2光子蛍光と誘導ラマン散乱顕微鏡を組み合わせた生体組織のイメージング

ここでは、覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動を同時にイメージングするためのアデノ随伴ウイルス注入と頭蓋窓移植を組み合わせたプロトコルについて説明します。...

学ぶマウス脊髄における二光子イメージング法で、GFP標識神経前駆細胞とYFP軸索のリアルタイム相互作用を可視化する技術。損傷脊髄の細胞ダイナミクス解析に有用です。

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

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