別のマウス皮膚の領域から細胞蛍光分析のための単一細胞懸濁液の調製

この手順の全体的な目標は、マウスの皮膚から単一細胞懸濁液を調製し、細胞蛍光分析を通じて常在免疫細胞の異なる集団を同定し、皮膚常在免疫細胞の異なる集団を同定し、単離することです。この技術を使用すると、研究者は、目的の免疫細胞表面メーカーに損傷を与えることなく、マウスの皮膚のさまざまな領域からのサンプルを簡単に消化できます。

マウスの耳から皮膚サンプルを採取するには、耳の無毛部分を切り取り、鉗子を使用して臓器の背側と腹側を引き離します。次に、内耳をそっとこすり、残っている軟骨を取り除きます。チャンクの皮膚サンプルを取得するには、バリカンで動物のすべての毛を剃り、続いて脱毛ローションを塗布します。

数分後、ローションをきれいに取り除き、マウスの背中の中央に垂直に切り込みを入れ、マウスの体の周りの剃った領域の境界に沿って切開を続けます。鉗子を使用して皮膚を所定の位置に保持し、手術用ハサミまたはメスの閉じた丸いエッジの先端でサンプルを分離し、腹膜と背中の筋肉から皮膚を優しく分離します。その後、氷冷PBS10mlを入れた100mm細胞培養プレートに皮膚を沈め、鉗子を用いて皮下脂肪を掻き落とします。

尾の皮膚サンプルを取得するには、尾を切り取り、手術用ハサミを使用して、尾の付け根から先端まで垂直に切り込みを入れます。鉗子を使用して、尾の付け根にある切開部の端をつかみ、次に別の鉗子で尾の本体をつかみ、皮膚を先端に向かってそっと引っ張ります。皮膚サンプルをやさしくこすり落とすことにより、余分な脂肪を取り除きます。

マウスの足を切断し、フットパッドから皮膚サンプルを採取するために、手術用ハサミを使用して足首から指の先頭まで足の皮膚を縦方向に切断し、髪の毛を切らないように注意します。次に、鉗子で足首の骨をつかみ、もう一方の手で皮膚をつかみ、手袋を外すときのように皮膚を指に向かって引っ張ります。皮膚細胞を標識するには、各サンプルについて、2ミリリットルの作りたての消化カクテルが入った35ミリメートルのシャーレに組織を移します。

ハサミを使用してサンプルを細かく刻み、インキュベーション期間中に1〜2回穏やかに振って、組織片を摂氏37度で90分間インキュベートします。次に、消化した皮膚組織を、1皿あたり1ミリリットルのRPMI 1640を含む66ミリメートルのシャーレにある70ミクロンのセルストレーナーに注ぎます。ストレーナーを5ミリリットルの新鮮な媒体で洗い、シリンジプランジャーを使用してサンプルをストレーナーのメッシュに絞ります。

プランジャー、ディッシュ、ストレーナーを20ミリリットルの新鮮な培地ですすぎ、組織スラリーを50ミリリットルの円錐管に移します。すべてのサンプルを処理した後、細胞を遠心分離し、ペレットを100マイクロリットルのサンプルあたり100マイクロリットルに再懸濁し、1ミリリットルあたり2マイクログラムの抗CD16、CD32ブロッキング抗体、PBSおよび1%FBSに添加します。摂氏4度で15分後、表に示されているように、100マイクロリットルの抗体を適切なサンプルに4°Cで30分間加え、光から保護します。

インキュベーションの終わりに、細胞を1ミリリットルのPBSとFBSで洗浄し、ペレットを300マイクロリットルのFBS PBSに再懸濁します。次に、光から保護された摂氏4度のDAPIで10分間、DAPIの1ミリリットルあたり2マイクログラムで細胞を標識します。白血球を単離するには、まずDAPI陽性集団をゲートして死細胞を排除します。

次に、前方散布図幅プロットにより前方散布区内のシングレットを選択し、目的の白血球のサイズと粒度に基づいて細胞をゲートします。次に、CD45陽性細胞を選択し、次に各サンプルについて、CD11CおよびMHCクラス2の発現によって皮膚樹状細胞集団を同定します。マクロファージはCD64およびF480の発現により、B細胞はCD19およびMHCクラス2の発現により、T細胞はCD4またはCD8の発現により同定します。

今示したように、皮膚免疫細胞の単離は、皮膚のすべての領域から50%以上の生存細胞の集団をもたらし、そのうち5,000〜15,000は1平方センチメートルあたりCD45陽性です。示されているように、マウスの皮膚の1平方センチメートルから下流分析のために十分な数の樹状細胞、マクロファージ、B細胞、およびT細胞も得ることができます。このビデオを見た後、炎症を起こしていない皮膚組織を消化する方法と、ファックス分析のために白血球を分離する方法を十分に理解しているはずです。